外泌體分離檢測方法的研究進展

王煜彤，侯詩源，呂云華，馬瑞雪，劉梓諭，吳興安，劉蓉蓉

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院： 1學(xué)員二大隊， 2微生物與病原生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

外泌體存在于各種體液中，如腹水、血液、腦脊液、淚液、尿液以及唾液等。外泌體攜帶大量胞內(nèi)和胞外的生物信息，可作為細胞通訊和細胞外基質(zhì)重塑的媒介，與人類健康和疾病息息相關(guān)[1]。因為外泌體可以攜帶源細胞和組織中的生理變化信息，所以也可作為診斷生物標(biāo)志物[2]。隨著對外泌體研究的不斷深入，外泌體在臨床診斷、疾病治療、組織再生等方面顯示出重要的研究價值[3]。外泌體形成始于細胞膜的內(nèi)吞作用，包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、包涵體蛋白的核內(nèi)吞作用和胞吐[4]。內(nèi)吞后形成早期內(nèi)體，晚期內(nèi)體內(nèi)陷導(dǎo)致腔內(nèi)囊泡形成，多囊泡體通過細胞骨架和微管網(wǎng)絡(luò)傳輸至細胞膜，通過胞吐作用釋放成為外泌體。

外泌體作為物質(zhì)運輸?shù)妮d體，在細胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用，反映了源細胞的狀態(tài)和特征。外泌體大小各異，直徑為30～200 nm，即使從同一個細胞系分泌出的外泌體，大小也有很大差異。外泌體具有單層膜結(jié)構(gòu)，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子。與其他囊泡不同，外泌體內(nèi)含多種核酸，包括各種RNA、基因組DNA和線粒體DNA等，尤其富含多種小型非編碼RNA 。這些包含在脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中的遺傳物質(zhì)可以通過細胞的內(nèi)吞途徑融合于源細胞或在受體細胞之間進行轉(zhuǎn)移。外泌體包含多種跨膜蛋白、脂錨定蛋白和可溶性蛋白等。其中四跨膜蛋白家族(CD81、CD82、CD37和CD63)在外泌體中高度富集，而不會出現(xiàn)在血漿中[5]。四跨膜蛋白家族自身不具有催化活性，但可以促進其他膜蛋白的運輸[6]。

外泌體的產(chǎn)生是細胞蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機制之一，它使細胞能夠快速、有選擇性地將蛋白質(zhì)從質(zhì)膜上清除[7]。外泌體也是細胞外基質(zhì)的組成成分之一，并且能通過細胞間的運輸扮演信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子轉(zhuǎn)運的角色。多項研究表明，外泌體可作為多種疾病的標(biāo)志物，其蛋白質(zhì)和核酸的含量在源細胞中處于穩(wěn)定狀態(tài)[8]。外泌體在不同的癌癥亞型中均有表達，是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物[9]。此外，1型糖尿病患者的外泌體有望成為新的診斷指標(biāo)和潛在治療靶點[10]。外泌體在促進細胞運輸系統(tǒng)的運行和調(diào)節(jié)機制方面的研究中也取得了很大的進展，對惡性腫瘤的免疫也有積極作用[11]。外泌體作為天然性轉(zhuǎn)運載體，具有納米級粒徑及良好生物相容性，可以攜帶RNA、蛋白質(zhì)及小分子藥物，相比于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體、微球等人工合成的藥物載體，是一種很有前景的靶向遞藥載體[12]。由于外泌體的特征性識別、分離和定量檢測在研究中非常關(guān)鍵，因此本文對其分離檢測方法的相關(guān)研究進展作一綜述。

1 外泌體的分離純化

提取技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性是外泌體研究的前提?；铙w樣本的外泌體不僅體積小，數(shù)量也極少，這使外泌體的分離和純化非常困難。根據(jù)直徑大小、蛋白質(zhì)、核酸等方面的差異，可以采用不同的分離方法從細胞培養(yǎng)物或體液中提取不同來源的外泌體[13]。

1.1 離心

離心可分為超速離心和密度梯度超速離心。超速離心是目前提取外泌體最常用的方法，也被認(rèn)為是外泌體分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”。根據(jù)大小差異，可采用超速離心法分離外泌體。該方法單次提取量高、成本低，但處理時間長、設(shè)備昂貴、回收率低、純度低，可能導(dǎo)致非外泌體成分(如雜質(zhì)蛋白和病毒)聚集。此外，反復(fù)離心可引起外泌體損傷，導(dǎo)致外泌體降解。當(dāng)需要更高純度的外泌體時，可以使用密度梯度超速離心法對外泌體進行純化。此法能有效去除樣品中的蛋白質(zhì)污染，保持其活性和形態(tài)。然而，該方法工作量大、步驟復(fù)雜、耗時、回收率低。外泌體的分離效果與其粒徑和形狀無關(guān)，而與樣品中外泌體的密度有關(guān)，密度差越高，分離效果越顯著。此外，離心時長也會直接影響純化效率[13]。

1.2 沉淀法

聚乙二醇沉淀是在一定鹽濃度下向樣品中加入親水性聚乙二醇的分離方法。水分子的結(jié)合降低了溶質(zhì)的溶解度，以致在低速離心條件下外泌體出現(xiàn)凝結(jié)和沉淀。此法可以實現(xiàn)外泌體的大量分離，且不需要高端昂貴的設(shè)備，也不會對生物活性產(chǎn)生任何影響。大多商用試劑盒使用聚合物共沉淀方法富集外泌體，然而，這種方法分離出的外泌體可能含有雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)聚合物等。

1.3 免疫親和法

外泌體富含特定的膜蛋白，包括CD9、EPCAM、CD63、RAB5、CD81、ALIX、Annexin等。免疫親和法通過標(biāo)記外泌體的特定蛋白質(zhì)來實現(xiàn)分離。特異性蛋白可以在不同載體底物上與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)外泌體的分離和富集[14]。基于包被抗體底物的差異，免疫分離的方法可分為磁珠免疫分離、色譜固定相分離、酶聯(lián)免疫吸附分離等。該方法特異度高、外泌體形態(tài)不受影響、操作簡單。然而，此方法只能分離具有陽性標(biāo)記的外泌體，并且提取效率低，外泌體的活性易受pH值和鹽濃度的影響[15]。

1.4 基于尺寸的分離方法

超濾和尺寸排阻色譜是基于外泌體粒徑來分離外泌體的兩種主要方法。超濾的分離效率取決于樣品中懸浮物的大小和分子量。目前，一些學(xué)者已經(jīng)通過這種方法成功分離出外泌體。此方法樣品預(yù)處理工藝簡單，但外泌體可能會因壓力而變形或斷裂，也容易出現(xiàn)堵孔現(xiàn)象，影響分離效率。尺寸排阻色譜是利用分析物的粒度差異進行色譜分離的技術(shù)。分離出的外泌體可以有效地從雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂類等)中分離出來，并保持其完整性和生物活性，操作過程簡便，外泌體純度高。然而，它需要相對高質(zhì)量的色譜柱，否則在外泌體分離過程中容易被蛋白質(zhì)或脂類污染，故而成本較高[16]。目前，有研究人員采用超濾和尺寸排阻色譜相結(jié)合的方法，分離純化出高質(zhì)量的囊泡或外泌體[13]。微流體分離是近年來發(fā)展起來的一種微尺度快速分離方法，依靠精確的納米級控制能力，可以實現(xiàn)超快速的外泌體分離，在提高回收率、減少樣品體積、縮短處理時間方面顯示出良好的應(yīng)用前景[17]。

文獻[18]報道表明，不同的外泌體分離方法會導(dǎo)致其濃度、純度發(fā)生變化。通過超速離心或不同試劑盒分離出的外泌體表現(xiàn)出部分miRNA的差異性[19-20]。也有人提出，分離方法可能會改變外泌體miRNA譜[20]。蛋白組學(xué)或流式細胞術(shù)分析表明，分離的外泌體經(jīng)常被共分離的血漿蛋白“污染”，污染程度取決于所使用的分離方法[21]。此外，不同的分離技術(shù)也會改變外泌體標(biāo)志物的檢測水平，這可能與不同分離方法分離的外泌體純度和亞群不同有關(guān)?？偠灾饷隗w樣品的純度高度依賴于分離方法，并可能導(dǎo)致不同的分離結(jié)果。因此，必須謹(jǐn)慎選擇合適的外泌體分離純化方法，減少對后續(xù)分析的影響。將多種外泌體分離方法結(jié)合使用，能更簡單、高效地從微量樣本中分離外泌體。

2 外泌體的檢測

以往的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和靶向治療有重要影響。外泌體的識別和分析是臨床研究的前提和保證。因此，外泌體的定量分析具有重要意義。為了提高分析的效率、靈敏度和可靠性，許多研究者對外泌體的特異性識別提出了新的分析方法，如核酸信息識別、特異性蛋白質(zhì)識別、脂質(zhì)識別、表面修飾識別和整體識別等。

2.1 核酸信息依賴性識別

核酸作為外泌體的主要組分之一，攜帶著來自源細胞的重要遺傳信息，主要包括RNA、DNA和miRNA[22]。外泌體核酸可以在體內(nèi)細胞之間自由傳遞和交流，這有利于更多基于外泌體RNA的個體化癌癥藥物發(fā)展。外泌體攜帶的核酸物質(zhì)可能與疾病有關(guān)，尤其在癌癥的診斷中有重要意義。此外，它還顯示了重要的生理變化信息。核酸物質(zhì)主要分布在外泌體的內(nèi)層，被脂質(zhì)雙層包圍，這增加了分析過程中核酸識別的難度，所以以這種組分作為外泌體檢測靶標(biāo)的方法很少。

2.2 蛋白質(zhì)識別

以往的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體表面有多種特定的蛋白質(zhì)表達，這些蛋白質(zhì)將外泌體與其他囊泡區(qū)分開，包括四跨膜蛋白家族 (CD9、CD82、CD81和CD63)、熱休克蛋白、生物合成蛋白(TSG、Alix)和表面生長因子受體等。其中四跨膜蛋白家族在外泌體表面高度富集，是外泌體鑒定和定量分析的理想標(biāo)記。

利用蛋白質(zhì)的免疫識別來檢測外泌體是鑒定中最常見的方法之一。通過將蛋白質(zhì)免疫識別技術(shù)與電化學(xué)分析、色譜分析、表面增強拉曼散射和微流控檢測平臺相結(jié)合，研究人員建立了多種外泌體分析方法[23-25]。近年來，蛋白質(zhì)免疫識別技術(shù)已被應(yīng)用于各種外泌體分析方法[26]。YU等[27]發(fā)明了一種場效應(yīng)晶體管生物傳感器，使用抗體修飾的還原氧化石墨烯對外泌體進行定量分析，該傳感器專門識別外泌體上的CD63蛋白。WANG等[28]報道了一種由金納米粒子放大的表面聲波傳感器，用于外泌體高靈敏檢測。此外，一些研究人員還通過檢測外泌體表面的CD63蛋白與相應(yīng)抗體的特異性識別，實現(xiàn)外泌體的定量分析[29]。外泌體表面富集大量的特異性蛋白。一方面，單個蛋白質(zhì)可以對外泌體進行識別和捕獲；另一方面，多個特定的蛋白質(zhì)可以用于多重識別和測定。 FAN等[30]通過抗體的不同識別位點和生物親和力發(fā)明了一種表面等離子體共振成像生物傳感器，對非小細胞肺癌衍生的多種外泌體進行了高靈敏度的鑒定，從而有效地區(qū)分外泌體與正常肺細胞和非小細胞肺癌細胞。

適配體是通過配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進化過程選擇的寡核苷酸，具有核酸鏈靈活性、空間構(gòu)象多樣性等基本特征。蛋白質(zhì)以疊加、互補形狀，靜電和氫鍵的形式與適配體實現(xiàn)高親和力和特異性的結(jié)合[31]。與抗體相比，核酸適配體的化學(xué)修飾更加容易，且成本低、長期穩(wěn)定性好、易于合成。依靠外泌體表面蛋白的適配體，通過表面蛋白的識別結(jié)合電化學(xué)檢測可以實現(xiàn)外泌體的定量分析。CD63是外泌體表面最常見的特異性蛋白。許多學(xué)者已經(jīng)實現(xiàn)了CD63適配體對外泌體的檢測，并且具有良好的檢測效果。此外，一些分析方法使用其他蛋白質(zhì)適配體來檢測外泌體。利用表面特異性蛋白適配體識別聯(lián)合熒光分析檢測外泌體，也是外泌體分析的一個重要方法。ZHANG等[32]開發(fā)了一種基于適配體的熒光極化方法，可以直接定量人血漿中的外泌體。其中，適配體與外泌體膜蛋白之間的內(nèi)在親和力在外泌體捕獲中起著關(guān)鍵作用。此外，一些學(xué)者將表面蛋白和適配體識別與其他分析方法相結(jié)合，建立了多種外泌體的檢測方法，包括比色分析、表面等離子體共振、巨磁電阻生物傳感器、點擊化學(xué)和發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移[33-37]。已有研究團隊構(gòu)建了一種適配體電化學(xué)傳感器，可以在輔助檢測DNA納米結(jié)構(gòu)和納米四面體的基礎(chǔ)上檢測肝細胞中的外泌體[38]。還有研究人員將蛋白質(zhì)的抗體免疫與適配體識別結(jié)合起來，實現(xiàn)外泌體的定量分析[39]。

2.3 脂質(zhì)識別

外泌體的最外層為脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，保證內(nèi)含物的穩(wěn)定性。脂質(zhì)識別常與其他識別方法相結(jié)合用于外泌體的檢測和分析，該方法大大減少了干擾信號，確保外泌體檢測的高特異度和高靈敏度，但該方法的操作較為復(fù)雜，成本較高。通過與DNA寡核苷酸結(jié)合錨定外泌體的脂質(zhì)雙層，TIAN等[40]結(jié)合集成核酸擴增芯片數(shù)字檢測技術(shù)，構(gòu)建了一個用于檢測外泌體的高靈敏度微芯片平臺。該平臺通過錨定膽固醇的納米探針以識別尿液樣本中的外泌體。另外，脂質(zhì)識別可以與外泌體表面特異性蛋白識別結(jié)合，采用雙標(biāo)記識別實現(xiàn)共同識別和檢測?；贑D63適配體磁珠標(biāo)記捕獲和膽固醇修飾的DNA探針用于外泌體脂質(zhì)體鑒定，ZHANG等[41]利用堿性磷酸酶雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號的放大，實現(xiàn)了外泌體的目視檢測及紫外可見分光光度計的定量分析。

2.4 表面修飾識別

外泌體直接分析和檢測困難巨大，研究者們試圖通過核酸、放射性物質(zhì)和納米探針對外泌體進行表面修飾，間接檢測到外泌體，然后通過測定修飾物來計算外泌體的含量。通過DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在特定外泌體上修飾適配體[42]，MORISHITA等[43]使用基于鏈霉素 - 親和素生物素系統(tǒng)的碘-125標(biāo)記特定來源的外泌體，通過對含量的檢測和分析，對外泌體進行評價。此外，利用納米探針對外泌體表面進行修飾，在其識別和檢測方面也顯示出良好的應(yīng)用效果。

2.5 整體識別

外泌體的整體識別和分析主要包括影像學(xué)分析和分子印跡。因為表面等離子體波深度和外泌體大小處于同一水平線上，PICCIOLINI等[44]提出了一種可以直接檢測多個外泌體組的方法。該方法利用表面等離子體共振成像技術(shù)對血液中的外泌體進行定量分析。MORI等[45]利用分子表面印跡技術(shù)結(jié)合抗體修飾納米粒子，建立了一種定量檢測前列腺癌外泌體的熒光方法。該方法無需預(yù)處理，且靈敏度高，通過記錄質(zhì)譜產(chǎn)生的外泌體特征，實現(xiàn)了黑色素瘤疾病外泌體含量的分析。DONG等[46]巧妙地設(shè)計了一個類似蜂巢的平臺，利用表面增強拉曼散射技術(shù)實現(xiàn)了外泌體的整體識別。該方法成功地應(yīng)用于腫瘤患者血漿外泌體的分離和檢測。

3 結(jié)語

隨著外泌體研究的不斷深入，對外泌體的結(jié)構(gòu)特征、基本成分、生物發(fā)生、形態(tài)特征和細胞間功能等方面的研究已經(jīng)越來越深入。通過對外泌體的分析，越來越多的腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，如HER2、EpCAM、MUC1、CA125、PTK7和PSA?；谛掳l(fā)現(xiàn)的外泌體標(biāo)記蛋白，實現(xiàn)了對不同來源細胞外泌體的識別和檢測，豐富了外泌體的高效分離和分析方法，為外泌體在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

然而，外泌體的生物發(fā)生、分泌、靶細胞攝取和功能尚未完全揭示。外泌體能否在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中生長、分裂，或參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和是否具有自主生化反應(yīng)等，尚待確定。現(xiàn)有的外泌體分離技術(shù)還有待進一步完善，目前的主要挑戰(zhàn)是在實現(xiàn)高含量、低損傷、高回收率的同時實現(xiàn)高通量的外泌體分離。外泌體分析技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是外泌體表面靶標(biāo)的選擇和外泌體來源的識別。今后，不僅需要對不同細胞來源的外泌體的組分(蛋白質(zhì)、脂類、核酸等)進行測定，而且需要對其特征或來源類型進行分析，從而建立一個簡便、高效、可靠的外泌體分離分析標(biāo)準(zhǔn)化程序。