黃 升，陳 利，蘇國(guó)旗，黃金秀,2*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460）

低劑量抗生素曾廣泛添加到飼料中用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)并增強(qiáng)抗病能力，但抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性加劇。我國(guó)于2020 年12 月31 日全面禁止在動(dòng)物飼料中添加促生長(zhǎng)類抗生素。因此，尋找新型抗生素替代品成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。類芽孢桿菌（）為革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界分布廣泛，可以分泌多種環(huán)脂肽，如表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和豐源素（Fengycin）等。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)脂肽具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能，且不易產(chǎn)生耐藥性，在養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大。都海明等研究發(fā)現(xiàn)，添加4 000 U/kg 環(huán)脂肽（含表面活性素和豐源素）能抑制斷奶仔豬腸道有害微生物生長(zhǎng)，降低腹瀉，改善生長(zhǎng)性能。飼糧中添加50 mg/kg 表面活性素可提高吉富羅非魚(yú)腸道脂肪酶活性，調(diào)節(jié)脂肪代謝酶水平或活性，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)。因此，環(huán)脂肽對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)與代謝具有正面影響，作為飼用抗生素替代品具有廣闊的應(yīng)用前景。

野生型菌株合成的環(huán)脂肽產(chǎn)量非常低，通常需要優(yōu)化發(fā)酵條件來(lái)改變菌株代謝方式，提高產(chǎn)量。陳杰等對(duì)海洋芽胞桿菌（）B-9987 產(chǎn)新型環(huán)脂肽Marinhysin A 的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加42 g/L 蔗糖和42.3 g/L 酵母粉，Marinhysin A 濃度最大可達(dá)182 mg/L，較之前提高了28.5%。Abdel-Mawgoud 等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaNO是枯草芽孢桿菌（）BS5 產(chǎn)表面活性素的最佳氮源，且適宜添加量為5 g/L。然而，目前關(guān)于環(huán)脂肽發(fā)酵條件的研究集中在實(shí)驗(yàn)室搖瓶階段，鮮有中試發(fā)酵階段的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室篩選到1 株產(chǎn)脂環(huán)七肽的類芽孢桿菌，脂環(huán)七肽為表面活性素類似物，具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。為此，本試驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵條件篩選的基礎(chǔ)上，探究中試發(fā)酵件下發(fā)酵時(shí)間及豆粕、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽的添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響，為脂環(huán)七肽產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基 類芽孢桿菌由重慶市畜牧科學(xué)院篩選得到并保存。LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）組成為10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、10 g/L 氯化鈉，pH 調(diào)至7.0；在LB 液體培養(yǎng)基中加2.0 %瓊脂配制成LB 固體培養(yǎng)基；種子罐培養(yǎng)基為2.5 kg 蛋白胨、1.25 kg 酵母粉、1.25 kg 氯化鈉、0.75 kg 消泡劑，裝罐量230 L。

1.2 主要試劑 豆粕購(gòu)自榮昌縣糧油工業(yè)公司；葡萄糖為化學(xué)純，購(gòu)自榮昌縣糧油工業(yè)公司；碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳均為化學(xué)純，購(gòu)自重慶渝西商貿(mào)有限公司；AT-320F 型消泡劑為南海大田化學(xué)有限公司產(chǎn)品。脂環(huán)七肽標(biāo)準(zhǔn)品由實(shí)驗(yàn)室從類芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化獲得，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，純度為99.5%。

1.3 主要儀器 Ulti-Mate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）、安捷倫C18（4.6×250 mm）反相色譜柱（安捷倫科技中國(guó)有限公司）、LDZH-200KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、Milli-Q 型超純水儀（默克有限公司）、10 t發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）等。

1.4 種子液制備

1.4.1 菌株活化 將保藏在甘油管內(nèi)的原代菌種接種于LB 斜面活化培養(yǎng)基上，在37℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

1.4.2 種子菌搖瓶培養(yǎng) 將斜面培養(yǎng)的單菌落接入滅菌的、裝有50 mL LB 培養(yǎng)基的三角瓶中，在37 ℃、200 r/min 的搖床上培養(yǎng)16 h，得到一級(jí)種子液。

1.4.3 種子罐培養(yǎng) 種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基滅菌后，按照1%接種量將一級(jí)種子液接種到500 L 種子罐中，在罐溫36.0～37.5 ℃、罐壓0.05 Mpa、pH 6.65～8.55、轉(zhuǎn)速100～160 r/min、溶氧30 % 左右、通風(fēng)量13～20 m/h的發(fā)酵條件下培養(yǎng)22 h，得到二級(jí)種子液。

1.5 中試發(fā)酵與樣品制備 按5 m裝容量將發(fā)酵物料投放入10 t 罐體內(nèi)，加水后用攪拌槳低速混合，再用121℃蒸汽中滅菌30 min。滅菌后，將二級(jí)發(fā)酵種子按1.5%接種量進(jìn)行接種。其他發(fā)酵條件為罐壓0.05 MPa、溶氧30 %左右、pH 6.65～7.55、通風(fēng)量260～380 m/h、罐溫36.8～37.5℃、轉(zhuǎn)速100～180 r/min。終止發(fā)酵后，將菌液以3 500 r/min 離心30 min 后取上清液，經(jīng)噴霧干燥獲得含脂環(huán)七肽的中試樣品。

1.6 脂環(huán)七肽產(chǎn)量檢測(cè) 稱量1 g 左右的中試樣品，置于25 mL 容量瓶中，加適量的超純水，用超聲處理10～15 min 后定容至25 mL；再在8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，得到的上清液用0.22 μm 水相濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜儀檢測(cè)。記錄樣品液相色譜圖中相應(yīng)峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算脂環(huán)七肽產(chǎn)量。計(jì)算公式：

脂環(huán)七肽產(chǎn)量（%）=[（樣品峰面積-標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方截距）/（線性方程斜率× 進(jìn)樣體積）]×（樣品定容體積/樣品重量）

1.7 中試發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化 中試樣品制備同試驗(yàn)方法1.5，脂環(huán)七肽產(chǎn)量檢測(cè)同試驗(yàn)方法1.6。

1.7.1 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化 試驗(yàn)設(shè)置22、24、26、30 h 4 個(gè)發(fā)酵時(shí)間，除發(fā)酵時(shí)間外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

1.7.2 葡萄糖添加量的優(yōu)化 試驗(yàn)設(shè)置的2 種葡萄糖添加量分別3.70、4.44 kg/m，除葡萄糖外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

1.7.3 豆粕添加量的優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)基篩選的基礎(chǔ)上，以豆粕為氮源，考察不同添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響。試驗(yàn)設(shè)置了46.3、55.6、64.8 kg/m3 種豆粕添加量，除豆粕外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

1.7.4 無(wú)機(jī)鹽添加量的優(yōu)化 試驗(yàn)比較了2 種無(wú)機(jī)鹽配方（表1）對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響，除無(wú)機(jī)鹽外的其他中試發(fā)酵參數(shù)均保持一致。

表1 無(wú)機(jī)鹽配方

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，采用One-Way ANOVA 方法對(duì)豆粕添加量和發(fā)酵時(shí)間的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽添加量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)采用LSD 法進(jìn)行多重比較。＜0.05表示差異顯著，＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖1 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為26 h 時(shí)，脂環(huán)七肽產(chǎn)量最高，為1.41%，高于發(fā)酵22 h 時(shí)的產(chǎn)量（＜0.05）；而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至30 h 時(shí)，脂環(huán)七肽產(chǎn)量降低至1.26%。因此，中試發(fā)酵時(shí)間選擇26 h 為宜，后續(xù)試驗(yàn)均采用26 h 發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

2.2 葡萄糖添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖2 可見(jiàn)，中試發(fā)酵基質(zhì)中分別添加3.70、4.44 kg/m葡萄糖，脂環(huán)七肽產(chǎn)量分別為1.28%和1.33%（＞0.05）。從成本角度考慮，建議葡萄糖選擇添加3.70 kg/m。

圖2 葡萄糖添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

2.3 豆粕添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖3 可知，隨著豆粕添加量的增加，中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量先升高后降低。當(dāng)豆粕添加量為55.6 kg/m時(shí)，脂環(huán)七肽產(chǎn)量高達(dá)1.35%，高于其他兩組（＜0.05），提示豆粕在中試發(fā)酵基質(zhì)中的適宜添加量為55.6 kg/m。

圖3 豆粕添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

2.4 無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 由圖4 可見(jiàn)，無(wú)機(jī)鹽按配方1 添加時(shí)中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量（1.42 %）較按配方2 添加時(shí)脂環(huán)七肽產(chǎn)量（1.64 %）提高了15.49%（＜0.05），表明適當(dāng)增加中試發(fā)酵基質(zhì)中的無(wú)機(jī)鹽添加量能提高脂環(huán)七肽產(chǎn)量。

圖4 無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響

3 討 論

3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 發(fā)酵時(shí)間是影響芽孢桿菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的重要因素。研究表明，芽孢桿菌在不同發(fā)酵時(shí)間所產(chǎn)生的環(huán)脂肽種類存在差異，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期向?qū)?shù)期的過(guò)渡階段會(huì)產(chǎn)生大量的表面活性素，而在穩(wěn)定期的初始階段產(chǎn)生豐源素，在穩(wěn)定期的后期則產(chǎn)生伊枯草菌素。因此，不同活性物質(zhì)所需要的菌株發(fā)酵時(shí)間會(huì)不同。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，中試樣品的脂環(huán)七肽產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，發(fā)酵26 h 時(shí)脂環(huán)七肽產(chǎn)量達(dá)到最高值。秦楠等也發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌HRH317 菌株的抑菌活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為18 h 時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大，推斷該菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期開(kāi)始合成活性物質(zhì)，而從穩(wěn)定期至降速期，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)逐漸耗盡，菌體數(shù)減少，合成活性物質(zhì)的能力降低。

3.2 葡萄糖添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 葡萄糖作為速效的碳源，能快速啟動(dòng)菌體生長(zhǎng)，縮短菌株發(fā)酵周期，促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。張志焱等對(duì)1 株產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化，得出適宜碳源為葡萄糖，且當(dāng)葡萄糖在50 g/L 時(shí)產(chǎn)生的抗菌肽效價(jià)達(dá)到最高，為3.64×10U/mL。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖添加量對(duì)類芽孢桿菌產(chǎn)脂環(huán)七肽的能力沒(méi)有顯著影響，可能是因?yàn)樵谥性嚿a(chǎn)中菌株對(duì)葡萄糖的利用效率發(fā)生改變，或是本試驗(yàn)中葡萄糖添加量變化較小導(dǎo)致。

3.3 豆粕添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 氮源是影響發(fā)酵菌株生物合成環(huán)脂肽的關(guān)鍵因素。喬俊卿等采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工程菌株B9BD 發(fā)酵合成表面活性素的條件，最終確定以黃豆粉為主要氮源、輔助添加牛肉浸膏和硝酸銨為氮源。豆粕的粗蛋白質(zhì)含量較高，通常為43%～46%，且氨基酸組成比例好，可以作為芽孢桿菌培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)氮源。在發(fā)酵過(guò)程中，豆粕可被菌株利用供能，并產(chǎn)生1,6-二磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖等多種代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)激活菌株ATP-依賴的蛋白激酶系統(tǒng)，進(jìn)而直接或間接調(diào)控抗菌脂肽的合成路徑。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，豆粕添加量會(huì)顯著影響中試發(fā)酵樣品中的脂環(huán)七肽產(chǎn)量，當(dāng)豆粕添加量由46.3 kg/m增加到55.6 kg/m時(shí)，脂環(huán)七肽產(chǎn)量提高了28.57%；而當(dāng)豆粕添加量增至64.8 kg/m時(shí)，脂環(huán)七肽產(chǎn)量又出現(xiàn)明顯下降，故中試發(fā)酵基質(zhì)中的豆粕適宜添加量為55.6 kg/m。

3.4 無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)脂環(huán)七肽產(chǎn)量的影響 無(wú)機(jī)鹽是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成成分。菌體內(nèi)的各種酶促反應(yīng)均需要鎂、鈣、鉀等多種離子參與，并影響抗菌肽的合成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)增加中試發(fā)酵基質(zhì)中碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳的添加量，可以顯著提高脂環(huán)七肽產(chǎn)量。Abdel-Mawgoud 等試驗(yàn)結(jié)果也表明，培養(yǎng)基中添加0.16 g/L 硫酸鋅、0.27 g/L氯化鐵和0.017 g/L 硫酸錳，提高了枯草芽孢桿菌表達(dá)表面活性素的能力。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，以脂環(huán)七肽產(chǎn)量為衡量指標(biāo)，優(yōu)化后的類芽孢桿菌中試發(fā)酵基質(zhì)為55.6 kg/m豆粕、3.70 kg/m葡萄糖、3.33 kg/m碳酸鈣、1.11 kg/m硫酸鎂、1.11 kg/m磷酸氫二鉀、1.11 kg/m磷酸二氫鉀、0.22 kg/m硫酸錳，適宜發(fā)酵時(shí)間為26 h，脂環(huán)七肽產(chǎn)量從1.04 %提高到1.64 %，可為利用該菌株實(shí)現(xiàn)脂環(huán)七肽產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。