范文博，朱文博，張美華，趙天，江建平*

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

兩棲動(dòng)物是脊椎動(dòng)物中從水生到陸生的過渡類群，生活史比較特殊，涵蓋了水環(huán)境和陸生環(huán)境，因此，在進(jìn)化生物學(xué)方面具有十分重要的科學(xué)研究價(jià)值。兩棲動(dòng)物的卵相對(duì)較大、無卵殼，易于觀察，常被用于胚胎發(fā)育觀測研究，以促進(jìn)發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展（Liu，2016），為兩棲動(dòng)物繁育、種群人工復(fù)壯提供了基礎(chǔ)信息。

中國大鯢是中國特有的兩棲動(dòng)物，隸屬有尾目Caudata隱鰓鯢科Cryptobranchidae大鯢屬，廣泛分布于我國17個(gè)省、自治區(qū)、直轄市，在長江、黃河、珠江三大流域的水系中均有發(fā)現(xiàn)（葉昌媛等，1993；費(fèi)梁等，2006，2012）。近幾十年來，過度收購、非法捕殺和棲息地喪失等導(dǎo)致野生大鯢種群數(shù)量下降極為嚴(yán)重，分布區(qū)域日益萎縮（姚一彬等，2013，Zhao，2020），在《中國脊椎動(dòng)物紅色名錄》中被評(píng)定為極危物種（趙爾宓，汪松，1998；蔣志剛等，2016；江建平等，2016，2021）。我國早在1989年將其列為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，2021年明確僅限野外種群（國家林業(yè)和草原局，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2021）。此外，不當(dāng)放歸加劇了當(dāng)?shù)卦N的滅絕（Shu，2021）。因此，該物種的野生種群面臨滅絕的風(fēng)險(xiǎn)高，亟待推進(jìn)有效保護(hù)。

對(duì)于滅絕風(fēng)險(xiǎn)高的物種，確保其種群復(fù)壯是推進(jìn)有效保護(hù)的關(guān)鍵。胚胎發(fā)育觀測是提升種群繁育與復(fù)壯的重要基礎(chǔ)性工作之一。因此，對(duì)中國大鯢進(jìn)行胚胎發(fā)育觀測研究具有十分重要的意義。陽愛生等（1983）用產(chǎn)于湖南省桑植縣的大鯢胚胎首次進(jìn)行了初步研究，觀察了大鯢胚胎發(fā)育的17個(gè)時(shí)期。劉鑒毅等（1994）對(duì)大鯢（未標(biāo)明產(chǎn)地）早期胚胎發(fā)育過程進(jìn)行了細(xì)致觀察，詳細(xì)描述了31個(gè)時(shí)期的外形特征、繪制了各個(gè)時(shí)期的特征。馮小榮等（1997a）使用石蠟切片的方法對(duì)產(chǎn)于湖南省永州市的大鯢胚胎進(jìn)行了顯微觀察，認(rèn)為大鯢的胚胎發(fā)育分為8個(gè)階段。駱劍等（2007）觀測產(chǎn)于湖南省長沙市的大鯢胚胎，提出大鯢胚胎發(fā)育分為20個(gè)時(shí)期，而姚一彬等（2013）觀測了產(chǎn)于湖南省張家界的大鯢胚胎，共識(shí)別了23個(gè)時(shí)期。近來的遺傳檢測分析發(fā)現(xiàn)，中國大鯢存在明顯的多個(gè)支系分化，可能達(dá)到種級(jí)分化（Yan，2018），Turvey等（2019）已提議把珠江上游的一個(gè)支系恢復(fù)為有效物種（Boulenger，1924）。本研究旨在觀測未經(jīng)研究產(chǎn)地的大鯢個(gè)體的胚胎發(fā)育，完善中國大鯢復(fù)合體的發(fā)育特性等基礎(chǔ)信息，為該種的保育、放歸工作以及人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的工廠化提供一定的幫助和建議。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

卵群采自四川省眉山市洪雅縣大鯢繁育場（103.156 1°E，29.876 2°N，海拔568 m），并在場內(nèi)進(jìn)行觀測。根據(jù)遺傳檢測結(jié)果，親本源于四川省廣元市青川縣，屬于秦嶺支系。這些親本在生態(tài)養(yǎng)殖環(huán)境中自然發(fā)情、交配、繁殖，產(chǎn)卵于養(yǎng)殖場河道兩側(cè)的洞穴內(nèi)。在受精卵達(dá)到后肢芽期前，于河道中孵育并觀測，期間氣溫15.74℃±3.79℃（=204），水溫15.48℃±1.14℃（=209），pH6.5；在后肢芽期后，將胚胎轉(zhuǎn)移至室內(nèi)孵育池飼養(yǎng)并觀測，期 間 氣 溫15.31℃±0.73℃（=87），水 溫15.51℃±0.52℃（=87），pH6.5。

1.2 受精率與孵化率統(tǒng)計(jì)

隨機(jī)選取了養(yǎng)殖場內(nèi)的10窩卵，觀察到出現(xiàn)卵裂即記為受精卵，進(jìn)行受精率的統(tǒng)計(jì)。后期統(tǒng)計(jì)其中未被養(yǎng)殖場混合的4窩卵的孵化率。

1.3 早期個(gè)體發(fā)育的觀察、記錄及分期

胚胎發(fā)育外形觀察與記錄：受精卵階段～多細(xì)胞期，2 h/次；囊胚期～鰓板期，4～8 h/次；前肢芽期～前肢三指期～后肢三趾期，12 h/次；后肢四趾期為1 d/次。后肢五趾期后，短期內(nèi)外形特征變化不明顯，適當(dāng)延長觀察記錄的間隔時(shí)間。在循環(huán)系統(tǒng)形成后心臟開始搏動(dòng)期間，使用體式鏡觀察心跳模式并記錄心率。

受精卵直徑5～7 mm，肉眼即清晰可見個(gè)體發(fā)育的外形特征及其變化，觀察時(shí)使用數(shù)碼相機(jī)（Leica DFC450C）拍照，通過胚胎發(fā)育各階段的外形特征及其變化進(jìn)行發(fā)育分期。用于觀察、拍照和采樣保存的胚胎共153枚。分期主要參考大鯢個(gè)體早期發(fā)育的觀測結(jié)果（陽愛生等，1983；劉鑒毅等，1994；馮小榮等，1997a，1997b；駱劍等，2007；姚一彬等，2013），以及謝峰等（2001）對(duì)鎮(zhèn)海棘螈個(gè)體早期發(fā)育的研究結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 受精率與孵化率

10窩卵的窩卵數(shù)變化明顯，最少的僅436顆，最多高達(dá)2 274顆。受精率窩間變化明顯，52.60%～96.53%，總體受精率為79.10%，平均窩卵受精率76.90%。4窩卵的孵化率為46.88%～80.02%，窩間變化明顯，總體孵化率為69.85%，平均窩卵孵化率66.80%（表1）。

表1 中國大鯢的受精率與孵化率Table 1 Fertilization rate and hatching rate of Andrias davidianus

2.2 發(fā)育時(shí)期及其外形特點(diǎn)

中國大鯢從受精卵到孵化需1 140 h（約48 d）左右，從孵化到指、趾完全成形需要525 h（約22 d）左右。胚胎早期發(fā)育分為30個(gè)時(shí)期，包括孵化前胚胎發(fā)育的24個(gè)時(shí)期（時(shí)期1～24）和孵化后個(gè)體發(fā)育的6個(gè)時(shí)期（時(shí)期25～30）（表2；圖1）。

圖1 中國大鯢早期個(gè)體發(fā)育Fig.1 Atlas of Andrias davidianus at early development

表2 中國大鯢早期個(gè)體發(fā)育的時(shí)相Table 2 Time phases of early development of Andrias davidianus

在前肢芽早期（時(shí)期18），心臟開始搏動(dòng)，腹部可見透明血管網(wǎng)；3對(duì)外鰓芽隆起、伸長，前2對(duì)長于第三對(duì)。隨后出現(xiàn)鰓循環(huán)，表明循環(huán)系統(tǒng)活動(dòng)已經(jīng)開始。此時(shí)的胚胎可緩慢扭動(dòng)身體。

隨著發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，心跳能力逐步加強(qiáng)。從剛開始搏動(dòng)時(shí)的10～16次/min，逐步提高到孵化時(shí)的30～35次/min，再提高到30～40次/min。不斷提升氧氣的供給能力，以滿足后期發(fā)育的需求。

前肢發(fā)育早于后肢。指的發(fā)育順序?yàn)閺膬?nèi)向外依次分化出第一指、第二指、第三指和第四指（圖2）。趾的發(fā)育順序也是從內(nèi)向外依次分化出第一趾、第二趾、第三趾、第四趾和第五趾（圖3）。隨后，四肢基本成形，為個(gè)體活動(dòng)提供逐漸增強(qiáng)的支撐能力。

圖2 中國大鯢前肢發(fā)育Fig.2 Atlas of Andrias davidianus forelimb development

圖3 中國大鯢后肢發(fā)育Fig.3 Atlas of Andrias davidianus hindlimb development

在鰓板期開始出現(xiàn)眼部，到鰓血循環(huán)晚期，眼部區(qū)域色深，出現(xiàn)明顯眼部區(qū)域，在后肢三趾期開始區(qū)分出明顯的眼晶體區(qū)和瞳孔區(qū)，到后肢五趾期時(shí)，區(qū)分更加明顯，與成體幾乎一致?？诹言诤笾科陂_始出現(xiàn)，到后肢五趾期時(shí)，口裂基本成形（圖4），此時(shí)的幼體開食，表明口咽腔開始具備攝食功能。

圖4 中國大鯢頭部發(fā)育Fig.4 Atlas of Andrias davidianus head development

3 討論

3.1 中國大鯢的繁殖產(chǎn)量

中國大鯢整體的受精率、孵化率較高，且平均窩卵數(shù)量大，但窩間存在差異，部分窩卵的受精率僅50%左右，較高的可達(dá)90%以上，其原因可能在于不同個(gè)體的體質(zhì)存在一定差異。在繁殖期雄性間往往進(jìn)行激烈的爭斗，該過程可能導(dǎo)致了優(yōu)質(zhì)繁殖資源與劣質(zhì)繁殖資源的不均等分配，造成了受精卵出現(xiàn)產(chǎn)量與受精質(zhì)量的差異。此外，觀察過程中的人為干擾也可能是該現(xiàn)象發(fā)生的原因之一，例如部分窩卵在經(jīng)過篩選和計(jì)數(shù)后，會(huì)發(fā)生護(hù)卵雄鯢吞食掉卵塊的現(xiàn)象，部分窩卵甚至被吞食殆盡。因此，親本的習(xí)性可能對(duì)產(chǎn)量有一定影響。

3.2 發(fā)育模式

中國大鯢的胚胎發(fā)育階段類似于鎮(zhèn)海棘螈（謝鋒等，2001）、紅瘰疣螈（楊國輝等，2011）和掛榜山小鯢（米小其等，2007）等有尾類兩棲動(dòng)物，具有相似的卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經(jīng)胚階段、器官形成階段、孵化階段等，早期細(xì)胞分裂與神經(jīng)、器官的形成順序相對(duì)一致，但中國大鯢的卵裂近似于盤狀分裂，植物極未見明顯分裂溝，其原因可能是植物極過大。此次觀測了大鯢早期發(fā)育的30個(gè)時(shí)期，其中，孵化前的胚胎發(fā)育有24個(gè)時(shí)期，與姚一彬等（2013）研究結(jié)果基本一致。繼續(xù)觀測了孵化后的個(gè)體發(fā)育進(jìn)程，直到后肢五趾期，共6個(gè)時(shí)期。中國大鯢早期個(gè)體發(fā)育時(shí)間較長，到孵化期歷時(shí)約1 032～1 140 h，超過東方蠑螈（曲韻芳等，1966）、紅瘰疣螈（楊國輝等，2011）、鎮(zhèn)海棘螈（謝鋒等，2001）、東北小鯢（江澗，1985）等有尾類，與掛榜山小鯢相似（米小其等，2007），短于西藏山溪鯢（徐劍，崔建華，1993）。有尾類孵化期的長短差異可能與卵大小和孵化溫度高低有關(guān)。

3.3 大鯢自然繁育期的溫度條件

洪雅縣大鯢養(yǎng)殖場采用半自然的仿生態(tài)方式繁育，水溫為溪流的自然水溫。大鯢交配行為發(fā)生在9月初，屬夏季入秋階段，水溫在15.5℃以上，平均水溫在16.6℃左右，最高水溫18℃。在胚胎發(fā)育完畢孵化出幼體階段時(shí)，已是10月中下旬，正值深秋，平均水溫下降到15.1℃，最低水溫14.0℃。11月上旬孵化后的幼體發(fā)育達(dá)到后肢五趾期時(shí)，口咽腔和眼均基本發(fā)育成型，其可以自由進(jìn)食；此時(shí)已經(jīng)是入冬，水溫變化較不明顯，但相較于前期氣溫也有所降低，平均水溫為15℃，最低水溫13.8℃。這表明，在人工仿生態(tài)養(yǎng)殖場的環(huán)境下，大鯢胚胎發(fā)育時(shí)的環(huán)境溫度仍然處于逐漸降低的狀態(tài)。對(duì)同一場地來源的中國大鯢進(jìn)行的溫度（5℃、15℃、25℃）馴化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其適宜溫度在15℃左右，且生長發(fā)育狀況最好（趙春霖，2019）。歐陽力劍等（2014）研究不同溫度（15～23℃）對(duì)大鯢胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)大鯢胚胎發(fā)育適宜的溫度為17～21℃，且孵化率在19℃±0.5℃時(shí)最高，達(dá)到93.5%，高于本研究觀測到的孵化率。因此，在推進(jìn)中國大鯢的人工飼養(yǎng)繁育時(shí)，需要考慮不同原產(chǎn)地或不同支系適宜溫度的需求事宜。

洪雅縣大鯢繁育場的業(yè)主何孝云、楊洪才先生提供用于觀測中國大鯢早期個(gè)體發(fā)育的胚胎、觀測場地和食宿條件。謹(jǐn)此一并致謝！