練冬梅 賴正鋒 姚運法

摘要：以玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa Linnaeus）花瓣和花萼為研究對象，采用Illumina HiseqTM 2500高通量測序技術，對花瓣和花萼進行轉(zhuǎn)錄組測序及花青素合成相關基因差異表達分析。結果表明，花瓣和花萼共獲得13.94 Gb有效數(shù)據(jù)（clean data），Q30堿基百分比均達到93.0%以上;共獲得1 399個差異表達基因（DEGs），包括65個上調(diào)基因，1 334個下調(diào)基因，且功能注釋的基因有1 176個;篩選出了與花青素合成相關結構基因CHI、FLS、ANR、CHI在花萼中表達顯著，F(xiàn)LS、ANR在花瓣中表達顯著。本研究豐富了花青素相關研究，可為闡明玫瑰茄花青素合成機制提供理論依據(jù)。

關鍵詞：玫瑰茄;花瓣;花萼;轉(zhuǎn)錄組;花青素;差異表達基因

中圖分類號： Q786;S681.901? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0041-05

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.）為錦葵科木槿屬一年生草本植物，別稱洛神花（roselle、gongura）、芙蓉茄、山茄子、紅果梅、蘇丹茶、美麗納等。原產(chǎn)西非至南亞，廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，玫瑰茄在臺灣、廣西、廣東、福建和云南等南部地區(qū)均有栽培。玫瑰茄2004年被衛(wèi)生部和衛(wèi)計委列入新食品原料名單[1]，是一種藥食兩用的植物。玫瑰茄花重要部位花瓣（亮黃色）和花萼（紫紅色）具有藥用功能，均是具有重要開發(fā)價值的器官，富含花青素、黃酮、多酚酸、有機酸等營養(yǎng)成分，花瓣部位主要用于開發(fā)花茶，而花萼部位利用率最高，已廣泛用于制作玫瑰茄醬[2]、飲料[3]、酸奶[4]、果酒[5]等，在食品工業(yè)中被用作著色、調(diào)味添加劑;花萼具有利尿、抗氧化、抗癌、降血壓、降血脂和降血糖等保健功能[6-9]，在玫瑰茄保健品開發(fā)方面具有巨大潛力。當前，國內(nèi)對玫瑰茄研究主要集中在栽培技術、化學成分及功效分析、玫瑰茄花青素及玫瑰茄產(chǎn)品加工技術上，但其理論基礎研究還很薄弱，例如玫瑰茄花青素合成相關代謝途徑的研究尚屬空白。

花青素是構成植物顏色的主要水溶性色素之一，屬于類黃酮，主要以糖苷的形式存在于植物液泡中[10]，迄今從自然界分離和鑒定出的花青素苷多達600種，主要從矢車菊素苷元（cyanidin）、飛燕草素苷元（delphinidin）、天竺葵素苷元（pelargonidin）、芍藥花素苷元（peonidin）、矮牽牛素苷元（petunidin）、錦葵素苷元（malvidin）等6種花青素苷元衍生而來[11]。花青素苷合成始于苯丙氨酸，途經(jīng)多步酶促反應，主要由上游基因（CHS、CHI、F3H、F3′H和F3′5′H等）和下游基因（DFR、ANS、GT、AT和MT等）參與表達。研究表明，植物花青素兼具營養(yǎng)、藥理以及基因工程中改良花色等作用[12-14]。近年來，已有許多生物通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術完成了全轉(zhuǎn)錄功能基因組測序[15-16]。關于花青素合成相關基因在其他植物中也有相關研究[17-18]。玫瑰茄分子遺傳學與功能基因組學研究較落后，眾多玫瑰茄農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控機制仍不清楚，關聯(lián)轉(zhuǎn)錄組學是一種鑒定調(diào)控目標性狀候選基因的新方法。本研究利用Illumina HiseqTM 2500高通量測序技術對玫瑰茄花瓣、花萼進行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其花青素合成代謝途徑相關基因分析，探討玫瑰茄花瓣、花萼花青素合成機制和相關差異表達基因，以期為后續(xù)玫瑰茄相關研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玫瑰茄為福建省漳州市漳浦縣種植品種，種植地點位于福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗農(nóng)場，2017年6月15日種植，8月25日開始采集樣品。采集標準：分別采集同一株玫瑰茄的花蕾（開花前一天09：00采集）10朵，共3株，將花蕾的花瓣和花萼分離后進行混合，立即用液氮速凍，置于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 高通量測序及數(shù)據(jù)組裝 采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒提取玫瑰茄花瓣、花萼的總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100技術檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性，構建cDNA文庫，再使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，用Illumina HiseqTM 2500進行高通量測序，獲得原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)過濾后去除其中的接頭序列及低質(zhì)量讀序（reads），獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)（clean data），用Trinity軟件對clean data進行組裝，組裝成為轉(zhuǎn)錄本序列（transcripts），將不同樣品組裝結果中多個可變剪接的transcripts聚類到一個基因，得到單基因序列（unigene）庫。

1.2.2 差異基因的功能注釋 使用BLAST軟件將Unigene與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、NOG、KEGG、Pfam等8個數(shù)據(jù)庫進行比對（E值≤10-5），獲得Unigene的注釋信息。

1.2.3 花青素合成相關差異基因分析 利用上述數(shù)據(jù)庫對玫瑰茄花瓣、花萼花青素合成進行檢索，分析花青素合成相關基因在KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋及代謝路徑。按照FPKM（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段）法計算差異基因的表達量，如果倍數(shù)變化（log2 Fold change）>0，認為是上調(diào)表達，反之，便認為是下調(diào)表達。

2 結果與分析

2.1 數(shù)據(jù)組裝及分析

玫瑰茄花瓣和花萼經(jīng)高通量測序和質(zhì)量控制，共獲得13.94 Gb clean data，其中花瓣clean data為7.29 Gb，花萼clean data為6.65 Gb，其Q30堿基百分比均達到93.0%以上，表明測序結果可靠，可用于后續(xù)的分析。對組裝結果進行統(tǒng)計（表1），總共產(chǎn)生72 029條單基因序列和148 309條轉(zhuǎn)錄本序列，N50（對一條染色體進行測序，將測序得到的reads進行拼接，當拼接的序列長度達到染色體長度的一半時，叫做N50長度）分別為1 010、1 274 bp，組裝完整性較高;其中長度區(qū)間位于 200～300 bp的Unigene數(shù)量最多，為24 697條，占34.29%。

2.2 Unigene功能注釋

為獲得Unigene的功能注釋信息，通過NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、NOG、GO、Pfam等8個數(shù)據(jù)庫進行注釋分析（表2），在72 029條Unigene中，共獲得44 887條（62.32%）Unigene的注釋。以上8個數(shù)據(jù)庫比對分析中，分別獲得44 274（61.47%）、27 510（38.19%）、15 908（22.09%）、10 438（14.49%）、23 790（33.03%）、40 386（56.07%）、20 981（29.04%）、25 191條（34.97%）Unigene功能注釋。

2.3 差異表達基因（DEGs）分析

通過對玫瑰茄花瓣和花萼差異基因的表達分析，共獲得1 399個DEGs，包括65個上調(diào)基因，1 334 個下調(diào)基因;將DEGs單基因序列分別注釋到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NOG、NR等8個數(shù)據(jù)庫中，共獲得1 176條基因功能注釋，其中COG數(shù)據(jù)庫267條，GO數(shù)據(jù)庫526條，KEGG數(shù)據(jù)庫285條，KOG數(shù)據(jù)庫562條，Pfam數(shù)據(jù)庫853條，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫773條，NOG數(shù)據(jù)庫1 066條，NR數(shù)據(jù)庫1 165條，其中NR數(shù)據(jù)庫注釋比最高，達99.06%。

2.3.1 GO功能注釋 對玫瑰茄花瓣和花萼的DEGs進行GO功能注釋，共分為三大類，分別為生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）。GO分類統(tǒng)計顯示，526條DEGs被歸到40個功能小類（表3）。生物學過程中DEGs在單一生物過程、細胞過程和代謝過程3個功能小類中分布數(shù)量最多;細胞組分中DEGs在細胞、細胞成分和膜結構3個功能小類中分布數(shù)量最多;分子功能中DEGs在催化活性和結合活性2個功能小類中分布數(shù)量最多。

2.3.2 COG功能注釋 在玫瑰茄花瓣和花萼的轉(zhuǎn)錄本中，將注釋到COG數(shù)據(jù)庫的267條DEGs進行直系同源分類，并獲得21個功能分類（圖1），差異基因注釋主要集中在R（一般性功能預測）、T（信號轉(zhuǎn)導機制）、K（轉(zhuǎn)錄）和L（復制、重組和修復）中。

2.3.3 KEGG功能注釋 將DEGs通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對（表4），有283個DEGs得到注釋，分別富集在64條代謝通路，其中涉及較多的是淀粉和蔗糖代謝（38個）、戊糖和葡萄糖醛酸互相轉(zhuǎn)化（35個）、植物病原體相互作用（24個）、甘油磷脂代謝（11個）、胞吞作用（11個）和苯丙素生物合成（10個）等。本研究著重選擇與花青素合成密切相關的代謝通路[類黃酮生物合成（5個）]，并找到與花青素代謝相關的差異基因。

2.4 花青素合成相關基因差異性分析

通過對玫瑰茄花瓣和花萼轉(zhuǎn)錄組測序結果進行功能注釋、功能分類及代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)（表5），花青素合成途徑中，查爾酮-黃烷酮異構酶（chalcone isomaerase，CHI）基因在玫瑰茄花萼中具有顯著表達優(yōu)勢，上調(diào)表達4.9倍，黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）、花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）基因則在玫瑰茄花瓣中具有顯著表達優(yōu)勢。這些差異表達基因參與著玫瑰茄花瓣和和花萼的花青素合成代謝途徑，影響著玫瑰茄花青素的合成。

3 討論

本研究通過Illumina HiSeqTM 2500高通量測序技術構建玫瑰茄花瓣和花萼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，比較分析花瓣和花萼數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)花青素合成相關代謝途徑中差異表達的基因。

玫瑰茄花瓣、花萼中花青素代謝表現(xiàn)：p-香豆酰-輔酶A（p-coumaroyl-CoA）和3分子丙二 醛- 輔酶A （3×Malnoyl-CoA）， 在查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）催化下，生成查爾酮（chalcone），查爾酮又在CHI作用下形成柚皮素（naringenin，NAR），此過程花萼中CHI基因表達比花瓣顯著，將大量查爾酮轉(zhuǎn)化成花青素合成代謝所必需的NAR;玫瑰茄花瓣、花萼中NAR在黃烷 酮-3-羥基化酶 （flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）催化下產(chǎn)生二氫山奈酚（dihydokaempferol，DHK），DHK分別在類黃 酮-3′-羥基化酶（flavonoid-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）和類黃酮-3′5′-羥基化酶（flavonoid-3′5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）作用下生成二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），DHK、DHQ和DHM在二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）作用下分別生成無色天竺葵苷元（leucopelargonidin）、無色矢車菊苷元（leucocyanidin）和無色飛燕草素苷元（leucodelphinidin），而后分別在花青素苷合成酶（anthocyanin synthase，ANS）作用下生成有色的天竺葵苷元（pelargonidin）、矢車菊苷元（cyanidin）和飛燕草素苷元（delphinidin），各種花青素苷元分別在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferases，GT）等作用下，生成穩(wěn)定的花青素苷。此過程中玫瑰茄花瓣中FLS和ANR基因顯著表達，進入黃酮醇代謝途徑和原花青素代謝途徑，說明FLS、ANR可能通過底物競爭方式影響花青素合成，而玫瑰茄花萼CHI上調(diào)表達，F(xiàn)LS和ANR下調(diào)表達，有利于花青素合成。本研究豐富了花青素相關研究，可為闡明玫瑰茄花青素合成機制提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]佚名. 衛(wèi)計委： 有關新食品原料，普通食品名單匯總[J]. 飲料工業(yè)，2014，17（8）：58-62.

[2]Adeleke T O，Ashsye O A. Quality attributes of stored Roselle jam[J]. Int Food Res，2009，16（3）：363-371.

[3]耿 華. 關于玫瑰茄飲料的試驗與研究[J]. 軟飲料工業(yè)，1996（1）：21-24.

[4]Iwalokun A B，Shittu M O. Effect of Hibiscus sabdariffa（Calyce）extract on biochemical and organoleptic properties of yogurt[J]. Pakistan Journal of Nutrition，2007，6（2）：172-182.

[5]孫軍濤，肖付剛，祝鑫冉. 玫瑰茄蘋果果酒的研制[J]. 釀酒科技，2015（2）：78-80.

[6]Hirunpanich V，Utaipat A，Morales N P，et al. Antioxidant effects of aqueous extracts from dried calyx of Hibiscus sabdariffa Linn. （Roselle） in vitro using rat low-density lipoprotein （LDL）[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2005，28（3）：481-484.

[7]Akim A，Ling L C，Rahmat A，et al. Antioxidant and anti-proliferative activities of Roselle juice on Caov-3，MCF-7，MDA-MB-231 and HeLa cancer cell lines[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology，2011，5（7）：957-965.

[8]Ubani C S，Joshua P E，Oraeki A N. Influence of aqeous extract of Hibiscus sabdariffa calyces on lipid profile of phenobarbitone induces wistar albinorats[J]. Journal of Pharmacy Research，2010（2）：319-324.

[9]Gosain S，Ircchiaya R，Sharma P C，et al. Hypolipidemic effect of ethanolic extract from the leaves of Hibiscus sabdariffa L. in hyperlipidemic rats[J]. Acta Poloniae Pharmaceutica，2010，67（2）：179-184.

[10]Fleschhut J，Kratzer F，Rechkemmer G，et al. Stability and biotransformation of various dietary anthocyanins in vitro[J]. European Journal of Nutrition，2006，45（1）：7-18.

[11]Kong J M，Chia L S，Goh N K，et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry，2003，64（5）：923-933.

[12]Dos Passos A D，Madrona G S，Marcolino V A，et al. The use of thermal analysis and photoacoustic spectroscopy in the evaluation of maltodextrin microencapsulation of anthocyanins from juara palm fruit（Euterpe edulis Mart.）and their application in food[J]. Food Technol Biotechnol，2015，53（4）：385-396.

[13]Lippert E，Ruemmele P，Obermeier F，et al. Anthocyanins prevent colorectal cancer development in a mouse model[J]. Digestion，2017，95（4）：275-280.

[14]Fernandes I，Marques C，Evora A，et al. Pharmacokinetics of table and Port red wine anthocyanins：a crossover trial in healthy men[J]. Food & Function，2017，8（5）：2030-2037.

[15]Sheng L X，Xia W，Zang S，et al. Transcriptome-sequencing analyses reveal putative genes related to flower color variation in Chinese Rosa rugosa[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2018，40（3）：62-75.

[16]Wang J W，Guo M L，Li Y H，et al. High-throughput transcriptome sequencing reveals the role of anthocyanin metabolism in Begonia semperflorens under high light stress[J]. Photochemistry and Photobiology，2018，94（1）：105-114.

[17]孟亞南，張 琳，劉召強，等. 荷花轉(zhuǎn)錄組測序及花青素苷合成相關基因表達分析[J]. 西南林業(yè)大學學報（自然科學版），2018，38（2）：61-69.

[18]蔣會兵，孫云南，李 梅，等. 紫娟茶樹葉片不同發(fā)育期花青素積累及合成相關基因的表達[J]. 茶葉科學，2018，38（2）：174-182.張建棟，黃 萌，宋云生，等. 不同栽培措施對雙低油菜蘇油8號產(chǎn)量與品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（6）：46-49.