劉亭亭, 汪漢成, 蔡劉體, 孫美麗,陸 寧, 向立剛, 張長青

(1. 長江大學農(nóng)學院, 荊州 434000; 2. 貴州省煙草科學研究院, 貴陽 550081)

煙草赤星病(tobacco brown spot)是煙葉成熟期的主要真菌性病害,其病原菌為半知菌亞門Deuteromycotina鏈格孢屬Alternaria真菌,該屬病原菌寄主范圍廣,煙草、棉花、柑橘等均可被其侵染[1-3]。目前已知可引起煙草赤星病的鏈格孢種類有鏈格孢A.alternata、長柄鏈格孢A.longipes、極細鏈格孢A.tenuissima、鴨梨鏈格孢A.yaliinficiens和A.tabacicola[4],其中又以A.alternata最為嚴重和普遍,所以本研究以該種作為研究對象。煙草赤星病的發(fā)生與流行受多種因素影響,其中溫度是病原菌生長、侵染和致病過程中的重要環(huán)境影響因子[5-7]。有研究發(fā)現(xiàn)煙草赤星病發(fā)生的最適溫度范圍為23.7～28.5℃[8],A.alternata菌絲生長和產(chǎn)孢最適溫度在21～28℃,但不同溫度下生長速率和產(chǎn)孢量有較大差異[9]。除生物學特性外,溫度也可影響病原菌致病力,如劉暢等[10]研究發(fā)現(xiàn),黑脛病菌Phytophthoranicotianae可致病溫度范圍為21～35℃,其中30、35℃時致病力最強。汪漢成等[11]研究發(fā)現(xiàn),煙草青枯病菌Ralstoniasolanacearum可致病的溫度范圍為25～35℃,30～35℃時致病力最強。

除了溫度外,影響病原菌侵染與危害的其他生態(tài)環(huán)境因子還包括碳源營養(yǎng)等。汪漢成等[12]的研究發(fā)現(xiàn),煙草赤星病菌能高效代謝包括L-果膠糖、D-半乳糖、D-甘露糖等在內(nèi)的34種碳源。病原菌在不同滲透壓和pH環(huán)境下的代謝表型特征能夠反映其對環(huán)境的耐受力,如劉暢等[10]進行不同溫度、不同滲透壓/pH下煙草黑脛病菌的代謝表型研究時發(fā)現(xiàn),27℃和30℃時煙草黑脛病菌的滲透壓適應(yīng)范圍最廣,20、27℃和30℃時,煙草黑脛病菌在pH 5.0～10.0范圍內(nèi)可正常代謝。Wang等[13]發(fā)現(xiàn),在30℃和35℃時,煙草青枯病菌對滲透壓和pH的適應(yīng)性較強。然而,作為危害煙葉生產(chǎn)最嚴重病原菌之一的赤星病菌,其在不同溫度下對不同碳源、滲透壓和pH的適應(yīng)能力卻缺乏了解。

為此,本研究采用菌絲生長速率法和離體葉片法分別測定了不同溫度下煙草赤星病菌的生長速率和致病力,并采用Biolog代謝表型技術(shù)測定了在22、25、30℃和35℃下不同碳源、滲透壓和pH對其代謝表型特征的影響,旨在通過代謝表型了解溫度對煙草赤星病菌致病力的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Biolog PM9和PM10代謝板(貨號:12161、12162),Biolog FF代謝板(貨號:94545),FF-IF接種液(filamentous fungi-inoculating fluid)(貨號:72106):由0.03%吐溫40和0.25%吉冷膠制成,Omnilog PM高通量微生物細胞表型芯片測定系統(tǒng)(貨號:91171),均購自美國Biolog公司。3種代謝板分別用于測定病原菌在不同滲透壓、pH和碳源下的代謝表型。D-葡萄糖(貨號:G5400),購自美國Sigma公司;酵母氮源(貨號:239210),購自美國Difco公司。

1.2 方法

1.2.1不同溫度對煙草赤星病菌生物學特性的影響

1.2.1.1煙草赤星病菌生長速率測定

采用菌絲生長速率法[14]測定不同溫度下菌絲生長速率。用直徑6 mm打孔器打取30℃黑暗培養(yǎng)5 d的赤星病菌菌碟,分別置于PDA培養(yǎng)基上，15、20、25、30、35、40℃黑暗條件下培養(yǎng),每個處理3組重復(fù),分別于接種后3、5、7 d采用“十字交叉法”測量菌落直徑,并計算生長速率。

1.2.1.2煙草赤星病菌產(chǎn)孢量測定

將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上,分別置于15、20、25、30、35、40℃的生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),每個處理3組重復(fù),培養(yǎng)7 d后用10 mL無菌水洗滌平板,制成孢子懸浮液,在顯微鏡下利用血球計數(shù)板測定單位面積(cm2)的產(chǎn)孢量[15]。

1.2.1.3煙草赤星病菌孢子萌發(fā)率測定

將病原菌在AEA培養(yǎng)基上30℃黑暗培養(yǎng)7 d后,用無菌水將分生孢子洗下,雙層紗布過濾得到孢子懸浮液,調(diào)節(jié)孢子濃度至1×105個/mL。采用凹玻片法[16]測定病原菌孢子萌發(fā)率,將制備好的玻片分別置于15、20、25、30、35、40℃條件下恒溫保濕黑暗培養(yǎng),12 h后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況,以芽管長度大于孢子短半徑視為萌發(fā),記錄各處理孢子萌發(fā)情況。

觀察組治療有效率為92.00%，對照組為68.00%。與對照組相比，觀察組的治療有效率更高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳細見（表1）。

1.2.1.4煙草赤星病菌致病力測定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上30℃黑暗培養(yǎng)5 d后用直徑6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌碟。采集‘云煙87’煙株中下部健康葉片,無菌水沖洗,再用75%乙醇對煙葉表面消毒,無菌水沖洗后晾干。每片煙葉以葉脈為分界,用接種針在對稱煙葉葉肉部位刺傷接種4個菌碟[17],然后分別置于15、20、25、30、35、40℃光照培養(yǎng)箱(L∥D=12 h∥12 h, RH 70%,光照強度:6 000 lx)培養(yǎng),每處理接種3片煙葉。分別于培養(yǎng)24、48、72、120 h時采用十字交叉法測量病斑直徑。

1.2.2不同溫度下不同碳源對煙草赤星病菌代謝表型的影響

采用Biolog公司的FF代謝板進行煙草赤星病菌碳源代謝表型分析[18]。將煙草赤星病菌接種到AEA培養(yǎng)基上于25℃、黑暗下培養(yǎng)5 d,至產(chǎn)生大量分生孢子,用無菌棉簽蘸取孢子,用FF-IF接種液制備孢子懸浮液,調(diào)整孢子懸浮液的濃度為1×105個/mL,然后依次加入FF代謝板微孔中(100 μL/孔)。接種完畢后的代謝板置于恒溫培養(yǎng)箱中,分別于22、25、30℃和35℃下培養(yǎng)7 d。在OmniLog工作軟件中設(shè)置培養(yǎng)孢子懸浮液所需溫度和時間,然后采用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集赤星病菌在生長過程中代謝板孔內(nèi)的顏色變化值,根據(jù)微生物代謝的孔顏色變化值,使用Excel 2019制作熱圖,分析其碳源代謝表型。

1.2.3不同溫度下不同滲透壓和pH對煙草赤星病菌代謝表型的影響

取20.05 mL 1.2.2中的孢子懸浮液與0.75 mLD-葡萄糖溶液、2 mL酵母氮源溶液和1.2 mL無菌水混合均勻,將混合液加入PM9和PM10代謝板，分別測定病原菌在不同滲透壓和pH下的代謝表型。將接菌后的PM9、PM10代謝板分別于22、25、30℃和35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。代謝表型的分析方法同1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 24.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,應(yīng)用LSD(least significant difference)法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對煙草赤星病菌生物學特性的影響

溫度對煙草赤星病菌菌絲生長、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)和致病力均有影響,且不同溫度下各參數(shù)間存在顯著差異(表1)。15～35℃時病原菌菌絲均可生長產(chǎn)孢,孢子均可萌發(fā);40℃時菌絲停止生長、產(chǎn)孢,孢子不萌發(fā);菌絲最適生長與產(chǎn)孢溫度為30℃,孢子最適萌發(fā)溫度為35℃。當溫度為15℃和40℃時,接種葉片不發(fā)病;溫度30℃時病斑直徑最大,為最適致病溫度。

表1 不同溫度對煙草赤星病菌生物學特性的影響1)

2.2 不同溫度下碳源對煙草赤星病菌代謝表型的影響

在22、25、30℃和35℃下,煙草赤星病菌代謝的碳源種類和代謝強度存在著共性與差異(圖1)。4個測試溫度下,煙草赤星病菌對所有供試碳源均可正常代謝,其所代謝的碳源種類隨溫度升高而增多。在22、25、30℃和35℃時,煙草赤星病菌可高效代謝的碳源分別有44、46、48種和54種,煙草赤星病菌代謝弱的碳源分別有1、2、5種和4種。

圖1 煙草赤星病菌在FF代謝板上的代謝特征Fig.1 Metabolic features of the pathogen Alternaria alternata in Biolog Phenotype MicroArray FF plates

2.3 不同溫度下滲透壓和pH對煙草赤星病菌代謝表型的影響

2.3.1不同溫度下滲透壓對煙草赤星病菌代謝表型的影響

在22、25、30℃和35℃時,煙草赤星病菌能進行高效代謝的滲透壓環(huán)境分別有76、71、56種和2種,煙草赤星病菌代謝弱的滲透壓環(huán)境分別有9、11、14種和18種。4個溫度下,煙草赤星病菌在20～200 mmol/L苯甲酸鈉(pH 5.2)和40～100 mmol/L亞硝酸鈉滲透壓環(huán)境下均代謝弱或不能代謝。在35℃時,煙草赤星病菌在100 mmol/L硫酸銨(pH 8.0)、100 mmol/L亞硝酸鈉條件下完全不能代謝(圖2)。

2.3.2不同溫度下pH對煙草赤星病菌代謝表型的影響

4個測試溫度下煙草赤星病菌可進行代謝的pH范圍均為3.5～10,但在不同溫度和pH環(huán)境下代謝表型存在差異。在pH 4.5,煙草赤星病菌在22、25℃及30℃下均可高效代謝大多數(shù)測試氨基酸;而在35℃下,煙草赤星病菌僅可高效代謝精氨酸(arginine)、天冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)等10種氨基酸。在pH 9.5,煙草赤星病菌在22℃和35℃下對測試氨基酸的代謝相對較弱;而在25℃和30℃下,其可高效代謝的氨基酸種類分別為6種和2種。此外,在22、25℃及30℃下,煙草赤星病菌表現(xiàn)出較強的脫羧酶活性和較弱的脫氨酶活性;在35℃下,其脫羧酶和脫氨酶活性相對較弱。在H01～H12微孔中,煙草赤星病菌在25℃和30℃時對所有測試化合物均可高效代謝,22℃時可高效代謝的化合物數(shù)量相對較少,而35℃時可高效代謝的僅有辛酸鹽(caprylate)、X-β-D-葡糖苷酸(X-β-D-glucuronide)、X-β-D-氨基葡萄糖苷(X-β-D-glucosaminide)及X-β-D-氨基半乳糖苷(X-β-D-galactosaminide)(圖3)。

3 結(jié)論與討論

煙草赤星病是煙葉生產(chǎn)上的重大病害之一,每年都會對煙草行業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[19]。溫度對病原菌的生物學特性具有顯著影響,本研究結(jié)果顯示,煙草赤星病菌15～35℃條件下均可生長,25～30℃適合產(chǎn)孢,這與Dickinson等[20]的研究結(jié)果基本一致。本文發(fā)現(xiàn)煙草赤星病菌30℃下菌絲生長最快、致病力最強,結(jié)果與唐明等[9]報道的28℃為最適菌絲生長溫度較為接近;同時,致病力結(jié)果與孔凡玉[8]報道的煙草赤星病發(fā)病的適宜溫度范圍為23.7～28.5℃類似,其差異原因可能為試驗方法不同,本文采用室內(nèi)離體葉片法,而后者為田間監(jiān)測結(jié)果。

碳源是植物病原菌生存的基本營養(yǎng)物質(zhì),已有研究表明,溫度會影響病原菌代謝碳源的種類和強度,如黑脛病菌P.nicotianae[10]、煙草青枯病菌R.solanacearum[13]。李六英等[21]的研究發(fā)現(xiàn),煙草赤星病菌28℃時僅能代謝Biolog PM1-2板中24.21%的碳源;王友升等[22]的研究發(fā)現(xiàn),鏈格孢26℃時可代謝Biolog FF板中77種碳源物質(zhì);汪漢成等[12]的研究發(fā)現(xiàn),煙草赤星病菌25℃時可高效代謝Biolog PM1-2代謝板中的34種碳源。相比而言,本文采用Biolog FF碳源代謝板進行測試,其碳源種類較Biolog PM1-2代謝板少,但大部分碳源為常見真菌可代謝碳源,能反映煙草赤星病菌對大部分碳源的需求。本文發(fā)現(xiàn)煙草赤星病菌在22、25、30℃及35℃下均可代謝所有碳源物質(zhì),在4個溫度下,均能高效代謝N-乙?；?β-D-葡萄糖胺、苦杏仁苷等23種碳源,推測這些碳源均為煙草赤星病菌的適宜碳源。煙草赤星病菌代謝碳源的數(shù)量隨溫度升高而增多,推測溫度會影響病原菌生理生化途徑的變化,進而影響碳源代謝種類的變化,4種溫度下煙草赤星病菌利用率均高的碳源是否與煙草赤星病的發(fā)生與危害程度有關(guān)有待下一步深入研究。

除了營養(yǎng)物質(zhì)外,溫度、滲透壓和pH等環(huán)境因子也影響病原菌的生物學特性與致病力[23-24]。病原菌在不同環(huán)境條件下代謝能力的變化可以反映其對環(huán)境的耐受能力[10]。對不同溫度、滲透壓和pH下青枯菌和黑脛病菌代謝表型研究發(fā)現(xiàn),30～35℃時青枯病菌對滲透壓和pH適應(yīng)能力較強,27～30℃時煙草黑脛病菌對滲透壓和pH適應(yīng)能力較強,該結(jié)果與生產(chǎn)上高溫時黑脛病和青枯病危害較重相吻合[10-11]。對不同溫度、滲透壓和pH環(huán)境條件下煙草赤星病菌的代謝表型研究發(fā)現(xiàn),溫度影響煙草赤星病菌對滲透壓和pH環(huán)境適應(yīng)力,25℃和30℃時其適應(yīng)范圍廣。其與煙草青枯菌和黑脛病菌對高溫的響應(yīng)規(guī)律基本一致,原因可能為青枯病菌、黑脛病菌及赤星病菌的最適發(fā)病溫度相似。此外,汪漢成等[12]也報道了25℃時不同煙草赤星病菌菌株的滲透壓和pH適應(yīng)范圍,本文研究結(jié)果與其基本一致,均發(fā)現(xiàn)煙草赤星病菌存在強脫羧酶活性和弱脫氨酶活性。本文發(fā)現(xiàn)25℃和30℃時,煙草赤星病菌在H01～H12微孔中的pH環(huán)境下煙草赤星病菌可高效代謝微孔內(nèi)的全部物質(zhì),而35℃時僅可高效代謝4種,推測溫度對煙草赤星病菌的脫羧酶和脫氨酶活性產(chǎn)生了較大影響,其影響機理有待下一步深入研究。

圖2 煙草赤星病菌在不同溫度和滲透壓下的代謝表型Fig.2 Metabolic features of Alternaria alternata at different temperatures and osmotic pressure

圖3 煙草赤星病菌在不同溫度和pH環(huán)境下的代謝表型Fig.3 Metabolic features of Alternaria alternata under different temperatures and different pH values