乳酸鏈球菌素Q13的純化及其對保加利亞乳桿菌的抑菌機理

萬 倩，黃曉英，李啟明，吳華星，劉絨梅，唐俊妮,*

（1.西南民族大學食品科學與技術學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，新希望乳業(yè)股份有限公司，四川省優(yōu)質(zhì)乳品制備與質(zhì)量控制技術工程實驗室，四川 成都 610000）

酸奶是指以原料乳為發(fā)酵底物，并以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為主要菌種發(fā)酵而成的乳制品，因其具有營養(yǎng)豐富、風味獨特等優(yōu)點而廣受消費者的喜愛。然而，酸奶在貯存、運輸及銷售環(huán)節(jié)中并不能保證完全的冷鏈條件，即容易出現(xiàn)脫冷現(xiàn)象，進而使得乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵殘存乳糖產(chǎn)生乳酸，乳酸的大量積累造成酸奶感官質(zhì)量嚴重降低，縮短酸奶的保質(zhì)期，限制酸奶產(chǎn)品的跨地域銷售。有研究報道酸奶后酸化會損害益生菌的生存能力，這也是大多數(shù)酸奶產(chǎn)品活菌數(shù)含量低的主要原因。大量研究表明酸奶后酸化的主要原因是保加利亞乳桿菌在后期繼續(xù)發(fā)酵代謝乳糖產(chǎn)生乳酸所造成。Laye等研究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌生長代謝過程中可以產(chǎn)生-乳酸和-乳酸，而導致酸奶后酸化的主要物質(zhì)是保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的-乳酸。如何通過綠色安全有效以及低成本的方式控制酸奶在儲運、銷售環(huán)節(jié)中的后酸化已經(jīng)成為目前奶制品行業(yè)學者研究的熱點。

細菌素是核糖體上合成一類多肽或抗菌蛋白，其抑菌范圍的寬窄具有菌株特異性，并且多數(shù)細菌素是由乳酸菌這一種屬所產(chǎn)生。長期以來，乳酸菌以其公認安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物的地位在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于食品發(fā)酵。因此，乳酸菌細菌素被認為是一種綠色、安全以及高效的天然抑菌物質(zhì)，并且由乳酸乳球菌乳酸亞種所產(chǎn)生乳酸鏈球菌素是目前唯一通過美國食品藥品監(jiān)督管理局/世界衛(wèi)生組織認證的細菌素。有研究人員發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素不僅可以使肉類產(chǎn)品免受致病菌污染，提高安全性和延長貨架期，還能有效抑制酸奶產(chǎn)品發(fā)酵后期保加利亞乳桿菌的生長，從而達到緩解酸奶后酸化效果。

本實驗基于前期篩選所得到的1 株拮抗保加利亞乳桿菌生長的乳酸乳球菌Q13，通過對其所產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素進行硫酸銨沉淀、超濾及葡聚糖凝膠層析等純化，研究乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌細胞膜通透性、胞內(nèi)酶活性及菌體細胞結構等影響，闡明乳酸鏈球菌素對保加利亞乳桿菌抑菌作用機制，為開發(fā)延緩酸奶后酸化的新型安全有效輔助添加劑提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸乳球菌Q13（Q13）由新希望乳業(yè)股份有限公司乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室提供，并以從后酸化較為嚴重的酸奶產(chǎn)品中分離鑒定的保加利亞乳桿菌LMG-1（LMG-1）作為指示菌。

MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；超濾管15 mL（3、10 kDa）、普通層析柱（10 mm×60 cm）、寬范圍彩色預染蛋白質(zhì)Marker（11～245 kDa）、二乙酸熒光素北京索萊寶科技有限公司；硫酸銨、葡聚糖凝膠G-50上海源葉生物科技有限公司；超微量Na/K-ATP酶試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5804/5804 R高速臺式離心機 德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；ChemiDoc MP化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)/全能型成像儀 美國Bio-Rad公司；JY92-IIN超聲細胞破碎儀寧波新芝生物科技有限公司；318C+酶標儀 上海沛歐分析儀器有限公司；INC821C兩槽式恒溫培養(yǎng)箱雅馬拓科技貿(mào)易上海有限公司；AKHL-III-24艾柯超純水機成都康寧實驗專用純水設備公司；MLS-3020電熱自動滅菌鍋 日本SANYO公司；BBS-DDC醫(yī)用潔凈工作臺濟南鑫貝西生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸乳球菌Q13發(fā)酵上清液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取79 g乳清蛋白粉、21 g大豆蛋白胨，加入蒸餾水或去離子水1 L，邊加熱邊攪拌至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

將菌株Q13接種于上述培養(yǎng)基，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，調(diào)pH值至中性后，再用0.22 μm水系濾器過濾得無菌上清液，冷藏備用。

1.3.2 硫酸銨沉淀

取1.3.1節(jié)制備的無菌上清液，等體積分配至離心管中，再分別向各管中緩慢添加硫酸銨并溫和攪拌，使其飽和度分別為20%、40%、60%、80%和100%，置于4 ℃靜置過夜，離心獲沉淀并回溶至原體積的1/10。使用平板打孔法檢測不同硫酸銨飽和度下沉淀回溶液的抑菌效果，并利用BCA蛋白定量試劑盒測定回溶液中蛋白含量，建立硫酸銨鹽析曲線，確定后續(xù)實驗所需硫酸銨飽和度。

1.3.3 超濾

在冰浴條件下向Q13無菌上清液中緩慢加入硫酸銨至終飽和度為60%，待硫酸銨顆粒完全溶解后，于冰箱靜置過夜，離心獲沉淀并用1/10原體積量的超純水回溶，使用0.22 μm水系濾膜過濾得無菌回溶液，并用截留分子質(zhì)量為3 kDa和10 kDa的超濾離心管（5 500 r/min，30 min）處理無菌回溶液，分別獲得＜3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa三個組分并將其記為A、B、C，測定A、B、C三個組分的抑菌活性。選擇A、B、C三個組分抑菌效果最為明顯的進行后續(xù)實驗。

1.3.4 Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱層析

參照Perumal等方法略作修改，主要包括制備Sephadex G-50凝膠、裝柱、加樣等過程，并利用無菌超純水進行洗脫，收集各段洗脫峰，檢測洗脫液OD，并利用平板打孔法測定各洗脫峰的抑菌圈直徑。對有抑菌效果的洗脫峰收集后進行冷凍干燥濃縮，以供后續(xù)實驗。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

利用SDS-PAGE檢驗乳酸鏈球菌素Q13純化效果和確定該細菌素分子質(zhì)量，選用15%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE的配制。并采用分子質(zhì)量范圍為11～245 kDa的Marker作為分子質(zhì)量標準參照。

1.3.6 乳酸鏈球菌素Q13最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

參照孫悅等的方法略作修改，將乳酸鏈球菌素Q13加入MRS肉湯培養(yǎng)基中，采用二倍稀釋法使其終質(zhì)量濃度分別為25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.20、0.10 mg/mL，按3%接種量接入保加利亞乳桿菌LMG-1，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，通過肉眼觀察到無渾濁現(xiàn)象所對應質(zhì)量濃度即為乳酸鏈球菌素Q13的MIC。以未經(jīng)過乳酸鏈球菌素Q13處理的LMG-1菌株作為對照組。

1.3.7 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌生長曲線的影響

取經(jīng)過2 次活化的菌株LMG-1，按3%接種量接入含有不同質(zhì)量濃度（1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、0 MIC）乳酸鏈球菌素的MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔1 h取樣測定OD，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標、OD為縱坐標，繪制保加利亞乳桿菌生長曲線。對照組（0 MIC）除未添加乳酸鏈球菌素Q13以外，其他操作與處理組相同。

1.3.8 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌胞內(nèi)酶活性的影響

根據(jù)梅佳林等方法略作修改，將指示菌LMG-1活化2 代（對數(shù)期）后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min獲菌體沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中（原培養(yǎng)液體積），加入乳酸鏈球菌素Q13使其終濃度分別為4 MIC、2 MIC和1 MIC。37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h，離心棄去上清液收集菌體細胞重懸于PBS，冰水浴超聲破碎菌體細胞，每次超聲時間設置為2 s，間隔時間設置為4 s，總時間為1 min。利用AKP檢測試劑盒（OD）和超微量Na/K-ATP酶試劑盒檢測胞內(nèi)酶活性（OD）。對照組設置同1.3.7節(jié)。

1.3.9 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌細胞膜通透性的影響

將指示菌LMG-1活化2 代（對數(shù)期）后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄掉上清液將沉淀用PBS重懸至原培養(yǎng)液體積，加入乳酸鏈球菌素Q13使其質(zhì)量濃度分別為4 MIC、2 MIC和1 MIC，所有實驗組于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，取各實驗組菌懸液進行離心收集菌體細胞，使用PBS洗滌菌體2～3 次后棄掉上清液，加入250 μL 2 mg/mL的二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）-丙酮溶液，于室溫靜置20 min后使用PBS洗滌3～4 次，離心棄上清液后重懸于PBS，用熒光分光光度計檢測熒光強度（激發(fā)波長297 nm，發(fā)射波長527 nm）。對照組設置同1.3.7節(jié)。

1.3.10 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌細胞結構的影響

將指示菌LMG-1活化2 代后，離心獲菌體細胞，用MRS肉湯培養(yǎng)基回溶至原培養(yǎng)液體積（10CFU/mL），向其中加入乳酸鏈球菌素Q13使終質(zhì)量濃度為1 MIC，37 ℃培養(yǎng)12 h后離心收集菌體。后根據(jù)掃描電鏡樣品處理要求制備樣品。同時以未經(jīng)過乳酸鏈球菌素Q13處理的菌體細胞作為對照組。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

資料錄入、整理和分析釆用Excel 2019，統(tǒng)計學處理采用SPSS 26.0，使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 硫酸銨最適飽和度確定

由不同飽和度硫酸銨沉淀得到的粗提物抑菌活性數(shù)據(jù)（圖1）可知，20%～60%飽和度硫酸銨沉淀后粗提物抑菌效果呈現(xiàn)逐漸增強趨勢，當硫酸銨飽和度大于60%時，抑菌效果變化不顯著。隨著硫酸銨飽和度的增加，粗提物蛋白含量呈逐漸增加的趨勢，80%飽和度硫酸銨沉淀后粗提物蛋白含量達到最大值。綜合硫酸銨沉淀得到粗提物蛋白含量和抑菌實驗結果，抗菌蛋白在60%飽和度下基本已經(jīng)完全沉淀，當飽和度進一步增加（60%～100%）沉淀的蛋白可能為一些無抑菌活性的雜蛋白。因此選擇60%硫酸銨飽和度進行后續(xù)實驗。

圖1 硫酸銨沉淀得到粗提物的蛋白質(zhì)含量和對LMG-1菌株抑菌效果Fig. 1 Protein contents of crude extract obtained by ammonium sulfate precipitation and its antibacterial effect on LMG-1

2.2 超濾分離結果

將乳酸乳球菌Q13無菌上清液經(jīng)過60%飽和度硫酸銨沉淀得到的乳酸鏈球菌素粗提物進行超濾，獲得A（＜3 kDa）、B（3～10 kDa）和C（＞10 kDa）3 個組分，由表1可知，僅分子質(zhì)量大于10 kDa的組分C具有較強抑菌效果，而分子質(zhì)量小于10 kDa的組分A和B均無抑菌活性，因此選擇組分C進行后續(xù)分離純化實驗。

表1 不同超濾組分對保加利亞乳桿菌LMG-1的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different ultrafiltration fractions on L. bulgaricus LMG-1

2.3 Sephadex G-50凝膠柱層析結果

乳酸乳球菌Q13無菌上清液經(jīng)過硫酸銨沉淀和超濾分離后，Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱層析后共收集到3 個洗脫峰，如圖2所示。3 個洗脫峰抑菌實驗結果顯示，僅有洗脫峰1和2具有抑菌活性，收集合并兩峰洗脫液，濃縮至加樣體積，以備后續(xù)實驗。

圖2 Sephadex G-50凝膠柱層析結果及洗脫液對保加利亞乳桿菌LMG-1的抑菌活性Fig. 2 Sephadex G-50 gel column chromatographic profile of ultrafiltration fraction C

2.4 乳酸鏈球菌素Q13純化物的SDA-PAGE分析

將經(jīng)過硫酸銨沉淀、超濾和葡聚糖凝膠柱層析等純化步驟后所得到乳酸鏈球菌素Q13純化物進行SDAPAGE，結果見圖3。未經(jīng)純化乳酸乳球菌Q13無菌上清液呈現(xiàn)出多條蛋白條帶（泳道d），經(jīng)過3 步分離純化處理后所得到純化物僅呈現(xiàn)出相對單一條帶。同時由圖4可初步判斷出該乳酸鏈球菌素分子質(zhì)量約為17.5 kDa，這與文獻所提出的乳酸鏈球菌素分子質(zhì)量約為3.5 kDa不一致，Gharsallaoui等報道乳酸鏈球菌素分子質(zhì)量一般為3.5 kDa，但該肽能形成二聚體（7 kDa）、四聚體（14 kDa）以及五聚體（17.5 kDa）等多聚體結構。說明本實驗所獲得乳酸鏈球菌素分子結構可能為五聚體形式，即乳酸乳球菌Q13所產(chǎn)細菌素是一種新型乳酸鏈球菌素，將其命名為乳酸鏈球菌素Q13。

圖3 乳酸鏈球菌素Q13不同純化物的SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE electrophoretogram of of different purified fractions from nisin Q13

圖4 純化乳酸鏈球菌素Q13的SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE electrophoretogram of purified nisin Q13

2.5 乳酸鏈球菌素Q13 MIC的測定

采用二倍稀釋法制備含不同濃度乳酸鏈球菌素Q13的MRS肉湯培養(yǎng)基，3%接種量接入指示菌LMG-1，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，觀察指示菌生長情況見表2，確定乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳菌LMG-1的MIC為0.39 mg/mL。

表2 乳酸鏈球菌素Q13 MIC測定結果Table 2 MIC of nisin Q13

2.6 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌生長曲線的影響

通過研究細菌生長情況評估抑菌物質(zhì)對指示菌的抑菌效果，細菌生物量變化通過OD確定，即二者關系為正相關，如圖5所示，對照組（0 MIC）細菌生長呈S型曲線，其生長狀況良好；加入少量抑菌物質(zhì)組（1/4 MIC）細菌生長仍呈S型曲線，但生長速度低于對照組，到達穩(wěn)定期時間延長；而抑菌物質(zhì)加入量為1/2 MIC時，細菌生長曲線延滯期變長，細菌生長明顯受到抑制；抑菌物質(zhì)加入量增加至1 MIC時，細菌生物量在0～24 h內(nèi)未發(fā)生變化，細菌生長被完全抑制住。

圖5 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌LMG-1生長的影響Fig. 5 Effect of nisin Q13 on grwoth curve of L. bulgaricus LMG-1

2.7 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌胞內(nèi)酶活性的影響

Na/K-ATP酶是存在組織細胞及細胞器的膜上的一種蛋白酶，可通過維持胞外低Na和胞內(nèi)高K的跨膜離子泵保證細胞環(huán)境的穩(wěn)定性，這對于細胞生長、分化和存活至關重要，通過測定胞內(nèi)Na/K-ATP酶活性變化情況可以間接反映抑菌物質(zhì)對指示菌生物膜結構的影響。由圖6可知，處理組胞內(nèi)Na/K-ATP酶活性明顯低于對照組，且隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，酶活性下降越明顯，表明乳酸鏈球菌素的處理能有效抑制保加利亞乳桿菌胞內(nèi)Na/K-ATP酶活性，這可能與指示菌膜結構受損、破壞跨膜離子泵原本維持的穩(wěn)定狀態(tài)有關。實驗結果與梅佳林等研究芳樟醇處理對莓實假單胞菌胞內(nèi)Na/K-ATP酶活性影響實驗結果相類似，說明胞內(nèi)Na/K-ATP酶活力的高低是細胞生理代謝活動的關鍵影響因子之一。

AKP是一種存在于細胞膜與細胞壁之間的蛋白酶，當細胞結構受到破壞時，AKP會外泄至胞外導致胞內(nèi)AKP含量降低，因此可通過檢測AKP活力分析抑菌物質(zhì)對指示菌細胞結構的破壞情況。由圖6可知，對照組胞內(nèi)AKP活力最高，其次是處理組1 MIC、2 MIC和4 MIC，說明乳酸鏈球菌素處理可使細胞結構受損，導致胞內(nèi)酶等組分外泄，這也是導致胞內(nèi)Na/K-ATP酶和AKP含量降低的主要原因。

圖6 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌LMG-1胞內(nèi)酶的影響Fig. 6 Effect of nisin Q13 on intracellular enzyme activities of L. bulgaricus LMG-1

2.8 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌細胞膜通透性的影響

通過FDA染色實驗研究乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌細胞膜通透性，F(xiàn)DA是一種不帶電荷、無熒光的脂質(zhì)性分子，其易通過細胞膜進入胞內(nèi)被酶水解為熒光素發(fā)出綠色熒光，但當細胞膜受到破壞時，形成的熒光素分子流失至胞外導致二乙酸熒光素熒光強度降低。圖7顯示，對照組（0 MIC）熒光強度為486，處理組（1 MIC、2 MIC、4 MIC）熒光強度分別為271、256和239，可看出乳酸鏈球菌素處理組熒光強度明顯低于對照組，說明乳酸鏈球菌素的處理改變保加利亞乳桿菌的細胞膜通透性，且乳酸鏈球菌素濃度越高，F(xiàn)DA熒光強度越低，細胞膜破壞程度越嚴重。

圖7 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌LMG-1二乙酸熒光素熒光強度的影響Fig. 7 Effects of nisin Q13 on fluorescence intensity of FDA stained cells of L. bulgaricus LMG-1

2.9 乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌細胞結構的影響

利用乳酸鏈球菌素Q13處理12 h后的保加利亞乳桿菌菌體形態(tài)如圖8所示，對照組菌體形態(tài)呈均勻的棒狀，形狀細長、邊緣整齊、表面光滑，細胞形態(tài)結構完整；而處理組經(jīng)乳酸鏈球菌素Q13處理后，菌體細胞表面褶皺萎縮，形態(tài)卷曲變長，細胞外堆積大量細胞碎片。經(jīng)乳酸鏈球菌素處理后細胞形態(tài)卷曲變長是細胞分裂平面上的細胞膜不穩(wěn)定延伸所導致，而細胞外細胞碎片的積累可能是細胞內(nèi)容物通過細胞膜上形成的孔洞流失至胞外。

圖8 乳酸鏈球菌素Q13處理后保加利亞乳桿菌LMG-1的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM observation of L. bulgaricus LMG-1 after nisin Q13 treatment

3 結 論

利用硫酸銨沉淀、超濾和Sephadex G-50凝膠柱層析等方法純化乳酸鏈球菌素Q13，結果顯示其抗菌蛋白沉淀最適硫酸銨飽和度為60%；硫酸銨沉淀后得到粗提物僅分子質(zhì)量大于10 kDa表現(xiàn)出抑菌活性；將具有抑菌活性的超濾組分Sephadex G-50凝膠柱層析后得到呈現(xiàn)單一條帶的抗菌蛋白，分子質(zhì)量約為17.5 kDa，結合大量文獻推斷其可能為乳酸鏈球菌素的多聚體形式，表明該細菌素是一種新型乳酸鏈球菌素，將其命名為乳酸鏈球菌素Q13。同時，還探討了乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌LMG-1的抑菌機理。結果顯示，乳酸鏈球菌素Q13對保加利亞乳桿菌的抑菌機制主要是通過在靶細胞細胞膜上形成孔洞、增加細胞膜通透性和破壞細胞膜完整性，導致內(nèi)容物外泄，胞內(nèi)Na/K-ATP酶和AKP等關鍵酶含量降低，影響細胞正常能量代謝活動，最終誘導菌體細胞死亡。一方面可以為綠色安全有效的新型乳酸鏈球菌素開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)參考，另一方面，該細菌素有望被作為一種酸奶輔助添加劑應用于乳制品加工業(yè)，緩解酸奶后酸化和延長酸奶貨架期。

未來還需進一步完善該乳酸鏈球菌素序列結構和相關動物實驗以及如何穩(wěn)定高效應用等研究內(nèi)容，以評估其免疫原性、毒性以及在食品領域中應用的重要性。