重組禽流感疫苗免疫抗體檢測(cè)操作方法及注意事項(xiàng)

黃 新 平和縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建 平和 363700

高致病性禽流感是一種由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的以禽類感染為主、人畜共患的一類動(dòng)物疫病。我國(guó)長(zhǎng)期將高致病性禽流感列入強(qiáng)制免疫重要疫病之一，鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村級(jí)禽散養(yǎng)戶、禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)要常年對(duì)禽類強(qiáng)制免疫疫苗，縣級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室需定期對(duì)禽類進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)。2022年，福建省采用重組禽流感三價(jià)滅活疫苗對(duì)家禽進(jìn)行免疫，現(xiàn)就血清學(xué)抗體檢測(cè)具體操作方法及結(jié)果介紹如下。

1 樣品準(zhǔn)備

1.1 樣品采集 平和縣霞寨鎮(zhèn)高寨村盧某雞養(yǎng)殖場(chǎng)存欄90日齡雞2 530羽，分別于2022年3月20日、4月11日用吉林冠界生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的重組禽流感（H5＋H7）三價(jià)滅活疫苗二次免疫注射。用一次性注射器采集該養(yǎng)殖場(chǎng)40頭份雞全血，每份1 mL左右；采好血樣的注射器要留有空氣，斜放在有冰袋的采樣箱內(nèi)。

1.2 樣品處理 樣品應(yīng)及時(shí)處理，將注射器內(nèi)的血全部注射到1.5～2 mL離心管內(nèi)；用記號(hào)筆按1～40做好編號(hào)標(biāo)注；打開(kāi)離心機(jī)，將樣品對(duì)稱放置，5 000 r/min常溫下離心5 min。

2 血凝(HA)試驗(yàn)與血凝抑制（HI）試驗(yàn)

2.1 材料準(zhǔn)備96孔V型一次性反應(yīng)板19個(gè)；5～50 uL單 道 移 液 槍1把，10～100 uL多 道 移 液 槍1把；pH7.2、0.01 mol/L PBS溶液；哈爾濱國(guó)生生物有限公司生產(chǎn)的高致病性禽流感病毒H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re14株抗原及其陰性、陽(yáng)性血清各1瓶。

1%雞紅細(xì)胞懸液制備。用含抗凝劑的一次性注射器抽取未免疫過(guò)禽流感疫苗的公雞翅靜脈血10 mL，搖勻，分別裝入兩支離心管中，對(duì)稱放置在離心機(jī)上，依次在2 000 r/min、3 500 r/min、5 000 r/min離心，每次5 min，每次離心后吸棄離心管內(nèi)血液上清液、分層中透明及無(wú)色部分，只留下紅細(xì)胞。取紅細(xì)胞0.5 mL，加入PBS溶液49.5 mL，制成50 mL1%雞紅細(xì)胞懸液。

2.2 血凝試驗(yàn)操作步驟

1）在96孔反應(yīng)板第1～12孔上，用多道移液槍加入25 uLPBS溶液3排，換滴頭。

2）多道移液槍裝3個(gè)滴頭，第一排、第二排、第三排的第1孔分別加入H5-Re13株抗原、H5-Re14株抗原、H7-Re14株抗原25 uL，混勻。

3）從每一排的第1孔吸25 uL到第2孔，混勻后再移25 uL到第3孔，如此依次稀釋至第11孔，從第11孔吸25 uL棄之，換滴頭。

4）每孔加入25 uL PBS，換滴頭。

5）每孔再加入1%雞紅細(xì)胞懸液25 uL。

6）充分振蕩，20～25℃室溫下靜置40 min后觀察結(jié)果。

7）將反應(yīng)板斜立，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚滴狀流淌，不流淌的是完全血凝，最高稀釋倍數(shù)代表1個(gè)血凝單位。經(jīng)觀察，第一排H5-Re13株抗原是10孔，第二排H5-Re14株抗原是9孔，第三排H7-Re14株抗原是10孔。

表1 樣品HI效價(jià)測(cè)定結(jié)果

2.3 血凝抑制試驗(yàn)操作步驟

1）根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果，配制4 HAU病毒抗原，H5-Re13株的終點(diǎn)滴度為1:1 024，則4 HAU抗原的稀釋倍數(shù)是1:256（1 024除以4）；H5-Re14株抗原的稀釋倍數(shù)是1:128；H7-Re14株抗原的稀釋倍數(shù)是1:256。

2）在18個(gè)反應(yīng)板的第1～11孔用多道移液槍加入25 uL PBS，第12孔加入50 uL PBS，換滴頭。

3）在第一板的第1孔加入禽流感陰性血清25 uL，混勻后吸25 uL至第2孔，依次稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 uL棄之，換滴頭。

4）在第一板的第2孔加入禽流感陽(yáng)性血清25 uL，混勻后吸25 uL至第2孔，依次稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 uL棄之，換滴頭。

5）在第一板的第3孔加入25 uL樣品血清，混勻后吸25 uL至第2孔，依次稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 uL棄之，直至40個(gè)樣品全部對(duì)比稀釋完成，每個(gè)樣品換1個(gè)滴頭。以上三步再重復(fù)兩次。

6）在1～6反應(yīng)板的1～11孔均加入含4 HAU混勻的H5-Re13株25 uL，換滴頭；在7～12反應(yīng)板的1～11孔均加入含4HAU混勻的H5-Re14株25 uL，換滴頭；在13～18反 應(yīng)板的1～11孔 均 加 入 含4 HAU混勻的H7-Re14株25 uL，換滴頭；20～25℃室溫下靜置30 min。

7）每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液25 uL，混勻，靜置40 min后觀察結(jié)果。

3 試驗(yàn)判定與結(jié)果

陰性對(duì)照12孔全部呈鈕扣狀、沉到孔底，陽(yáng)性對(duì)照孔1～10孔呈淚滴狀流淌，該結(jié)果成立。測(cè)得40個(gè)樣品中有1個(gè)呈陰性、39個(gè)呈陽(yáng)性，抗體合格率達(dá)97.5%，樣品的HI效價(jià)見(jiàn)表1。

4 問(wèn)題及對(duì)策

在禽流感血清學(xué)抗體檢測(cè)過(guò)程中，常出現(xiàn)的一些問(wèn)題及對(duì)策如下。

1）在制備公雞紅細(xì)胞懸液時(shí)，剛開(kāi)始離心時(shí)轉(zhuǎn)速不能過(guò)快，防止紅細(xì)胞破裂而溶血，第一次離心轉(zhuǎn)速用2 000 r/min，第二次用3 500 r/min，第三次用5 000 r/min，每次離心5 min。

2）試驗(yàn)過(guò)程中使用的生理鹽水，應(yīng)采用0.9%氯化鈉，濃度過(guò)高會(huì)引起紅細(xì)胞凝固、抗原失效，造成試驗(yàn)失敗。所以，每次試驗(yàn)前要檢查是否使用生理鹽水；加完紅細(xì)胞后要進(jìn)行振蕩，使所加的樣品與試劑、紅細(xì)胞完全溶合。

3）使用移液槍時(shí)，每完成一個(gè)步驟要換滴頭，每個(gè)樣品要使用1個(gè)滴頭。

敬 告：作者在撰寫論文時(shí)應(yīng)本著實(shí)事求是、科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、尊重他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的精神，適當(dāng)參考、引用已公開(kāi)發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)資料，但不可抄襲。本刊將用“學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)”對(duì)所有來(lái)稿進(jìn)行檢測(cè)、分析，反對(duì)并打擊學(xué)術(shù)不端行為。

（本刊編輯部）