胡子琪 吳 旭 姚朵朵 李燕秀 孫志夫 王 璽 張須龍

（首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系，北京 100069）

下呼吸道感染是導致全球全年齡段人類發(fā)病和死亡的主要原因，嚴重威脅人類健康［1］。在呼吸道感染病原體中，流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等RNA病毒感染后易繼發(fā)細菌感染，引起重癥肺炎和肺臟免疫損傷，是呼吸道病毒感染流行期間導致死亡的主要原因［2-4］。繼發(fā)細菌感染引起的免疫病理損傷是重癥肺炎的重要原因，但其中的免疫致病機制尚不完全清楚。

由天然免疫細胞和天然免疫分子介導的天然免疫應答是宿主抵御病原體感染的第一道防線［5］。補體作為機體重要的天然免疫分子，可通過經典途徑、凝集素途徑和旁路途徑活化，在天然免疫和適應性免疫應答中發(fā)揮不可或缺的作用，可通過直接裂解、調理作用、促進吞噬細胞浸潤和放大T/B細胞反應等介導抗感染免疫應答，其中補體C3是補體活化的核心，可通過酶解形成多種免疫分子調節(jié)免疫應答［6］。甘露糖結合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）、ficolin和collectin-10/11是啟動凝集素途徑的關鍵模式識別分子，在抗感染免疫應答早期發(fā)揮關鍵作用［7-9］。其中ficolin是由C端球形糖類識別功能區(qū)、中間α卷曲螺旋區(qū)和N端膠原樣區(qū)組成，人類體內 存 在M-ficolin、L-ficolin和H-ficolin三 種類型，小鼠體內存在ficolin A和ficolin B兩種類型［10］。Ficolin具有肺臟持續(xù)高表達、血清濃度遠高于MBL、可識別多種配體等特點，在抗呼吸道感染中發(fā)揮重要作用，且ficolin缺失易導致肺臟反復感染［11］。Ficolin在病毒繼發(fā)細菌感染中的作用及機制尚未明確，深入探討其作用有助于闡明其致病機制并尋找潛在治療靶點。

RNA病毒感染靶細胞后，會在復制和轉錄時形成雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA），它是重要的病原體相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），可通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）激活天然免疫應答介導炎癥反應［12］。Poly（I：C）是一種人工合成的dsRNA類似物，廣泛用于模擬RNA病毒感染的各類實驗研究［13-14］。本研究通過革蘭氏陰性菌來源的內毒素LPS刺激poly（I：C）預處理的小鼠，模擬RNA病毒繼發(fā)細菌感染的急性加重模型，并探討ficolin在RNA病毒繼發(fā)細菌感染急性加重肺損傷的作用及機制，為繼發(fā)細菌感染的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠和ficolin基因敲除小鼠由首都醫(yī)科大學和蘇州賽業(yè)公司提供，并經首都醫(yī)科大學動物部倫理管理委員會批準（批準號：AEEI-2018-090）。

1.1.2 實驗細胞RAW264.7細胞系購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3 試劑和儀器Poly（I：C）和LPS購于美國Sigma-Aldrich公司；抗C3單克隆抗體購于英國Abcam公司；抗β-actin單克隆抗體、抗tubulin單克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體購于美國CST公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購于美國Thermo Fisher公司；膠原酶Ⅰ購于美國Sigma公司；BB515-rat anti-mouse CD45、BUV737-rat anti-mouse CD11b、BUV395-rat anti-mouse Ly6G、BV421-rat anti-mouse F4/80、BV650-rat anti-mouse MHCⅡ、AF700-rat antimouse Ly6C、FVS510染料、CD16/CD32封閉液、FACSymphony流式細胞儀、FlowJo V10流式分析軟件購于美國BD公司；全自動切片掃描儀Pannoramic Scan購于匈牙利3DHIESTECH公司；AI600超靈敏化學發(fā)光成像儀購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激小鼠模型的建立6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠和ficolin基因敲除小鼠隨機分為PBS組、poly（I：C）組、LPS組以及poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激組。通過異氟烷或乙醚麻醉，聯(lián)合刺激組小鼠于造模第1天和第2天分別滴鼻給予25μl含50μg的poly（I：C），于造模第3天滴鼻給予25μl含50μg的LPS；poly（I：C）組和LPS組小鼠僅滴鼻給予等量poly（I：C）或LPS，其余進行等量PBS處理；PBS組小鼠于造模3 d滴鼻給予等量的PBS。在造模第5天處死小鼠取其肺臟組織進行檢測。

1.2.2 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激RAW264.7細胞模型的建立將RAW264.7細胞于DMEM完全培養(yǎng)基中37℃、5%CO2培養(yǎng)至對數(shù)期，在12孔板中以1×106個/孔的密度接種，分為PBS組、poly（I：C）組、LPS組以及poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激組，每組3個復孔；50μg/ml的poly（I：C）或等量PBS處理18 h后，聯(lián)合50 ng/ml LPS或等量PBS刺激6 h，收集RAW264.7細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blot檢測C3蛋白的表達取各刺激或對照組小鼠肺臟組織進行剪碎研磨，以及收取各處理或對照組RAW264.7細胞樣本，采用RIPA蛋白裂解法提取組織或細胞中的總蛋白，冰浴30 min后，12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，并稀釋所有蛋白樣本為相同濃度，99℃加熱5 min蛋白質變性后，進行SDSPAGE電泳分離，然后轉膜至甲醇預浸泡過的PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h后加入相應一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入相應的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，使用ECL顯色液于AI600超靈敏化學發(fā)光成像儀進行掃描。

1.2.4 肺臟組織HE染色將各刺激或對照組小鼠肺臟組織置入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片用于常規(guī)HE染色。石蠟切片烘烤40 min，常規(guī)脫蠟水化，蘇木精復染4 min，鹽酸乙醇分化2 s，返藍30～40 min，伊紅染色2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后，使用病理切片掃描儀進行圖像收集。

1.2.5 中性粒細胞和巨噬細胞流式檢測取各刺激或對照組小鼠肺臟組織剪碎后于消化液（每5 ml消化液由4.25 ml DMEM培養(yǎng)基、500μl膠原酶Ⅰ、250μl胎牛血清組成）中37℃消化1 h，于70μm細胞篩網上輕柔研磨過濾得到肺組織細胞懸液，1 500 r/min、4℃離心10 min，加入紅細胞裂解液室溫避光5 min，PBS稀釋后再次通過70μm細胞篩網過濾，PBS洗滌2次，加入FVS510染料，室溫避光孵育15 min，洗滌1次，依次加入封閉液、BB515-rat anti-mouse CD45、BUV737-rat anti-mouse CD11b、BUV395-rat anti-mouse Ly6G、BV421-rat anti-mouse F4/80、BV650-rat anti-mouse MHCⅡ和AF700-rat anti-mouse Ly6C熒光標記流式抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次后于流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo V10軟件分析每組小鼠中性粒細胞、肺泡巨噬細胞和間質巨噬細胞的比例。

1.3 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 8.0軟件。兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LPS加重poly（I：C）預刺激的小鼠肺臟損傷如圖1A所示，在第1、2天連續(xù)用50μg poly（I：C）預刺激，在第3天用50μg LPS滴鼻刺激建立小鼠聯(lián)合刺激模型。相較于未刺激和單獨刺激對照組，聯(lián)合刺激組小鼠駝背姿勢、豎毛現(xiàn)象更明顯，呼吸加快以及活動度更低。在刺激第5天小鼠肺組織病理表現(xiàn)為：PBS組小鼠肺泡結構正常，無炎癥細胞浸潤和出血，poly（I：C）或LPS單獨刺激組小鼠肺組織支氣管腔和血管腔周圍可見少量炎癥細胞浸潤，腔內有較少出血，肺泡少量融合；而在聯(lián)合刺激組中，可見肺泡融合和彌漫性損傷，大量炎癥細胞浸潤于支氣管和血管周圍，支氣管腔內充血滲出，病理損傷加重（圖1B）。上述結果表明LPS加重poly（I：C）預刺激的小鼠肺臟損傷，模型建立成功。

2.2 中性粒細胞和巨噬細胞招募參與LPS誘導的poly（I：C）預刺激的急性肺臟損傷取肺組織單個細胞懸液，采用流式細胞術檢測各處理組和對照組中性粒細胞、間質巨噬細胞和肺泡巨噬細胞的比例變化。結果顯示，相較于PBS組，poly（I：C）、LPS單獨刺激組和聯(lián)合刺激組第5天，小鼠肺臟中性粒細胞（CD45+CD11b+Ly6G+）比例分別由2.4%升高至11.1%、15.3%和19.8%（圖2A），間質巨噬細胞（CD45+CD11b+Ly6G-F4/80+MHCⅡ+Ly6C+）比例分別由3.0%升高至13.2%、22.8%和30.1%（圖2B），而肺泡巨噬細胞（CD45+CD11b-Ly6G-F4/80+）比例由原來的11.8%分別降低至6.4%、4.0%和3.5%（圖2C）。上述結果表明，poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激誘導大量中性粒細胞和間質巨噬細胞浸潤為主，并存在肺泡巨噬細胞耗竭，提示中性粒細胞和巨噬細胞大量招募參與poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的急性肺臟損傷。

2.3 Poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激誘導補體C3活化通過Western blot檢測小鼠肺臟組織和巨噬細胞系中補體C3蛋白的酶解變化。體內實驗結果顯示，相較于PBS組，聯(lián)合刺激組小鼠肺臟總C3蛋白表達增加，并且C3活化裂解后產生的α鏈、iC3b片段和C3c片段也明顯增多（圖3A）。體外實驗對RAW264.7細胞系進行poly（I：C）和/或LPS刺激。相較于PBS組，聯(lián)合刺激同樣誘導巨噬細胞總C3蛋白水平和活化裂解產生的C3c片段增加（圖3B）。提示poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激可誘導補體C3的表達和活化增加。

圖1 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激加重肺臟組織病理變化Fig.1 Poly（I：C）combined with LPS stimulation aggravated lung tissue pathological changes

2.4 Ficolin參與介導poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的補體C3活化通過Western blot檢測ficolin敲除小鼠聯(lián)合刺激后肺臟補體C3蛋白的表達和活化變化。結果顯示，在PBS組，F(xiàn)cna-/-和Fcnb-/-小鼠的C3蛋白表達和活化較野生型小鼠無明顯差異（圖4）；而在poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激組，F(xiàn)cna-/-和Fcnb-/-小鼠的總C3蛋白表達和活化后產生的片段較野生型小鼠均明顯降低（圖4）。提示ficolin可能參與聯(lián)合刺激誘導的小鼠肺臟補體C3活化。

圖2 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激大量招募中性粒細胞和巨噬細胞，并誘導肺泡巨噬細胞耗竭Fig.2 Poly（I：C）combined with LPS stimulation recruits in large numbers of neutrophils and macrophages and induces exhaustion of alveolar macrophages

圖3 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導補體C3表達和活化增加Fig.3 Poly（I：C）combined with LPS stimulation induces increased expression and activation of complement C3

2.5 敲除ficolin緩解poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的急性肺損傷進一步利用Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠研究ficolin在poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導小鼠肺臟損傷中的作用。在PBS對照組，ficolin敲除小鼠和野生型小鼠的肺組織病理學變化均無明顯差異，但在poly（I：C）單獨或聯(lián)合LPS刺激組，F(xiàn)cna-/-和Fcnb-/-小鼠較野生型小鼠肺內支氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤減少，肺泡融合和彌漫性損傷減輕，支氣管腔內出血及病理損傷程度明顯減輕（圖5）。提示ficolin通過激活補體參與poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的小鼠急性肺損傷。

圖4 敲除ficolin降低poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的補體C3活化Fig.4 Knockout of ficolin reduces activation of complement C3 induced by poly（I：C）combined with LPS stimulation

圖5 Ficolin敲除對poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激后肺組織病理變化的影響Fig.5 Effect of ficolin knockout on pathological changes of lung tissue after poly（I：C）combined with LPS stimulation

2.6 敲除ficolin緩解poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的間質巨噬細胞募集和肺泡巨噬細胞耗竭利用Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠研究ficolin在poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激對小鼠肺臟中性粒細胞、間質巨噬細胞和肺泡巨噬細胞的變化影響。結果顯示，在聯(lián)合刺激后第5天，ficolin敲除小鼠和野生型小鼠肺臟中性粒細胞的比例變化無顯著差異（圖6A）；Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠相較于野生型小鼠，間質巨噬細胞比例由33.9%分別降低至10.7%和16.1%（圖6B），而肺泡巨噬細胞比例由3.81%分別升高至5.93%和5.97%（圖6C）。提示ficolin參與poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激中間質巨噬細胞的募集和肺泡巨噬細胞的耗竭。

圖6 Ficolin敲除對poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激后肺臟中性粒細胞和巨噬細胞比例的影響Fig.6 Effect of ficolin knockout on proportions of neutrophils and macrophages in lung after poly（I：C）combined with LPS stimulation

3 討論

呼吸道病毒感染嚴重威脅人類健康，而病毒感染后繼發(fā)細菌感染是導致肺臟急性損傷加重和病死率升高的重要因素之一，其中的免疫學機制尚不完全清楚，尤其是補體ficolin是否參與病毒繼發(fā)細菌感染誘導的急性肺損傷還未有研究闡明。深入探究聯(lián)合感染損傷加重的發(fā)生機制，有利于尋找潛在的治療靶點，從而緩解病毒繼發(fā)細菌感染誘導的急性肺損傷并降低致死率［15］。

RNA病毒侵入靶細胞后形成的dsRNA可作為主要的PAMPs與靶細胞內的PRRs結合，如Toll樣受體3（TLR3）或視黃酸誘導基因（RIG-Ⅰ），誘導下游信號通路的激活和促炎細胞因子/趨化因子的分泌［16］。繼發(fā)細菌感染后，革蘭氏陰性菌主要致病物質LPS可激活TLR4，同樣引起下游信號轉導及促炎因子分泌［17］。目前用不同病毒和細菌建立各種組合感染的模型比較困難，并且之前已有研究證明通過使用病毒RNA模擬物poly（I：C）激活抗病毒免疫反應足以對宿主抗細菌免疫應答產生影響［13］。而且poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激導致的肺臟病理變化與流感病毒繼發(fā)細菌感染相似，如肺損傷面積增多，肺泡廣泛萎縮，并伴有明顯的炎癥細胞浸潤［18］。因此，本實驗通過滴鼻poly（I：C）和革蘭氏陰性菌的內毒素LPS模擬病毒繼發(fā)細菌感染所誘導的急性肺臟損傷，并進一步探究其中的免疫學發(fā)病機制。

本研究建立了LPS誘導的poly（I：C）預刺激的小鼠急性肺臟損傷模型，證實聯(lián)合刺激組小鼠肺臟病理較PBS組和單獨刺激組小鼠加重，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合刺激大量招募中性粒細胞和間質巨噬細胞進入肺臟，證實聯(lián)合刺激明顯誘導小鼠肺臟和RAW264.7細胞中補體C3的表達與酶解活化，并進一步發(fā)現(xiàn)補體ficolin在此模型中可能介導C3的活化，敲除ficolin明顯減輕聯(lián)合刺激誘導的小鼠肺臟病理損傷，以及降低間質巨噬細胞的募集和肺泡巨噬細胞的耗竭。提示ficolin通過激活補體參與poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導的急性肺損傷。

既往研究發(fā)現(xiàn)ficolin在單獨病毒或細菌感染中都發(fā)揮作用，并且ficolin能增強IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子和CXCL1/2/10、CCL14等趨化因子的表達，并抑制抗炎細胞因子IL-10的表達，導致炎癥反應加重［19-22］，而目前仍未有研究闡明ficolin在聯(lián)合感染導致肺臟損傷加重中的作用及機制。本研究通過使用RNA病毒和革蘭氏陰性菌相應的PAMPs模擬聯(lián)合感染過程，初步闡明ficolin通過活化補體促進肺臟炎癥反應以及促進間質巨噬細胞募集和肺泡巨噬細胞耗竭，從而加重肺臟免疫損傷，為呼吸道RNA病毒繼發(fā)革蘭氏陰性菌感染的預防和治療提供潛在的干預靶點和新的方向。