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      建昌幫附子在甘草附子湯中單酯型生物堿含量比較研究*

      2022-10-11 13:01:02
      關(guān)鍵詞:單酯煎液全方

      蘇 慧

      (江西中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校工程中心,江西 撫州 344000)

      附子,又名烏頭或附片,為毛茛科、烏頭屬植物多年生草本子根的加工品。附子屬溫里藥,為中藥“回陽救逆第一品”,臨床上廣泛用于陽虛寒凝證,但生附子有毒,因此臨床上通常采用加工炮制減毒后的附子[1]。甘草附子湯源自《傷寒雜病論》,又名四物附子湯,由炙甘草、黑順片、白術(shù)和桂枝4味中藥組成,是治療風(fēng)濕兼陽虛證的代表方劑之一[2]?!敖ú龓汀睂儆凇敖魉帋汀保嬈谥频墓ぞ?、輔料、工藝等獨(dú)具本幫傳統(tǒng)風(fēng)格,采用煨制、蒸制、炒制及烤制法將附子加工成煨附子、淡附子、陰附子和陽附子,適應(yīng)各種臨床需要,盛譽(yù)業(yè)界[3,4]。

      附子中化學(xué)成分主要為生物堿類,現(xiàn)從烏頭屬生物堿中分離出來的已知化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是二萜類生物堿,其中單雙酯型生物堿為當(dāng)前研究最多的一類生物堿[5]?!吨腥A人民共和國藥典》[6]以烏頭堿新、烏頭堿、次烏頭堿3個(gè)雙酯型生物堿總量評(píng)價(jià)附子毒性,以苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿3個(gè)單酯型生物堿總量評(píng)價(jià)其有效性?,F(xiàn)代研究多集中于甘草附子湯中化學(xué)成分及臨床應(yīng)用的研究,對(duì)不同附子炮制品規(guī)格在復(fù)方湯劑生物堿含量差異的研究未見報(bào)道,但附子不同炮制品規(guī)格與臨床療效密切相關(guān),臨床上可合理炮制削減附子毒性來滿足臨床需求。

      實(shí)驗(yàn)選取建昌幫附子(煨附子、淡附子、陰附子、陽附子)及臨床上使用最多的黑順片為研究對(duì)象,參照《傷寒論》的煎煮方法,分別制備甘草附子湯,以單酯型生物堿總量為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)建昌幫附子及黑順片在甘草附子湯中單酯型生物堿含量進(jìn)行了比較,從其有效成分含量的角度研究附子不同炮制品規(guī)格對(duì)甘草附子湯的影響,為甘草附子湯的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

      1 儀器與材料

      1.1 儀器 Agilent1260 Ⅱ型高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器,安捷倫科技有限公司),PWN124型萬分之一分析天平(奧克斯儀器有限公司),Smart-N15UV型超純水機(jī)[美國密理博(Millipore)有限公司],Strike300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司)。

      1.2 試劑 除乙腈為色譜純?cè)噭?TEDIA),其余試劑均為分析純;對(duì)照品:苯甲酰新烏頭堿(MUST21022704)、苯甲酰次烏頭堿(MUST21031111)、苯甲酰烏頭堿(MUST22042014)純度≥98%,購自曼斯特(成都)生物科技有限公司;黑順片購于四川江油飲片廠,炙甘草購于江西德惠中藥飲片有限公司,桂枝購于江西彭氏國藥堂飲片有限公司,白術(shù)購于江西同善堂中藥飲片有限公司;建昌幫煨附子、淡附子、陰附子、陽附子由江西中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校中藥炮制團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)制備。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 成品外觀性狀比較 抽取建昌幫附子與黑順片,于自然光下觀察其成品外觀性狀,結(jié)果顯示,煨附子:呈灰棕色半透明,不規(guī)則卵圓形薄中片;陰附子:呈棕黃色半透明,不規(guī)則卵圓形薄片;陽附子:呈白黃色不規(guī)則卵圓形厚片,表面不平整,斷面鼓起;淡附子:呈灰白色不規(guī)則卵圓形極薄片;黑順片:外皮黑褐色。見圖1。

      A煨附子;B陰附子;C陽附子;D淡附子;E黑順片圖1 建昌幫附子和黑順片外觀性狀圖

      2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苯甲酰新烏頭堿(Benzoylmesaconine,BM)、苯甲酰次烏頭堿(Benzoylhypaconine,BH)對(duì)照品1 mg,分別用0.05%鹽酸-甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單一成分的溶液,即得。

      2.3 供試品溶液的制備 甘草附子湯煎劑的制備參考《傷寒論》,分別稱取5份(甘草6 g,桂枝12 g,白術(shù)6 g),其中再分別加入6 g樣品,依次為煨附子、陰附子、陽附子、淡附子、黑順片,加10倍蒸餾水浸泡30 min,微沸提取2次,提取時(shí)間分別為60 min和40 min,合并提取液后,雙層紗布過濾,將過濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶中并定容至250 mL,精密量取100 mL旋轉(zhuǎn)蒸干,殘?jiān)眉状? mL、氨水8 mL、三氯甲烷40 mL混合液溶解,加熱回流2 h,放冷濾過。濾液60 ℃水浴蒸干,移至10 mL容量瓶中用0.05%鹽酸-甲醇溶解,進(jìn)樣前提取液用微孔濾膜過濾。

      2.4 陰性供試品溶液的制備 稱取甘草6 g,桂枝12 g,白術(shù)6 g,按照2.3項(xiàng)下制備,即得陰性供試品溶液。

      2.5 高效液相色譜法工作條件 檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm;Agilent C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A:20 mmoL/L乙酸銨,流動(dòng)相B:乙腈∶甲醇(1∶1);洗脫程序:0~10 min,95%~80%A;10~20 min,80%~70%A;20~35 min,70%~55%A。柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

      2.6 色譜分析 吸取混合BM、BH的對(duì)照品溶液、甘草附子湯全方煎液(煨附子、陰附子、陽附子、淡附子、黑順片)、陰性供試品溶液,色譜分析結(jié)果見圖2。

      A陰性供試品;B煨附子;C陰附子;D陽附子;E黑順片;F淡附片;G 1:BM對(duì)照品、2:BH對(duì)照品圖2 甘草附子湯高效液相色譜圖

      2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

      2.7.1 線性關(guān)系 用0.05%鹽酸-甲醇稀釋,得一系列濃度BM、BH對(duì)照品溶液,根據(jù)峰面積積分和對(duì)應(yīng)濃度的XY軸數(shù)據(jù),得BM在2.5~110.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=7.2343X+3.9492,r=0.9999;BH在2.0~15.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程;Y=15.187X+1.1457,r=0.9998。數(shù)據(jù)顯示,BM、BH對(duì)應(yīng)濃度和峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

      2.7.2 精密度 吸取10 μL BM、BH對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6針,測(cè)得BM峰面積RSD為0.79%,出峰時(shí)間RSD為0.04%;BH峰面積RSD為0.36%,出峰時(shí)間RSD為0.82%。結(jié)果表明,方法精密度良好。

      2.7.3 重復(fù)性 制備陰附子全方煎液6份,結(jié)果測(cè)得BM的分離時(shí)間RSD為0.07%,峰面積RSD為1.19%;BH的分離時(shí)間RSD為0.04%,峰面積RSD為2.77%。表明該方法重復(fù)性良好。

      2.7.4 穩(wěn)定性 取陰附子全方煎液,室溫條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果測(cè)得BM的分離時(shí)間RSD為0.06%,峰面積RSD為2.31%;BH的分離時(shí)間RSD為0.05%,峰面積RSD為2.58%。表明陰附子全方煎液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

      2.7.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的陰附子供試品液,分別加入適量的BM、BH對(duì)照品溶液,平行操作3次,進(jìn)行加樣后的提取和回收。各組分的回收率見表1,BM的加樣回收率在99.41%~103.18%,BH的加樣回收率在102.53%~102.94%,說明該方法較為可靠。

      表1 陰附子供試品液中BM、BH加樣回收數(shù)據(jù)

      2.7.6 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取建昌幫附子(煨附子、陽附子、淡附子、陰附子)和黑順片,各平行制備甘草附子湯全方煎液3份,測(cè)定煎煮液中BM、BH含量,見表2。

      表2 甘草附子湯中單酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果

      3 討論

      大多數(shù)生物堿是以鹽的形式存在于中藥中,生物堿鹽溶于水且不溶于有機(jī)試劑,考慮甘草附子湯蒸發(fā)干后需用有機(jī)試劑溶解,所以實(shí)驗(yàn)加熱回流中加入氨水使其轉(zhuǎn)為游離態(tài)生物堿,方便測(cè)定甘草附子湯中單酯型生物堿。鹽酸可以抑制單酯型生物堿水解,所以BM、BH對(duì)照品溶液溶劑選擇加入0.05%鹽酸。

      分析甘草附子湯單酯型生物堿時(shí),分別考察了有機(jī)相為甲醇、乙腈及二者混合3種流動(dòng)相,結(jié)果顯示,乙腈∶甲醇(1∶1)分離效果較好。因甘草附子湯單酯型生物堿為弱堿性樣品,考慮在水相中加入乙酸銨,增加單酯型生物堿在柱子中分析的保留時(shí)間。結(jié)果顯示,水相加入20 mmoL/L乙酸銨后,譜圖分離效果明顯改善,且峰分布均勻,故選擇乙腈∶甲醇(1∶1)-20 mmoL/L乙酸銨為流動(dòng)相。

      《中華人民共和國藥典》采用3個(gè)單酯型生物堿總量評(píng)價(jià)其附子有效性,雙酯型生物堿不耐高溫,在附子湯中雙酯型生物堿可轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿。因此實(shí)驗(yàn)以單酯型生物堿總量為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)建昌幫附子及黑順片在甘草附子湯中單酯型生物堿含量進(jìn)行了比較研究,但苯甲酰烏頭堿在檢測(cè)中含量較低,未被檢測(cè)到,所以并未對(duì)苯甲酰烏頭堿進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示,不同附子炮制方法會(huì)影響其在甘草附子湯中的單酯型生物堿成分含量,還會(huì)影響附子成品外觀和顏色,在5種炮制品甘草附子湯全方煎液中,采用煨制法制備的煨附子全方煎液?jiǎn)熙バ蜕飰A成分含量最高,采用膽水浸泡后硫熏制備的黑順片全方煎液?jiǎn)熙バ蜕飰A成分含量最低,符合建昌幫藥幫炮制附子的目的,表明建昌幫附子替代甘草附子湯中黑順片的可行性。

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