中藥醇沉前濃縮液質(zhì)控指標(biāo)的完善及標(biāo)準(zhǔn)建立——以黨參醇沉為例

潘晶晶，任丹丹#，瞿海斌, 3，龔行楚, 3*

中藥醇沉前濃縮液質(zhì)控指標(biāo)的完善及標(biāo)準(zhǔn)建立——以黨參醇沉為例

潘晶晶1, 2，任丹丹1, 2#，瞿海斌1, 2, 3，龔行楚1, 2, 3*

1. 浙江大學(xué)藥學(xué)院，藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058 2. 組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江大學(xué)交叉創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310058 3. 浙江大學(xué)金華研究院，浙江 金華 321016

完善中藥醇沉前濃縮液質(zhì)控指標(biāo)，并建立濃縮液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。制備多批次黨參濃縮液，研究密度與濃縮液其他性質(zhì)間的關(guān)系。將黨參炔苷保留率、與乙醇充分混合的濃縮液質(zhì)量百分比以及單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量作為醇沉工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，開(kāi)展膜分散醇沉實(shí)驗(yàn)研究，篩選濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)并建立其與上述評(píng)價(jià)指標(biāo)的定量模型?；谒Ｐ?，采用預(yù)測(cè)誤差傳播的方法建立黨參濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。濃縮液密度與固含量之間具有良好的線性關(guān)系。相比密度，濃縮液黏度能更靈敏地體現(xiàn)出不同批次濃縮液的性質(zhì)差異。篩選出濃縮液的黏度和固含量為濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)。建立的二階多項(xiàng)式模型2大于0.97。建立了不等式組作為濃縮液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，模型預(yù)測(cè)性能較好，建立的黨參濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為可靠。建議增加黏度作為濃縮液品質(zhì)的控制指標(biāo)，并建立綜合考慮密度和黏度的濃縮液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)放行控制提高醇沉工藝效果及批次間一致性。

中藥醇沉；濃縮液質(zhì)量控制；黨參；黏度；黨參炔苷；葡萄糖；果糖；蔗糖；總黃酮

《中國(guó)藥典》2020年版一部通過(guò)規(guī)定藥材和飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定“制法”項(xiàng)，規(guī)定部分中間體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以及規(guī)定制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]，體現(xiàn)了對(duì)中成藥質(zhì)量的全流程控制。該質(zhì)量控制思路與國(guó)際公認(rèn)的藥品“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”理念不謀而合[2]，即通過(guò)加強(qiáng)原料、中間體和制藥過(guò)程控制，提高藥品質(zhì)量的控制水平。但是，《中國(guó)藥典》2020年版一部中對(duì)中間體標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定明顯少于對(duì)藥材和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。目前，學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界對(duì)制藥中間體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少。

濃縮液是中藥生產(chǎn)中常見(jiàn)的中間體，后續(xù)經(jīng)常是干燥、沉淀或者與其他物料混合等工藝[3-5]。工業(yè)生產(chǎn)中大多以密度作為指標(biāo)控制濃縮終點(diǎn)。但工業(yè)生產(chǎn)中也觀察到密度相同的濃縮液，后續(xù)處理所得產(chǎn)液性質(zhì)相差較大的情況。這提示僅以密度作為濃縮液質(zhì)量指標(biāo)可能是不夠的。

醇沉是中藥濃縮液的下游工藝之一，能部分除去糖、蛋白質(zhì)和鹽類等強(qiáng)極性成分[6-8]，具有成本低、易操作、安全性高、除雜能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。為減少醇沉中活性成分包裹損失，工業(yè)中常用“慢加快攪”或長(zhǎng)時(shí)間靜置的方法[11]。課題組前期提出以“與乙醇充分混合的濃縮液質(zhì)量比例”（well-mixing ratio，WMR）作為定量描述包裹現(xiàn)象的指標(biāo)[12]；WMR值越接近于100%，說(shuō)明包裹現(xiàn)象越少。本課題組采用微混合器加醇，能有效減少包裹損失現(xiàn)象[13]。張寒等[14]和閆安憶等[15]采用了偏最小二乘和逐步回歸等方法建立濃縮液和醇沉工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的定量關(guān)系，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)濃縮液中其他理化性質(zhì)也可能是影響醇沉工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的關(guān)鍵物料屬性。如果增加其他指標(biāo)控制濃縮液品質(zhì)，會(huì)要求新指標(biāo)能夠快速低成本地測(cè)量，以確保工業(yè)應(yīng)用的可行性。黨參醇沉是參芪扶正注射液的重要純化工藝[16]。本實(shí)驗(yàn)以黨參醇沉前的濃縮液為研究對(duì)象，測(cè)定多批次濃縮液的理化性質(zhì)，研究密度與其他性質(zhì)的關(guān)系。進(jìn)一步根據(jù)濃縮液理化性質(zhì)和醇沉工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的關(guān)系，確定濃縮液的關(guān)鍵性質(zhì)。最后采用預(yù)測(cè)誤差傳播的方法建立黨參濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行濃縮液質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Rotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；2 PB-20005II型平流泵，北京興達(dá)科技發(fā)展有限公司；CT3001F型齒輪泵，保定瑞福流體科技有限公司；03-1型磁力攪拌機(jī)，杭州儀表電機(jī)有限公司；DHG-9146A型烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DDBJ-350型便攜式電導(dǎo)率儀，杭州啟威儀器有限公司；Cary60型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Agilent公司；DMA5000M型密度測(cè)量?jī)x、AMVn型黏度測(cè)量?jī)x，奧地利Anton Paar GmbH公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，配備G1314C型VWD檢測(cè)器、Agilent 1260型高效液相色譜儀，配備G4260B型ELSD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司。

1.2 試劑與材料

對(duì)照品-果糖（批號(hào)200519，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.5%）、檸檬黃（批號(hào)201206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95.0%）均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；對(duì)照品-葡萄糖（批號(hào)200917）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.8%；對(duì)照品蔗糖（批號(hào)200620）購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%；對(duì)照品黨參炔苷（批號(hào)200311）、蘆丁（批號(hào)190623）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%。三乙胺購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；乙腈購(gòu)自德國(guó)默克股份有限公司；95%乙醇購(gòu)自浙江常青化工有限公司；超純水由Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備。黨參藥材來(lái)源和批號(hào)見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 膜分散微混合器

課題組前期設(shè)計(jì)制作了膜分散微混合器[13]，能夠?qū)崿F(xiàn)乙醇和濃縮液的連續(xù)高效混合。膜分散微混合器材質(zhì)為聚四氟乙烯，其結(jié)構(gòu)和具體尺寸見(jiàn)之前的工作[13]，采用了平均孔徑為18 μm的不銹鋼膜。

2.2 黨參濃縮液的制備

黨參藥材和水分別按1∶8、1∶6的比例加熱回流提取2次，每次提取0.5 h，濾過(guò)后合并濾液，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮制得密度約為1.2 g/mL的濃縮液。所得濃縮液的編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 黨參藥材來(lái)源、批號(hào)及所得濃縮液的編號(hào)

Table 1 Source and batch number of CodonopsisRadix and number of concentrates

批號(hào)藥材來(lái)源濃縮液編號(hào)批號(hào)藥材來(lái)源濃縮液編號(hào) 191022亳州元豐堂農(nóng)副產(chǎn)品經(jīng)銷有限公司N6190816甘肅岷縣易盛德中藥材有限責(zé)任公司N3 191025亳州元豐堂農(nóng)副產(chǎn)品經(jīng)銷有限公司N14190825甘肅岷縣易盛德中藥材有限責(zé)任公司N7 190929亳州元豐堂農(nóng)副產(chǎn)品經(jīng)銷有限公司N9190908甘肅岷縣易盛德中藥材有限責(zé)任公司N10 191006亳州元豐堂農(nóng)副產(chǎn)品經(jīng)銷有限公司N2190827甘肅岷縣易盛德中藥材有限責(zé)任公司N12 200423亳州永剛飲片廠有限公司N1191018山西潞州參源堂黨參銷售店N15 200331亳州永剛飲片廠有限公司N5191025山西潞州參源堂黨參銷售店N4 191221亳州永剛飲片廠有限公司N8191007山西潞州參源堂黨參銷售店N13 190805甘肅岷縣易盛德中藥材有限責(zé)任公司N11

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇N1、N2、N8、N9、N12、N14共6批黨參濃縮液，只改變濃縮液固含量，進(jìn)行膜分散微混合器醇沉實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)裝置圖如圖1所示。

使用平流泵、齒輪泵分別將乙醇溶液及黨參濃縮液泵入微混合器中。收集出口混合物于錐形瓶中并置于攪拌機(jī)上攪拌5 min后濾過(guò)，收集上清液。實(shí)驗(yàn)后，依次用0.05% Na2CO3溶液和乙醇洗滌該裝置。其中，各批次濃縮液固含量分別為50%、55%、60%。

固定工藝條件如下：醇料比為1.5∶1.0，濃縮液體積流量為60 mL/min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，攪拌時(shí)間為5 min。具體實(shí)驗(yàn)條件如表2所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置圖

2.4 黨參濃縮液中指標(biāo)成分及相關(guān)物理參數(shù)的定量測(cè)定

2.4.1 黨參炔苷含量測(cè)定

（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取黨參炔苷對(duì)照品適量，加20%乙腈溶解并定容至量瓶中，制成0.465 mg/mL黨參炔苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

表2 不同性質(zhì)濃縮液醇沉實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果

Table 2 Experimental conditions and results of ethanol precipitation of concentrates with different properties

編號(hào)實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果 濃縮液濃縮液固含量/%WMR/%黨參炔苷保留率/%單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量/(g?g?1)濃縮液濃縮液固含量/%WMR/%黨參炔苷保留率/%單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量/(g?g?1) 1N95099.9895.580.24211N125599.9593.570.461 2N1250100.0094.900.33712N25599.1593.080.499 3N25099.9694.910.36913N145598.4590.570.519 4N145099.9094.510.37414N15598.2890.390.562 5N145099.7492.920.40815N85598.1689.100.614 6N1450100.0093.570.40616N96085.6784.090.366 7N145099.0992.810.40117N126084.0278.240.605 8N15099.9994.030.46918N26081.8176.040.666 9N85099.9194.150.47419N16080.0773.450.716 10N95599.9793.940.335

（2）供試品溶液的制備：精密量取適量黨參醇沉上清液，加20%乙腈溶解并定容至2mL，搖勻，靜置。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）色譜條件：黨參炔苷含量測(cè)定采用HPLC法[15]。色譜柱為Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)269 nm；流動(dòng)相為乙腈-水（20∶80），等度洗脫；體積流量為1.0 mL/min。典型色譜圖如圖2所示。

圖2 黨參炔苷對(duì)照品(a)、黨參醇沉上清液(b)的典型HPLC-UV圖

（4）線性關(guān)系考察：精密量取黨參炔苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別加入20%乙腈稀釋至93.00、46.50、27.90、18.60、9.40 μg/mL的系列對(duì)照溶液，以上系列對(duì)照溶液進(jìn)樣檢測(cè)后，以峰面積為縱坐標(biāo)（），對(duì)照溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得黨參炔苷的線性回歸方程為＝17.81－9.102，＝0.999 7，線性范圍為9.40～93.00 μg/mL。在此范圍內(nèi)，黨參炔苷質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

（5）精密度試驗(yàn)：取由黨參醇沉上清液[17]制備得到的供試品溶液，按“2.4.1（3）”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以黨參炔苷峰面積計(jì)算精密度RSD為1.3%，表明儀器的精密度良好。

（6）重復(fù)性試驗(yàn)：用黨參醇沉上清液[17]分別制備6份供試品溶液，按“2.4.1（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以黨參炔苷質(zhì)量濃度計(jì)算重復(fù)性RSD為1.7%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

（7）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取黨參醇沉上清液[17]制備得到的供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15 h按“2.4.1（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，黨參炔苷峰面積的RSD為0.7%，表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

（8）加樣回收率試驗(yàn)：分別取已測(cè)定黨參炔苷含量的由黨參醇沉上清液[17]制備得到的供試品9份，分為3組，每組3份。分別按照樣品中質(zhì)量與加入量之比為1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2，精密加入黨參炔苷對(duì)照品適量，加20%乙腈定容至2 mL，搖勻，靜置，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液按“2.4.1（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果黨參炔苷的平均加樣回收率為103.8%，RSD為1.56%，說(shuō)明建立的分析方法準(zhǔn)確，可用于黨參炔苷含量的測(cè)定。

（9）樣品測(cè)定：將樣品按“2.4.1（2）”項(xiàng)中方法配制成供試品溶液，再按“2.4.1（3）”項(xiàng)下色譜條件對(duì)樣品進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定其中的黨參炔苷含量。

2.4.2 葡萄糖、果糖和蔗糖含量測(cè)定

采用HPLC-ELSD法測(cè)定樣品中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量[18]。

（1）對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖對(duì)照品適量，置25 mL量瓶中，用85%乙腈超聲溶解并定容，制成對(duì)照品貯備液。將貯備液定量稀釋，制成系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：分別取適量黨參濃縮液以適量85%乙腈為溶劑進(jìn)行稀釋定容。溶液經(jīng)離心后，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）色譜條件：色譜柱為XBridge BEH Amide柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為34 ℃；體積流量為0.9 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A為0.3%三乙胺水溶液，流動(dòng)相B是0.3%三乙胺-乙腈溶液，梯度洗脫：0～37 min，85%～76% B；37～38 min，76%～60% B；38～48 min，60%～100% B；后運(yùn)行時(shí)間為10 min。ELSD操作參數(shù)如下：霧化器溫度為65 ℃，蒸發(fā)器溫度為60 ℃，氣體體積流量為1.8 L/min。典型色譜圖如圖3所示。

2.4.3 總黃酮含量測(cè)定 采用紫外分光光度法測(cè)定濃縮液中的總黃酮含量[19]。定量移取濃縮液于10mL容量瓶中，依次加入5.0% NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液、1.0 mol/mL NaOH溶液[17]。用50%乙醇定容至10 mL，搖勻，于510 nm處測(cè)定其吸光度（）值[17]。以蘆丁作為對(duì)照品，定量稀釋后測(cè)定值，以蘆丁含量計(jì)算得樣品中總黃酮含量。

圖3 混合對(duì)照品(a)、黨參濃縮液(b) 的典型HPLC-ELSD圖

2.4.4 密度和黏度測(cè)定 濃縮液密度通過(guò)密度測(cè)量?jī)x測(cè)定，不同固含量、不同溫度下的濃縮液密度用表示。濃縮液黏度通過(guò)黏度測(cè)量?jī)x測(cè)定，使用落球黏度計(jì)，根據(jù)落球時(shí)間計(jì)算樣品黏度。不同固含量、不同溫度下的濃縮液黏度用表示。

2.4.5 其他指標(biāo)的測(cè)定

（1）總固體含量測(cè)定：采用重量法[13]。準(zhǔn)確稱取適量樣品，置于恒定質(zhì)量的稱量瓶中，置于烘箱中，在105 ℃下干燥至恒定質(zhì)量后稱定。重復(fù)3次。

（2）電導(dǎo)率：將濃縮液用水稀釋至總固含量為2%，在25 ℃下通過(guò)便攜式電導(dǎo)率儀測(cè)量其電導(dǎo)率。

（3）色素：以檸檬黃作為對(duì)照品，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定濃縮液中色素的含量[20]。波長(zhǎng)設(shè)置為430 nm。濃縮液稀釋后測(cè)定值。以檸檬黃含量計(jì)算樣品中色素含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理

用課題組前期提出的WMR法表征醇沉過(guò)程中混合情況的好壞[12]。WMR值和黨參炔苷保留率的計(jì)算方法分別見(jiàn)公式（1）、（2）。

WMR＝(1/0＋22/0)/(0＋0/2－1) （1）

黨參炔苷保留率＝22/00（2）

0為總固體質(zhì)量濃度，0為黨參炔苷的質(zhì)量濃度，0為醇沉中濃縮液用量，1為乙醇溶液用量，2為所得上清液的總質(zhì)量，2為上清液中總固體質(zhì)量濃度，2為上清液中黨參炔苷質(zhì)量濃度，濃縮液與乙醇混合越充分，WMR值越接近1

選擇黨參炔苷保留率、WMR以及單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量作為醇沉工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用多元線性回歸法，用公式（3）建立工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)和濃縮液性質(zhì)的定量模型，篩選出濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)。

（3）

為平方根反正弦變化后的黨參炔苷保留率、平方根反正弦變化后的WMR值、單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量，0為常數(shù)項(xiàng)，a為各項(xiàng)的偏回歸系數(shù)X為濃縮液各性質(zhì)

采用逐步回歸法對(duì)模型進(jìn)行簡(jiǎn)化，添加及刪除模型中各項(xiàng)的顯著性水平設(shè)為0.1，模型中剩余的項(xiàng)認(rèn)為是濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)。數(shù)據(jù)分析由V 11.0.0 Design Expert（美國(guó)Stat-Ease公司）軟件完成。

用2階多項(xiàng)式模型擬合工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)與關(guān)鍵濃縮液性質(zhì)的定量模型，如公式（4）所示。通過(guò)向后逐步回歸法簡(jiǎn)化方程，值設(shè)置為0.10。

（4）

3 結(jié)果

3.1 不同批次濃縮液的理化性質(zhì)

不同來(lái)源、不同批號(hào)的黨參藥材制備所得15批黨參濃縮液的理化性質(zhì)見(jiàn)表3。其中包括電導(dǎo)率（1，固含量45%）、黨參炔苷含量（2）、果糖含量（3）、葡萄糖含量（4）、蔗糖含量（5）、色素含量（6）、總黃酮含量（7）、密度（固含量45%，25 ℃，，8）、黏度（固含量45%，25 ℃，，9）。各批濃縮液中所測(cè)得的黨參炔苷、葡萄糖、果糖、蔗糖、色素和總黃酮含量的總和為濃縮液總固體的25.64%～73.00%，提示不同批次黨參濃縮液化學(xué)組成相差較大。在相同溫度和固含量下，15批濃縮液密度的RSD為1.078%，是所有指標(biāo)中變化最小的，提示密度指標(biāo)不適合用于體現(xiàn)不同批次藥材所得濃縮液的差異。黨參炔苷含量、蔗糖含量、色素含量和黏度的RSD均超過(guò)了40%。

3.2 密度與濃縮液其他性質(zhì)之間的關(guān)系

3.2.1 密度與濃縮液其他性質(zhì)的相關(guān)性 計(jì)算了表3中濃縮液密度與濃縮液其他性質(zhì)的Pearson相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表4所示。在檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05的情況下，認(rèn)為濃縮液密度（8）與電導(dǎo)率（1）、總黃酮含量（7）均有正相關(guān)關(guān)系，與黨參炔苷含量（2）存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。因?yàn)橄嚓P(guān)系數(shù)檢驗(yàn)值大于0.05，所以認(rèn)為濃縮液密度（8）與果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量、色素含量、黏度之間的線性相關(guān)關(guān)系不顯著。

3.2.2 密度與濃縮液溫度的關(guān)系 測(cè)定了15批濃縮液密度與溫度的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。濃縮液的密度與溫度是線性關(guān)系，且隨溫度的上升而下降。用線性公式＝0＋1擬合，結(jié)果如表5所示，各方程2均大于0.99，擬合效果較好。

表3 濃縮液理化性質(zhì)

Table 3 Physicochemical properties of concentrates

濃縮液Z1/(mS?cm?1)Z2/(μg?g?1)Z3/(mg?g?1)Z4/(mg?g?1)Z5/(mg?g?1)Z6/(mg?g?1)Z7/(mg?g?1)Z8/(g?mL?1)Z9/(mPa?s) N120.08341.8306.979.5056.274.1383.7091.216101.88 N222.20453.0343.089.4331.184.0115.1071.20359.41 N319.91313.8324.896.8649.391.6353.6321.20546.43 N423.00405.5284.070.12117.621.3704.2041.21341.82 N521.10431.5174.156.6419.491.9623.8031.210101.45 N621.60434.9308.375.01103.801.5864.2961.21450.74 N718.61684.0379.661.14147.601.5845.2761.20978.30 N818.09351.3373.490.8175.402.4032.7941.187111.66 N924.0018.5585.9136.720.001.5265.8751.22619.36 N1020.10542.2409.466.75138.511.4803.6721.21356.55 N1119.44391.3336.7102.2149.213.8764.4441.18759.80 N1216.58589.0438.861.96154.140.8292.8591.19031.06 N1321.40144.2504.1106.9456.362.9166.0291.23238.41 N1418.98294.8450.796.1468.652.5884.2381.21287.60 N1520.40137.2444.592.9760.172.3804.1121.21741.32 平均值20.37368.9377.685.5475.182.2864.2701.20961.72 標(biāo)準(zhǔn)差1.93175.699.921.4147.141.0400.9600.01328.17 RSD/%9.5047.5926.4525.0262.7045.5122.491.07845.64

表4 密度(Z8)與濃縮液的部分其他性質(zhì)的Pearson相關(guān)系數(shù)及其檢驗(yàn)的P值

Table 4 Pearson correlation coefficient and P value between density (Z8) and some other properties of concentrates

理化性質(zhì)Pearson相關(guān)系數(shù)P值理化性質(zhì)Pearson相關(guān)系數(shù)P值 Z10.6490.009Z5?0.2370.395 Z2?0.5220.046Z6?0.0640.821 Z30.3380.218Z70.6420.010 Z40.2790.315Z9?0.3060.267

3.2.3 密度與濃縮液固含量的關(guān)系 選擇理化性質(zhì)相差較大的2批濃縮液N1和N12，改變固含量測(cè)定其密度，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢钥吹?，濃縮液的密度隨固含量的提高而增大，相同固含量的不同批次濃縮液在相同溫度下的密度差別較小。嘗試用線性方程＝0＋1擬合濃縮液密度與固含量，得0＝0.517±0.009，1＝0.973±0.005，2＝0.995。從結(jié)果來(lái)看，濃縮液固含量和密度之間的線性關(guān)系相當(dāng)好，提示濃縮液固含量和密度指標(biāo)在很大程度上可以相互替代。黃慧敏等[21]研究濃縮液固含量和密度之間的關(guān)系時(shí)，也得到類似結(jié)論?？紤]到濃縮液密度大小受實(shí)驗(yàn)室溫度影響，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以固含量代替密度。

3.3 濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)篩選

不同性質(zhì)濃縮液的醇沉實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由于WMR值、黨參炔苷保留率均為百分率數(shù)據(jù)，所以建模前將WMR值、黨參炔苷保留率進(jìn)行平方根反正弦變換。采用公式（3）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，建立濃縮液性質(zhì)與平方根反正弦變化后的WMR值（1）、平方根反正弦變化后的黨參炔苷保留率（2）和單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量（3）的定量模型，進(jìn)而識(shí)別出濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)。

公式（3）是一個(gè)多元線性回歸模型，為了避免自變量之間的多重共線性現(xiàn)象，與密度具有較高相關(guān)性的電導(dǎo)率、總黃酮和黨參炔苷含量不參與建模。逐步回歸后所得偏回歸系數(shù)及方差分析結(jié)果如表6所示。各模型的顯著水平＜0.000 1，說(shuō)明模型顯著。模型2均大于0.75，說(shuō)明可以解釋大部分變異。根據(jù)模型結(jié)果可知，濃縮液的關(guān)鍵性質(zhì)為固含量和黏度。

圖4 濃縮液密度隨溫度變化

表5 密度隨溫度變化的擬合結(jié)果

Table 5 Fitting results of density and temperature

濃縮液c0/(×10?4 g·mL?1·℃?1)c1/(g·mL?1)R2濃縮液c0/(×10?4 g·mL?1·℃?1)c1/(g·mL?1)R2 N1?5.347±0.1361.229±0.0010.998 1N9?5.855±0.1211.241±0.0010.998 7 N2?5.225±0.1401.216±0.0010.997 8N10?5.475±0.1341.226±0.0010.997 6 N3?5.346±0.1371.218±0.0010.998 0N11?5.896±0.2271.201±0.0010.995 6 N4?5.442±0.1301.227±0.0010.998 2N12?5.323±0.1451.203±0.0010.997 8 N5?5.369±0.1251.223±0.0010.997 8N13?5.661±0.2541.246±0.0010.998 5 N6?5.422±0.1381.227±0.0010.997 6N14?5.475±0.1331.226±0.0010.997 6 N7?5.386±0.1401.222±0.0010.997 9N15?5.456±0.1391.230±0.0010.997 4 N8?5.900±0.2271.202±0.0010.995 6

圖5 濃縮液密度隨固含量變化

密度變化能夠較準(zhǔn)確地體現(xiàn)出濃縮液中水含量變化，所以工業(yè)生產(chǎn)中以密度作為指標(biāo)來(lái)控制濃縮終點(diǎn)是很合理的?？紤]到密度與固含量的高相關(guān)性，表6中自然地篩選出固含量作為關(guān)鍵性質(zhì)。但是從表6結(jié)果來(lái)看，僅以密度作為濃縮液質(zhì)量指標(biāo)是不夠的。黏度同樣是與醇沉效果相關(guān)的重要指標(biāo)?？紤]到黏度也可以采用在線黏度計(jì)測(cè)定，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中能夠?qū)崿F(xiàn)快速低成本的檢測(cè)，所以建議工業(yè)生產(chǎn)中同時(shí)將密度和黏度作為濃縮液關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行控制。

表6 多元線性回歸模型的偏回歸系數(shù)及方差分析

Table 6 Partial regression coefficient and variance analysis of multiple linear regression model

模型項(xiàng)Y1Y2Y3 偏回歸系數(shù)P值偏回歸系數(shù)P值偏回歸系數(shù)P值 常量3.372 8?2.592 2??1.073 4? 固含量???0.000 70.032 00.002 5＜0.000 1 黏度?0.036 0＜0.000 1?0.023 8＜0.000 10.025 5＜0.000 1 R20.789 30.833 60.853 1 Radj20.776 90.812 80.833 6 P值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1

3.4 濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)對(duì)膜分散黨參醇沉工藝效果的影響

將濃縮液的黏度取自然對(duì)數(shù)，WMR值、黨參炔苷保留率進(jìn)行平方根反正弦變換，采用公式（4）研究濃縮液固含量（1）、濃縮液黏度的自然對(duì)數(shù)（2）與平方根反正弦變化后的WMR值（1）、平方根反正弦變化后的黨參炔苷保留率（2）、單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量（3）的定量關(guān)系，建模結(jié)果如表7所示。模型的值均小于0.05，說(shuō)明模型顯著；模型2均大于0.90，說(shuō)明可以解釋大部分變異。各指標(biāo)的等高線圖如圖6所示。WMR值和黨參炔苷保留率隨濃縮液固含量、濃縮液黏度的增加而降低，說(shuō)明較大的濃縮液黏度及固含量都不利于濃縮液和乙醇的充分混合。單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀的質(zhì)量隨濃縮液固含量、濃縮液黏度的增加而增加，說(shuō)明濃縮液黏度越大，其所含的不溶于乙醇的可沉淀物質(zhì)越多。

3.5 濃縮液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

濃縮液是中藥生產(chǎn)中重要的中間體，其質(zhì)量影響后續(xù)的醇沉等精制過(guò)程，因此，建立濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)非常重要。本研究采用WMR值、黨參炔苷保留率以及單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量為指標(biāo)建立黨參濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以固含量和濃縮液黏度對(duì)平方根反正弦變化后的WMR（1）、平方根反正弦變化后的黨參炔苷保留率（2）、單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量（3）建模，所建立的模型如公式（5）所示。

表7 二階多項(xiàng)式回歸模型的偏回歸系數(shù)及方差分析

Table 7 Partial regression coefficients and variance analysis of second-order polynomial regression models

模型項(xiàng)Y1Y2Y3 偏回歸系數(shù)P值偏回歸系數(shù)P值偏回歸系數(shù)P值 常量?13.240??8.330?0.209? X158.345＜0.000 136.389＜0.000 1?0.499＜0.000 1 X2?0.0440.000 80.215＜0.000 1?0.286＜0.000 1 X1X2???0.4790.005 80.7750.054 3 X12?56.826＜0.000 1?33.744＜0.000 1?? R20.975 40.982 50.916 6 Radj20.970 40.977 50.900 0 P值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1

圖6 WMR值(Y1)、黨參炔苷保留率(Y2)和單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量(Y3)的等高線圖

1＝?13.240＋58.3451－0.0442－56.82612

2＝?8.330＋36.3891＋0.2152－0.47912－33.74412

3＝0.209－0.4991－0.2862＋0.77512（5）

采用預(yù)測(cè)誤差傳播的方法對(duì)濃縮液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算[22]。假設(shè)殘差服從均值為零的正態(tài)分布，正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)差與殘差相同，即分別為0.024 9、0.013 1、0.039 4。若要求WMR值大于95%的概率為90%，黨參炔苷保留率大于90%的概率為90%，單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量大于0.300 g/g的概率為90%，則根據(jù)公式（5）建立不等式組（6）。

1＝?13.240＋58.3451－0.0442－56.82612－0.1×SDresidual1≥1.345

2＝?8.330＋36.3891＋0.2152－0.47912－33.74412－0.1×SDresidual2≥1.249

3＝0.209－0.4991－0.2862＋0.77512－0.1×SDresidual3≥0.300 （6）

其中0.1為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的臨界值，即1.282。將不等式組（6）化簡(jiǎn)得不等式組（7）。

58.3451－0.0442－56.82612－14.616 9≥0

36.3891＋0.2152－0.47912－33.74412－9.595 8≥0

?0.4991－0.2862＋0.77512－0.141 5≥0 （7）

符合不等式組（7）的為合格濃縮液，應(yīng)予以放行直接投入醇沉工藝，不符合不等式（7）的為不合格濃縮液，可在合規(guī)的情況下稀釋后再投入醇沉工藝生產(chǎn)。使用MATLAB（R2016a，美國(guó)The Math Works公司）依據(jù)不等式（7）做圖，濃縮液性質(zhì)的具體可行范圍如圖7所示。

3.6 濃縮液質(zhì)量控制的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇編號(hào)為N5、N11、N15的濃縮液進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將N5濃縮液的固含量稀釋至55%，N15濃縮液固含量稀釋至53%，N11的濃縮液分別稀釋至52%和56%。進(jìn)行4組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（V1～V4）。將濃縮液性質(zhì)代入不等式組（7），固含量為53%的N15、固含量為52%的N11滿足不等式組（7），是合格濃縮液。固含量為55%的N5、固含量為56%的N11不滿足不等式組（7），為不合格濃縮液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果分別見(jiàn)表8及圖7所示。從驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值接近，說(shuō)明所建模型有較好的預(yù)測(cè)性能。V1和V3實(shí)驗(yàn)所得的黨參炔苷保留率低于90%，未達(dá)到預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)。V2和V4的實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果符合預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明采用不等式組（7）能夠較好地控制濃縮液品質(zhì)。

圖7 濃縮液性質(zhì)的可行范圍及驗(yàn)證點(diǎn)

3.7 濃縮液黏度和濃縮液部分其他性質(zhì)之間的相關(guān)性

表9列出了濃縮液黏度與濃縮液部分其他性質(zhì)之間Pearson相關(guān)系數(shù)及值。發(fā)現(xiàn)黏度（9）與其他測(cè)得的性質(zhì)相關(guān)性不強(qiáng)（＞0.1）。表3中不同批次濃縮液黏度相差較大（RSD＝45.64%），說(shuō)明影響濃縮液黏度的可能是某些本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)的物質(zhì)，比如一些相對(duì)分子質(zhì)量較大的成分。這也意味著濃縮液黏度提供了一些其他檢測(cè)指標(biāo)未能反映出來(lái)的信息，檢測(cè)黏度會(huì)有利于全面表征出不同批次濃縮液中固體成分的差異。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)點(diǎn)條件及工藝指標(biāo)考察結(jié)果

Table 8 Verification experimental points conditions and process index investigation results

試驗(yàn)點(diǎn)是否滿足不等式濃縮液濃縮液固含量/%固含量45%、25 ℃下黏度/(mPa?s)黨參炔苷保留率/%WMR/%單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量/(g·g?1) 實(shí)測(cè)值預(yù)測(cè)值實(shí)測(cè)值預(yù)測(cè)值實(shí)測(cè)值預(yù)測(cè)值 V1否N555101.4587.5189.1998.1197.880.5700.582 V2是N115259.8093.7793.84100.2199.760.4300.428 V3否N115659.8087.4888.9097.4997.130.5310.535 V4是N155341.3293.8293.65100.3599.790.4190.409

表9 濃縮液黏度(Z9)與濃縮液部分其他性質(zhì)之間Pearson相關(guān)系數(shù)及P值

Table 9 Pearson correlation coefficient and P value between viscosity and some other properties of concentrates

理化性質(zhì)Pearson相關(guān)系數(shù)P值理化性質(zhì)Pearson相關(guān)系數(shù)P值 Z1?0.3720.172Z5?0.0730.769 Z20.2910.293Z60.3820.160 Z3?0.5280.043Z7?0.3960.144 Z4?0.3610.186Z8?0.3060.267

3.8 濃縮液固含量與黏度的關(guān)系

選擇2批濃縮液N1和N12，改變固含量測(cè)定其黏度，并嘗試用指數(shù)型關(guān)系式＝0×e1x（0、1為常數(shù)項(xiàng)）進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如圖8和表10所示。濃縮液的黏度隨固含量的增加而增大。在固含量較大時(shí)，黏度隨固含量的增加上升明顯。與濃縮液N12相比，濃縮液N1的黏度隨固含量的增加上升較快。

圖8 濃縮液黏度隨固含量變化

表10 黏度隨固含量變化的擬合結(jié)果

Table 10 Fitting results of viscosity and solid content

濃縮液批號(hào)f0/(mPa?s)f1R2 N10.014 0±0.009 018.319±1.0070.994 5 N120.001 7±0.001 019.594±1.0720.994 7

3.9 濃縮液黏度與溫度的關(guān)系

測(cè)定了15批濃縮液黏度與溫度的關(guān)系，結(jié)果如圖9所示。濃縮液黏度隨溫度的上升而下降。用指數(shù)公式＝0×e1x（0、1為常數(shù)項(xiàng)）擬合，結(jié)果如表11所示，各方程2均大于0.99，擬合效果較好。根據(jù)圖9，當(dāng)溫度較低時(shí)，不同批次的濃縮液黏度相差較大；隨著溫度的升高，不同批次濃縮液黏度的差距變小。

4 討論

本研究首先制備了不同批次的黨參濃縮液，并測(cè)定了濃縮液的理化性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)相同溫度和固含量下，密度的RSD是所有指標(biāo)中變化最小的，提示密度不適合用于體現(xiàn)不同批次濃縮液的差異。研究了濃縮液各性質(zhì)與密度的關(guān)系，用線性方程擬合獲得了濃縮液密度與溫度、固含量的定量關(guān)系。發(fā)現(xiàn)濃縮液固含量和密度間的線性關(guān)系很好。

圖9 濃縮液黏度隨溫度變化

表11 黏度隨溫度變化的擬合結(jié)果

Table 11 Fitting results of viscosity and temperature

濃縮液g0/(mPa?s)g1/℃?1R2濃縮液g0/(mPa?s)g1/℃?1R2 N1290.6±14.0?0.040 4±0.002 00.994 8N954.3±2.2?0.039 8±0.001 70.996 2 N2179.1±10.8?0.042 0±0.002 50.992 3N10166.5±7.8?0.041 6±0.001 90.995 3 N3131.0±7.2?0.039 5±0.002 20.993 0N11171.7±8.8?0.040 4±0.002 10.994 0 N4119.7±5.6?0.040 4±0.001 90.995 1N1278.9±3.1?0.036 0±0.001 60.995 8 N5295.0±13.4?0.040 9±0.001 80.995 6N13106.4±4.1?0.040 2±0.001 60.996 7 N6164.9±12.3?0.044 2±0.003 20.989 2N14197.3±8.3?0.034 2±0.001 60.994 9 N7226.4±11.4?0.040 8±0.002 10.994 4N15122.1±2.8?0.043 7±0.001 00.999 0 N8350.7±21.8?0.043 4±0.002 60.992 2

改變濃縮液的固含量進(jìn)行膜分散醇沉實(shí)驗(yàn)，將黨參炔苷保留率、WMR值、單位質(zhì)量濃縮液產(chǎn)生沉淀質(zhì)量作為工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選確定濃縮液固含量及黏度為濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)。隨后建立了濃縮液固含量及黏度與工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的定量模型，模型2均大于0.90。基于所建模型，采用預(yù)測(cè)誤差傳播的方法建立了濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，符合不等式組的為合格濃縮液，可予以放行投入醇沉工藝；不符合不等式組的為不合格濃縮液。濃縮液質(zhì)量控制的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型有較好預(yù)測(cè)性能，所制定的濃縮液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為可靠。濃縮液黏度隨著固含量的增加而增加，隨溫度的提高而降低，與本研究所檢測(cè)的其他濃縮液理化性質(zhì)相關(guān)性較小。目前工業(yè)生產(chǎn)中大多僅控制醇沉前濃縮液密度或體積，本研究建議增加黏度作為濃縮液品質(zhì)的控制指標(biāo)，從而能在藥材批次變化時(shí)更好地表征出濃縮液質(zhì)量差異。

本研究的不足之處包括：第一，在測(cè)定黨參濃縮液時(shí)并未檢測(cè)所有可能的指標(biāo)，包括多糖含量和蛋白質(zhì)含量等。如果獲得更多指標(biāo)進(jìn)行分析，有可能使篩選得到的濃縮液關(guān)鍵性質(zhì)改變。第二，中藥種類多且成分復(fù)雜，不同中藥水煎濃縮液的性質(zhì)指標(biāo)可能差異較大，黏度能否用于完善其他中藥濃縮液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍有待進(jìn)一步考察。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Improvement and establishment of concentrate quality standard of concentrate quality control index for ethanol precipitation process of traditional Chinese medicine: A case study of

PAN Jing-jing1, 2, REN Dan-dan1, 2, QU Hai-bin1, 2, 3, GONG Xing-chu1, 2, 3

1. Pharmaceutical Informatics Institute, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 2. State Key Laboratory of Component-Based Chinese Medicine, Innovation Center in Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 3. Jinhua Institute of Zhejiang University, Jinhua 321016, China

To improve the quality control index of concentrate before ethanol precipitation of traditional Chinese medicine and establish the quality standard of concentrate.Multiple batches of Dangshen () concentrates were prepared to study the relationship between density and other properties of the concentrates. The lobetyolin recovery, mass percentage of concentrate fully mixed with ethanol solution and precipitate mass generated per gram concentrate were used as indicators of ethanol precipitation process. The membrane dispersion ethanol precipitation experiments were carried out to screen the critical properties of concentrates. The quantitative models between the above evaluation indicators and critical properties of concentrates were established. Based on the established models, the quality standard ofconcentrates was established by using a prediction error propagation method and verified by experiments.There was a good linear relationship between density and solid content of concentrate. Compared with density, viscosity of concentrate could more sensitively reflect the property differences of different batches of concentrates. The viscosity and solid content were selected as the critical properties of the concentrates.2values of the established second-order polynomial models were greater than 0.97. The verification experimental results showed that the prediction performance of the models was good, and the established quality standard ofconcentrates was reliable.It was recommended to increase the viscosity as a quality control index of concentrates. By establishing the quality standard of concentrates that comprehensively consider density and viscosity, batch-to-batch consistency of ethanol precipitation process is expected to be improved.

ethanol precipitation of traditional Chinese medicine; concentrate quality control;; viscosity; lobetyolin; glucose; fructose; sucrose; total flavone

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 6012 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.008

2022-04-14

國(guó)家中醫(yī)藥管理局創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（ZYYCXTD-D-202002）

潘晶晶，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹扑幑こ?。E-mail: 21819006@zju.edu.cn

龔行楚，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail: gongxingchu@zju.edu.cn

#共同第一作者：任丹丹，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹扑幑こ獭-mail: 22019007@zju.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]