劉敏，孫鵬，張彥彬，冷露，潘慶杰，董煥聲

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261061)

近年來(lái)，在豬生產(chǎn)中人工授精技術(shù)的應(yīng)用變得愈發(fā)普遍。衡量公豬繁殖力的指標(biāo)有精液品質(zhì)與精子體外的受精能力[1]，最主要的衡量指標(biāo)當(dāng)屬精液品質(zhì)。精子活力和精子形態(tài)這兩項(xiàng)指標(biāo)決定精液品質(zhì)的優(yōu)良程度，在精液常規(guī)指標(biāo)中最能反映出精液質(zhì)量與受精能力[2]。精子活力作為精子受精能力的中心指標(biāo)能充分顯示出豬的繁殖性能。在現(xiàn)代生產(chǎn)中，新鮮精液的精子活力低、畸形率高成了公豬繁殖力低的主要原因。盡管在生產(chǎn)中可以輸入更多數(shù)目的精子來(lái)提高由于精子活力低或畸形率高形成的母豬受胎率降低等問(wèn)題，但提升精液品質(zhì)的首要目標(biāo)仍是提高公豬精子的活力[3]。

睪丸曲細(xì)精管上皮的重要組成部分為支持細(xì)胞，支持細(xì)胞為發(fā)育中的雄性生殖細(xì)胞提供了環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)的輔助作用，另外還擁有非常重要的分泌功能。支持細(xì)胞分泌的一種旁分泌因子——乳酸，其功能是調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的發(fā)育[4]。睪丸支持細(xì)胞可通過(guò)糖酵解的方式將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，因?yàn)榇志€期精母細(xì)胞和圓形精子的首選代謝底物為乳酸，所以乳酸對(duì)于生殖細(xì)胞來(lái)說(shuō)極為重要。Alves等[5]稱糖尿病會(huì)使得支持細(xì)胞的乳酸代謝失衡并使得支持細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的代謝平衡紊亂，最后會(huì)使精子活力降低并導(dǎo)致其生殖能力下降。徐蕊等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白缺乏將會(huì)導(dǎo)致大鼠進(jìn)行性不育。由此可見(jiàn)，睪丸支持細(xì)胞的分泌物會(huì)影響雄性動(dòng)物的生殖能力。目前利用體外添加豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的技術(shù)鮮少有人研究，所以本試驗(yàn)以豬精子為研究對(duì)象，在體外條件下向豬精液中添加豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液，并通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測(cè)定其對(duì)精子活力的影響，為提高豬體外授精效率提供新的方式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 豬睪丸與豬精液的獲取

本試驗(yàn)所用精液購(gòu)自即墨市某種公豬站，試驗(yàn)所用豬睪丸取自即墨某豬場(chǎng)健康去勢(shì)仔豬。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、胰蛋白酶均購(gòu)于Thermo公司；膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶購(gòu)自Sigma公司；D NaseI購(gòu)自上海生工公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；培養(yǎng)皿、離心管均購(gòu)自Corning公司；PBS緩沖液購(gòu)自Solarbio公司。

1.1.3 試驗(yàn)器材

體視顯微鏡(Nikon SMZ-1000)，高速離心機(jī)(Eppendorf)，自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(SANYO)，精子分析儀(SCA)，超凈工作臺(tái)(哈東聯(lián))，精子采集板(Barcelona)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬睪丸支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將豬睪丸組織放入培養(yǎng)皿中，在PBS緩沖液中去除白膜及表面血管，并用PBS洗滌3次；加入0.1%膠原酶Ⅳ 1 mL和透明質(zhì)酸酶1 mL置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中消化5 min后終止消化，1 200 r/min離心5 min，棄上清；加1 mL胰酶和1 mL DNase酶吹打混勻，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中消化4 min，每隔2 min用手劇烈震蕩一次，加入等體積培養(yǎng)液終止消化，依次通過(guò)80目、200目及300目細(xì)胞篩過(guò)篩得到細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄上清液；加入新的培養(yǎng)液，分皿，置于培養(yǎng)箱，2 h后棄上清液，加入PBS洗滌3次，加入新的培養(yǎng)液培養(yǎng)；10 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的獲取方法

將分離培養(yǎng)的豬睪丸支持細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，48 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞呈梭形且基本鋪滿6 cm培養(yǎng)皿時(shí)開(kāi)始收集培養(yǎng)液至離心管中，每隔24 h收集1次，-20 ℃保存。

1.2.3 精子活力分析

利用精子分析儀和精子活力檢測(cè)板測(cè)定對(duì)照組和培養(yǎng)液組精子活力。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法，參數(shù)設(shè)置為：P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬睪丸支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

如圖1所示，豬睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)后2 h貼壁生長(zhǎng)，形狀呈圓形(圖1A)，10 h后逐漸呈三角形(圖1B)，60 h后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙縮小(圖1C)。

圖1 豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)圖(200×) Fig.1 Porcine testis Sertolicular cell culture diagram (200×)

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后培養(yǎng)液對(duì)精子活力的影響

由圖2所示：將睪丸支持細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，分別間隔1 h、8 h和24 h獲取其細(xì)胞培養(yǎng)液，使用精子分析儀測(cè)量對(duì)照組與培養(yǎng)液組精子活力。結(jié)果為間隔1 h獲取的細(xì)胞培養(yǎng)液使精子活力提高最多，為47.47%±0.53%，顯著高于對(duì)照組39.63%±0.94%(P<0.01)，間隔8 h培養(yǎng)液組的精子活力41.43%±0.93%，與對(duì)照組的差異不顯著，間隔24 h培養(yǎng)液組的精子活力43.63%±0.80%，與對(duì)照組差異不顯著。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間獲得的培養(yǎng)液對(duì)精子活力的影響Fig.2 The effect of culture medium obtained at different time of cell culture on sperm motility注：與對(duì)照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)精子活力的影響

根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，精子運(yùn)動(dòng)分為4個(gè)等級(jí)：a級(jí)表示精子快速直線前向運(yùn)動(dòng)，直線運(yùn)動(dòng)(紅色)；b級(jí)表示精子緩慢或呆滯向前移動(dòng)，緩慢運(yùn)動(dòng)(綠色)；c級(jí)表示精子非向前運(yùn)動(dòng)，原地運(yùn)動(dòng)(藍(lán)色)；d級(jí)表示精子不能活動(dòng)，不運(yùn)動(dòng)(黃色)。

試驗(yàn)分為對(duì)照組與培養(yǎng)液組，使用精子分析儀測(cè)定精子的前進(jìn)性、速度值以及WHO標(biāo)準(zhǔn)所測(cè)得的運(yùn)動(dòng)情況，對(duì)精子活力進(jìn)行比較。由圖3與表1所示：快速向前運(yùn)動(dòng)的精子由8.8%±0.28%增加到11.9%±0.35%，慢速向前運(yùn)動(dòng)的精子由35.5%±1.03%增加到39.0%±1.07%，極慢或不動(dòng)的精子數(shù)量由31.6%±2.73%下降到24.8%±1.35%。精子活力由44.3%±1.06%增加到50.9%±2.44%，差異極顯著。

A.對(duì)照組檢測(cè)圖像；B.培養(yǎng)液組檢測(cè)圖像。圖3 睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)精子活力的影響 Fig.3 The effect of Sertoli cell culture medium on sperm motility

表1 根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定精子活力Table 1 Determination of sperm motility according to WHO standard

2.4 精子活力差異性分析

由圖4所示：利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)論：培養(yǎng)液組精子活力為50.9%±2.44%，顯著高于對(duì)照組44.3%±1.06%(P<0.01)。

圖4 精子活力的差異性分析圖Fig.4 Analysis of differences in sperm motility注：與對(duì)照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

由于精子正常的運(yùn)動(dòng)能力可以使得受精過(guò)程順利進(jìn)行，所以正確評(píng)估精子活力具有非常重要的意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在大鼠常規(guī)運(yùn)動(dòng)的精子中發(fā)現(xiàn)無(wú)活力的精子不具有受精能力，在人和其他物種中，精子活力下降也會(huì)導(dǎo)致生殖能力降低[7]。對(duì)于死精子癥，精子活力低，在導(dǎo)致雄性不育的精液異常中所占比例約15%，內(nèi)分泌異常、附睪功能受損以及精漿酸堿度異常、精子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、生殖道感染等原因都會(huì)引起精漿質(zhì)量的下降[8]。正常精子的生存能力和受精能力的指標(biāo)之一就是具有足夠數(shù)目的前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子，另外其精子活力也與雌性受胎率密切相關(guān)，所以本試驗(yàn)使用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)對(duì)豬精子活力進(jìn)行了檢測(cè)并利用睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)豬精子質(zhì)量進(jìn)行提升。

支持細(xì)胞可以通過(guò)其強(qiáng)大的分泌功能發(fā)揮它的調(diào)節(jié)作用。譚琨等[9]指出成熟支持細(xì)胞的數(shù)量與精子總數(shù)呈正比，而且它們?cè)谛螒B(tài)和功能上相輔相成，這說(shuō)明睪丸支持細(xì)胞分泌物濃度對(duì)精子的品質(zhì)有一定影響。這與本試驗(yàn)中豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)1 h后獲取的培養(yǎng)液對(duì)精子活力的影響顯著高于對(duì)照組一致。Marh等[10]將小鼠精母細(xì)胞與支持細(xì)胞共培養(yǎng)，可以讓早期的生殖細(xì)胞產(chǎn)生具有受精能力的精子，間接證明支持細(xì)胞的分泌物可促進(jìn)生殖細(xì)胞的增值與分化。

在豬的繁育方面我國(guó)的繁育人員一直在努力提高豬的生產(chǎn)能力及其所能產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)于豬的稀釋液來(lái)說(shuō)，主要分為兩種：含緩沖鹽的稀釋液與不含緩沖鹽的稀釋液。含緩沖鹽的冷凍稀釋液主要包括以下類型：甘氨酸-磷酸和葡萄糖-磷酸、卵黃-葡萄糖-檸檬酸。Yesth[11]稱,精子在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的某種物質(zhì)會(huì)使稀釋液中的pH值產(chǎn)生變化,這會(huì)對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生不利影響,而含緩沖鹽的冷凍稀釋液中的檸檬酸、甘氨酸-磷酸等緩沖物質(zhì)可將精液pH值調(diào)整為適宜的偏堿性環(huán)境,這種含有緩沖鹽的稀釋液對(duì)于精液有一定的保護(hù)作用。豬精液稀釋液的另一組成成分是冷凍保護(hù)劑。Zeng等[12]研究結(jié)果顯示,2%和3%的GLY具有最佳的抗細(xì)胞凋亡作用,且B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2及其同源蛋白的表達(dá)對(duì)精子凋亡來(lái)說(shuō)影響較大。在本試驗(yàn)中，向豬精子體外添加睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液可使精子活力提高，說(shuō)明支持細(xì)胞的分泌物可促進(jìn)精子的活力，這可能是支持細(xì)胞分泌的酶類或生長(zhǎng)因子對(duì)精子活力起了關(guān)鍵作用，但具體的機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用在體外添加豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液的方式提高了精子活力，探究出一種提升豬人工授精效率的新方法，利用這種新方法可充分發(fā)揮優(yōu)良種公豬的遺傳潛力,減少種公豬養(yǎng)殖成本,提高其品質(zhì)培育改良水平,降低傳播疾病的概率。本試驗(yàn)中豬睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液能夠提高豬精子活力的機(jī)制雖有很多不同觀點(diǎn)，但具體機(jī)制有待繼續(xù)探究和探討。