基于化學(xué)模式識別和熵權(quán)TOPSIS法分析木棉花不同部位的差異

曾昭君，余欣彤，鄧成程，黎桃敏，史龍梅，張?zhí)m蘭，劉燎原*

1廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，佛山 528244；2湖南一方天江藥業(yè)有限公司，常德 415000；3隴西一方制藥有限公司，定西 748000

木棉花為木棉科植物木棉Gossampinusmalabarica(DC.) Merr.的干燥花，性涼，歸大腸經(jīng)，具有清熱利濕，解毒的功效，常用于泄瀉、痢疾、痔瘡、出血等病癥[1]。木棉花資源豐富，廣泛分布于我國云南、海南、廣西、廣東、臺灣等地區(qū)，一般于春季花盛開時采收[2]?，F(xiàn)代研究表明，木棉花含有豐富的黃酮類、苯丙素類及酚酸類等化合物，其中黃酮類化合物芒果苷、蘆丁等在肝損傷、心肌缺血再灌注損傷、肺癌等疾病的治療方面具有良好療效；酚酸類化合物有較強的DPPH自由基清除活性，原兒茶酸在糖尿病方面具有潛在的降血糖作用[3-5]。目前，關(guān)于木棉花藥材顯微鑒別、薄層鑒別、芒果苷含量測定的研究較多，但有關(guān)木棉花HPLC指紋圖譜及其不同部位的質(zhì)量差異研究卻鮮見報道[6]。

僅從單一化學(xué)成分去評價木棉花藥材的質(zhì)量存在一定的局限性，通過中藥指紋圖譜與化學(xué)計量學(xué)的有機結(jié)合，可整體反映木棉花化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性，系統(tǒng)表征木棉花不同部位的質(zhì)量差異。熵權(quán)優(yōu)劣解距離(TOPSIS)法通過對多指標進行合理賦權(quán)得到一個綜合指標，以距離理想化目標的程度為基準進行綜合評價，可有效避免主觀因素對木棉花內(nèi)在質(zhì)量評價的影響，具有一定的準確性和科學(xué)性[7，8]。本研究建立木棉花藥材及其不同部位(花瓣、花萼、雄蕊)的HPLC指紋圖譜，采用相似度評價、熱圖聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析方法對木棉花不同部位指紋圖譜進行質(zhì)量評價，并結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法對木棉花不同部位的質(zhì)量進行綜合評分排序，旨在為木棉花藥材多指標成分富集部位、資源開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，為其質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(德國Merck公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)。

1.2 材料

原兒茶酸(批號：110809-201906，質(zhì)量分數(shù)：97.7%)、芒果苷(批號：111607-201704，質(zhì)量分數(shù)：98.1%)、蘆丁(批號：100080-201811，質(zhì)量分數(shù)：91.7%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸對照品(批號：wkq18030107，質(zhì)量分數(shù)：≥98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)；磷酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水，其余試劑均為分析純。15批木棉花藥材(編號：Y1～Y15)經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》(一部)木棉花項下要求，產(chǎn)地信息見表1。將每批藥材根據(jù)不同部位分為三類，得木棉花花瓣(編號：B1～B15)、花萼(編號：E1～E15)、雄蕊(編號：R1～R15)。

表1 15批木棉花樣品產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Xselect HSS T3 Column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%→10% A；15～30 min，10%→17% A；30～40 min，17%→18% A；40～41 min，18%→5% A；41～45 min，5% A)；柱溫為25 ℃；檢測波長為230 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別取原兒茶酸、新綠原酸、芒果苷、蘆丁對照品適量，精密稱定，置5 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為84.80、43.10、41.59、48.51 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末(過三號篩)約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取木棉花藥材供試品溶液(Y10)，按“2.1”項下色譜條件進樣測定6次，以7號色譜峰芒果苷為參照峰(S)，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD范圍分別為0.03%～0.16%、0.41%～1.27%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗

取木棉花藥材粉末(Y10)6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以7號色譜峰芒果苷為參照峰(S)，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD范圍分別為0.03%～0.09%、0.51%～2.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取木棉花藥材粉末(Y10)適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以7號色譜峰芒果苷為參照峰(S)，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD范圍分別為0.12%～0.26%、0.11%～2.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

2.5.1 指紋圖譜的建立

取15批木棉花藥材及其不同部位樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》，分別以Y1、B1、E1、R1號樣品的色譜圖為參照圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，采用多點校正進行色譜峰匹配，中位數(shù)法分別生成相應(yīng)的對照指紋圖譜D、D1、D2、D3。通過與混合對照品溶液色譜圖比對，指認了4個成分，其中峰2為原兒茶酸，峰3為新綠原酸，峰7為芒果苷，峰13為蘆丁。以7號色譜峰芒果苷為參照峰(S)，15批木棉花藥材及其不同部位的HPLC指紋圖譜見圖1～4。結(jié)果表明，不同部位樣品HPLC指紋圖譜的共有峰數(shù)量存在差異，其中3批海南產(chǎn)地木棉花花瓣的峰4、6、7均丟失，其雄蕊的峰4也丟失；6批云南、1批廣西產(chǎn)地木棉花花瓣的峰6丟失，提示木棉花藥材不同部位之間化學(xué)成分存在一定差異。

圖1 15批木棉花藥材HPLC指紋圖譜及共有對照指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of Gossampim Flos

圖2 15批木棉花花瓣HPLC指紋圖譜及共有對照指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of petals of Gossampim Flos

圖3 15批木棉花花萼HPLC指紋圖譜及共有對照指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of calyxs of Gossampim Flos

2.5.2 相似度評價

計算15批木棉花藥材不同部位HPLC指紋圖譜與各自對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表2。不同批次木棉花花萼與相應(yīng)對照指紋圖譜相似度均大于0.998，表明木棉花花萼質(zhì)量較穩(wěn)定，各批次間化學(xué)成分差異較小。以木棉花藥材的對照指紋圖譜(D)為參照圖譜，計算木棉花藥材不同部位對照指紋圖譜(D1、D2、D3)的相似度，結(jié)果見表3。木棉花藥材與花萼的相似度為0.976，提示不同批次木棉花藥材與花萼化學(xué)成分相似，化學(xué)成分整體差異較??；木棉花藥材與花瓣、雄蕊的相似度均較低，提示木棉花藥材不同部位的化學(xué)成分存在較大差異。

圖4 15批木棉花雄蕊HPLC指紋圖譜及共有對照指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of stamens of Gossampim Flos

表2 15批木棉花藥材不同部位HPLC指紋圖譜的相似度結(jié)果

表3 對照指紋指紋圖譜的相似度結(jié)果

2.6 化學(xué)模式識別研究

2.6.1 熱圖聚類分析

以15批木棉花藥材不同部位HPLC指紋圖譜中各特征峰的單位峰面積為變量，采用對數(shù)歸一化法，以Educlidean平方距離為度量標準，運用Heml 1.0軟件進行熱圖聚類分析(空白處標記為色譜峰丟失)[7](見圖5)。熱圖分析以一種漸進的藍紅色將結(jié)果直觀展現(xiàn)出來，其顏色代表歸一化后的值，值越高顏色越紅，值越低顏色越藍，用于反映研究對象化學(xué)成分的差異變化[9,10]。熱圖分析結(jié)果顯示，木棉花藥材不同部位的峰7、8、12、13成分含量差異較大，主要表現(xiàn)為花萼的峰7、8顏色偏暖，表明其含量較高；花瓣的峰12、13顏色偏暖，表明其含量較高；花萼各特征峰顏色整體比花瓣、雄蕊的偏暖，提示木棉花化學(xué)成分主要富集在花萼；不同批次木棉花藥材不同部位各特征峰色差較大，提示木棉花藥材的化學(xué)成分含量與其產(chǎn)地環(huán)境存在相關(guān)關(guān)系。聚類分析結(jié)果顯示，15批木棉花藥材不同部位呈現(xiàn)一定的聚類特征，主要分為Ⅰ和Ⅱ兩類，第Ⅰ類為花瓣和雄蕊，第Ⅱ類為花萼，提示木棉花藥材不同部位質(zhì)量存在顯著差異，花瓣和雄蕊的質(zhì)量一致性更高，花萼是木棉花的主要差異性部位，與熱圖分析結(jié)果一致。

圖5 木棉花藥材不同部位熱圖和聚類分析圖Fig.5 Heat map and cluster analysis of different parts of Gossampim Flos

2.6.2 主成分分析

以15批木棉花藥材不同部位HPLC指紋圖譜中各特征峰的單位峰面積為變量，以特征值及累計方差貢獻率為依據(jù)，采用SPSS 20.0軟件進行主成分分析(色譜峰丟失標記為0)[11,12]。KMO值為0.782>0.7，Bartlett檢驗P<0.01，表明實驗數(shù)據(jù)適合進行主成分分析。以特征值大于1為標準提取到4個主成分，其累計貢獻率為91.009%，說明提取的4個主成分是評價木棉花藥材不同部位質(zhì)量的代表性成分。以前2個主成分建立坐標系，得到15批木棉花藥材不同部位的主成分得分圖(見圖6)。木棉花藥材的不同部位樣品明顯分布于2個區(qū)域，花瓣與雄蕊聚為一類，花萼單獨聚為一類，與聚類分析結(jié)果一致?；ㄝ鄻悠贩植驾^分散，提示不同批次、不同產(chǎn)地之間花萼的質(zhì)量存在一定差異。PCA得分圖可區(qū)分花萼，但花瓣和雄蕊存在相互重合的情況，沒有得到有效的區(qū)分，且無法確定差異性成分，故采用OPLS-DA法對樣品進行分析[13]。

圖6 木棉花藥材不同部位主成分得分圖Fig.6 Principal component score of different parts of Gossampim Flos

2.6.3 正交偏最小二乘法判別分析

為了進一步篩選對木棉花藥材不同部位質(zhì)量產(chǎn)生影響貢獻較大的成分，采用SMICA-P 14.0軟件分別對15批木棉花藥材不同部位HPLC指紋圖譜中的各特征峰的單位峰面積進行OPLS-DA分析[14,15]，木棉花藥材不同部位OPLS-DA得分圖(見圖7)，并生成差異性標記物的變量重要性投影值(VIP)圖(見圖8)。模型的數(shù)據(jù)矩陣的模型解釋率R2X=0.963，區(qū)分參數(shù)R2Y=0.937，預(yù)測參數(shù)Q2=0.912，均大于0.50，表明該數(shù)學(xué)模型的擬合能力和預(yù)測能力較好?？梢娔久藁ㄋ幉牡牟煌课粯悠肪擅黠@區(qū)分，各自聚為一類，提示木棉花藥材不同部位差異顯著。以VIP值大于1作為標準篩選，貢獻率依次由大到小的7個變量為：峰8(VIP=1.23)、芒果苷(VIP=1.22)、峰13(VIP=1.19)、峰6(VIP=1.17)、新綠原酸(VIP=1.07)、峰5(VIP=1.05)、蘆丁(VIP=1.03)。提示這些成分是木棉花藥材不同部位之間化學(xué)成分差異的主要標記物，對其質(zhì)量差異的影響較大。

圖7 木棉花藥材不同部位OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA scores of different parts of Gossampim Flos

圖8 木棉花藥材不同部位VIP圖Fig.8 VIP diagram of different parts of Gossampim Flos

2.7 熵權(quán)TOPSIS法分析

對15批木棉花藥材不同部位HPLC指紋圖譜中各特征峰的單位峰面積進行熵權(quán)TOPSIS法分析，依次建立各樣品的初始決策矩陣、標準化決策矩陣，計算得到各項指標的熵值ej=(1.440、1.393、1.361、1.404、1.309、1.265、1.088、1.175、1.382、1.340、1.370、1.339、1.274)；權(quán)重wj=(0.106、0.095、0.087、0.098、0.075、0.064、0.021、0.042、0.092、0.082、0.089、0.082、0.066)。根據(jù)加權(quán)決策矩陣得到最優(yōu)方案Zj+=(0.106、0.095、0.087、0.098、0.075、0.064、0.021、0.042、0.092、0.082、0.089、0.082、0.066)，最劣方案Zj-均為0。計算15批木棉花藥材不同部位與最優(yōu)方案的距離(D+)、與最劣方案的距離(D-)及最優(yōu)解的歐氏貼近度(Ci)，見表4。D+越小、D-越大、Ci越大，則被評價樣品越優(yōu)[16,17]。由表4知，15批花瓣、花萼、雄蕊的Ci平均值分別為0.416、0.485、0.388，提示花萼質(zhì)量最優(yōu)，花瓣次之，雄蕊末之。花瓣、花萼、雄蕊排名前三位的分別是B10、B11、B12，E10、E11、E12，R10、R11、R12，其產(chǎn)地均為云南省，提示該產(chǎn)地木棉花的質(zhì)量整體較優(yōu)，可作為優(yōu)良種質(zhì)資源進一步研究與開發(fā)。

表4 15批木棉花藥材不同部位質(zhì)量評價結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究在對色譜條件進行考察時發(fā)現(xiàn)，當檢測波長為300 nm時，部分黃酮類化合物色譜峰不存在相應(yīng)的紫外吸收；當檢測波長為255 nm時，各色譜峰響應(yīng)值相差較大，芒果苷色譜峰響應(yīng)較高，部分色譜峰吸收較小或丟失；當檢測波長為230 nm時，各色譜峰信號響應(yīng)值均較高，基線較平穩(wěn)，故采用230 nm為檢測波長。同時，還對不同提取方式(超聲、回流)、提取溶媒(甲醇、50%甲醇、70%甲醇)、溶媒用量(15、25、50 mL)和提取時間(30、45、60 min)進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用“2.3”項下方法制備的供試品溶液各色譜峰分離度較好、組分含量較高。

研究結(jié)果表明，木棉花藥材與花萼的相似度較高，花瓣與雄蕊的相似度較為接近。熱圖聚類分析結(jié)果表明，花瓣和雄蕊的質(zhì)量一致性更高，木棉花化學(xué)成分主要富集在花萼，與相似度結(jié)果一致。CA和PCA結(jié)果顯示，二者均可明確表征花萼與花瓣、雄蕊樣品之間存在顯著差異，花瓣與雄蕊間差異相對較小。結(jié)合OPLS-DA分析，可以較好地將木棉花花瓣、花萼、雄蕊完全區(qū)分，峰8、芒果苷、峰13、峰6、新綠原酸、峰5、蘆丁為三者之間的差異性化合物，可作為區(qū)分木棉花藥材不同部位的指標性成分。同時結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法，對15批木棉花藥材不同部位的各特征峰賦權(quán)，根據(jù)Ci值對木棉花藥材不同部位樣品進行排序，能實現(xiàn)對木棉花藥材整體控制以及優(yōu)質(zhì)種源篩選。研究結(jié)果顯示，云南省木棉花樣品Ci均值均高于其余產(chǎn)地樣品，且花萼質(zhì)量更優(yōu)。

綜上，本研究建立的木棉花藥材及其不同部位HPLC指紋圖譜檢測方法穩(wěn)定可靠，通過化學(xué)模式識別和熵權(quán)TOPSIS法，對木棉花藥材及其不同部位的HPLC指紋圖譜進行分析評價，可全面、綜合、系統(tǒng)地對樣本進行質(zhì)量評價和差異分析，從而比較不同部位的化學(xué)成分差異，明確化學(xué)成分的分布規(guī)律，為木棉花藥材的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。