王燦，屈用函，王紹祥，趙強(qiáng)彪，謝志強(qiáng)，張雪廷

（文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663000）

隨著植物根際微生物組（rhizosphere microbiome）研究的開展，根際微生物研究新技術(shù)新方法、根際促生菌資源篩選與應(yīng)用、植物/微生物互作信號與調(diào)控機(jī)制、根際微生物與植物逆境響應(yīng)機(jī)制、根際微生物與耕作土壤修復(fù)、根際微生物與植物生長發(fā)育等已成為研究的熱點(diǎn)，同時也為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境生態(tài)保護(hù)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐［1-3］。根際微生物和植物息息相關(guān)、密不可分，研究表明植株通過根系向土壤中分泌糖類、氨基酸、酶類、酚酸類、有機(jī)酸、生長因子、抗菌物質(zhì)等來影響根際周圍的土壤微生物環(huán)境［3-5］，選擇性“招募”對自己有益的微生物來協(xié)助自身生長發(fā)育和抵御各種非生物因素干擾及生物脅迫。

文山州地處云南邊界，位于云南省東南部低緯度高原地區(qū)。作為云南最大的辣椒種植地，文山州具有豐富多樣的辣椒種質(zhì)資源［6］。小米辣（Capsicum frutescensL.）是茄科辣椒屬一年或多年生灌木狀辣椒（冷涼地區(qū)1年生，熱區(qū)多年生），主產(chǎn)于中國西南邊陲，含有豐富的礦質(zhì)元素和微量元素，具有獨(dú)特芳香和辛辣味，深受當(dāng)?shù)厝嗣裣矏?。育種者也培育出了一些耐瘠、耐旱、株型大、豐產(chǎn)的優(yōu)良小米辣新品種［7］。但目前與辣椒相關(guān)的研究主要集中于1年生辣椒（Capsicum annuumL.）如朝天椒等，與小米辣相關(guān)的研究卻鮮有報(bào)道。為促進(jìn)小米辣育種與栽培工作，本研究采用16S rDNA對本地小米辣根際土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行擴(kuò)增子測序，旨在探明不同品種小米辣根系分泌物對其根際細(xì)菌群落定植的影響，分析之間群落結(jié)構(gòu)差異，為小米辣生長地下部分與微生物的互作關(guān)系、根際細(xì)菌指示物種分析、篩選研究奠定基礎(chǔ)。這對于了解不同環(huán)境下土壤微生物多樣性與種植環(huán)境的相關(guān)性，確定小米辣根系分泌物調(diào)節(jié)微生物群落構(gòu)建的主要因素等工作具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

灌木辣椒（Capsicum frutescensL.）本地野生品種小米辣‘M218’（X處理）和人工選育品種小米辣‘M240’（Y處理）由文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院張雪廷老師提供（圖1）。育苗基質(zhì)為‘湘正農(nóng)科’牌商品育苗基質(zhì)，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湘暉農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所研制，主要成分是草炭土。土 壤 基質(zhì)性質(zhì)如下：堿解氮（92.30±0.39）mg/kg、速效磷（54.56±0.45）mg/kg、速效鉀（938.72±0.11）mg/kg、碳 氮 比1.47±0.55、pH5.28±0.030、EC值（712.67±0.17）μs/cm。

圖1 辣椒試驗(yàn)材料果實(shí)表型示意圖

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗(yàn)及樣品采集

試驗(yàn)地點(diǎn)為文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，時間為2021年9月至2022年5月。試驗(yàn)共2個處理，每個處理3次重復(fù)，每盤為一次生物學(xué)重復(fù)，分別是小米辣‘M218’（X處理）和小米辣‘M240’（Y處理）。

將發(fā)芽整齊一致的辣椒種子播種于苗盤（27孔）中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，常規(guī)管理育苗。苗齡為70 d時，采用5點(diǎn)取樣法選取植株，將植株整株拔出，抖落附著土壤基質(zhì)后用單獨(dú)無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質(zhì)，各處理的5棵苗混合為1次重復(fù)后放入50 mL無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運(yùn)輸，后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測定項(xiàng)目

使用Magen核酸提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢 測DNA濃 度。以20—30 ng DNA為 模 板，由GENEWIZ,Inc（South Plainfield，NJ）公司完成二代測序文庫構(gòu)建和測序。16S rDNA上包括V3及V4的2個高度可變區(qū)，通過Illumina MiSeq進(jìn)行雙端測序。引物系列如下：

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

原始數(shù)據(jù)整理采用Office 2019軟件。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)化使用Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6、Qiime 1.9.1。作 圖 采 用GraphPad Prism 9.0、Office 2019。測序數(shù)據(jù)優(yōu)化后質(zhì)量見表1。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

從圖2a可以看出，共有OTU數(shù)為379個，其中‘M218’獨(dú)有OTU為3個，‘M240’獨(dú)有的OTU為1個。門水平下共獲得13個物種種類（圖2b），第一大優(yōu)勢菌群是變形菌門（Proteobacteria），各樣本中分別占61.29 %和63.76 %，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes），各樣本中分別占13.55 %和12.08 %。放線菌門（Actinobacteriaz）中‘M218’和‘M240’分 別 是6.17 %和5.68 %。屬水平下（圖2c），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是第一大優(yōu)勢菌屬，但‘M218’（14.88 %）高于‘M218’（7.11 %）。說明種植不同辣椒品種對其根際微生物群落物種豐度存在一定的影響差異。

圖2 不同樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)描述

2.2 根際細(xì)菌群落多樣性分析

α多樣性 比 較中，Ace和Chao1是 反 映菌群豐富度的指標(biāo)，數(shù)值越小表明豐富度越低。Shannon、Simpson是反映菌群多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值越小表明群落多樣性越低。X處理和Y處理均無顯著差異，說明小米辣‘M218’和‘M240’的根際細(xì)菌群之間無明顯差異（表2）。

表 2 不同樣品細(xì)菌菌多樣性指數(shù)

但在基于Unifrac距離PCoA分析（Adonis：R2=0.319，P=0.031）中，兩個處理間差異顯著，圖中樣本點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表了樣本中微生物群落的相似性，距離越近相似度越高。第一主坐標(biāo)對樣本差異的貢獻(xiàn)率為41.96 %，第二主坐標(biāo)對樣本差異的貢獻(xiàn)率為25.99%；且第一主坐標(biāo)將X處理與Y處理分離。表明‘M218’和‘M240’兩者的群落相似度有顯著差異（圖3）。

圖3 基于Unifrac距離PCoA分析

2.3 群落根際微生物功能預(yù)測

基于COG數(shù)據(jù)庫PICRUSt2功能預(yù)測結(jié)果表明，25個功能基因家族中除去S類（未知功能），E類（氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）、C類（能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換）、M類（細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和膜結(jié)構(gòu)的生物合成）、J類（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生）豐度值占比較高（圖4）。在這些功能基因家族中，X處理比Y處理豐度值較高，說明種植小米辣‘M218’相較‘M240’其根際細(xì)菌群落具有較高的生命活動，對根際細(xì)菌群落的生命活動具有誘導(dǎo)和促進(jìn)作用。

圖4 細(xì)菌菌群COG功能預(yù)測

3 討論

根際微生物作為植物根際生態(tài)系統(tǒng)的參與者，在能量代謝、生物群落構(gòu)建、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、協(xié)同植物生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)機(jī)制、抗病蟲害等方面發(fā)揮重要作用［8］。研究表明，不同基因型品種的作物對根系微生物組成有一定的影響。如李增強(qiáng)等［9］通過磷脂脂肪酸（PLFA）聯(lián)合13CO2標(biāo)記技術(shù)研究不同玉米品種的根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，相較于陜丹8806玉米品種，鄭丹958玉米品種的根際細(xì)菌和真菌的PLFA-C含量顯較高。Marques等［10］發(fā)現(xiàn)，相較于高淀粉基因型馬鈴薯，低淀粉基因型馬鈴薯根際環(huán)境中鞘脂菌屬（Sphingobium）、Pseudomonas、不動桿菌屬（Acinetobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）的相對豐度顯著增加。

課題組通過對兩個不同基因型小米辣品種根際細(xì)菌群落分析發(fā)現(xiàn)，從門水平結(jié)構(gòu)組成上看，第一大優(yōu)勢菌群是變形菌門（Proteobacteria），其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteriaz）。屬水平下，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是第一大優(yōu)勢菌屬，但‘M218’的豐度（14.88 %）高于‘M240’（7.11 %）。雖然在α多樣性分析中兩者間無顯著差異，但在PCoA分析中，兩個小米辣品質(zhì)對其根際微生物群落組成和物種豐度存在著一定影響差異。表明‘M218’和‘M240’根系分泌物可能對其根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性沒有顯著的影響，但在群落豐度上影響顯著?？赡苁瞧贩N間根系分泌物中次生代謝產(chǎn)物（主要包括糖類、氨基酸、有機(jī)酸和黃酮類等）的濃度有明顯差異［11］引起的。這與前人結(jié)果一致，種植作物本身通過根系分泌物的濃度和種類改變根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢菌屬及物種豐度［12-13］。

基于COG數(shù)據(jù)庫預(yù)測表明，小米辣‘M218’樣本功能豐度明顯高于‘M240’，其次在新陳代謝方面如氨基酸代謝（amino acid metabolism）和碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）豐度值明顯較高，說明小米辣‘M218’可能對其根際細(xì)菌群落的生命活動具有較強(qiáng)誘導(dǎo)和促進(jìn)作用，這可能是品種間基因差異所致，不同基因型植物在生物合成代謝途徑、運(yùn)輸和分解中存在差異，這導(dǎo)致其相關(guān)分泌物的種類和濃度也存在顯著差異，從而間接對根際微生物活動產(chǎn)生一定的調(diào)控影響［14］?，F(xiàn)有研究表明，碳水化合物、氨基酸、黃酮類和酚酸類等物質(zhì)均可對根際微生物群落組成產(chǎn)生顯著影響，是影響根際微生物群落形成的驅(qū)動力［15-16］。Liu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，花生根系分泌物中的苯甲酸可增加根際土壤中伯克霍氏菌（Burkholderiaspp.）的相對豐度。試驗(yàn)中小米辣‘M218’為地方原始野生品種，而‘M240’是通過人工選育出的栽培品種。在育種進(jìn)程中，為了得到某些既定的育種目標(biāo)，使得一些物種特有的基因被篩選而逐步丟失，導(dǎo)致其多樣性降低，某些代謝調(diào)控途徑缺失等［18］。這是否是導(dǎo)致人工選育出的栽培品種根際細(xì)菌群落及功能豐度值較低的原因還需要進(jìn)一步研究。因此下一步可對根系分泌物進(jìn)行檢測，分析其中種類和濃度差異，并通過合成調(diào)控路徑尋找相關(guān)的基因，為本地辣椒特有基因挖掘、特有微生物介導(dǎo)作物生長、耕作土壤生態(tài)改良等提供研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上，本地小米辣‘M218’與人工選育的品種‘M240’相比，其根際細(xì)菌群落豐度和功能基因豐度存在顯著的差異。這可為地方品種選育、挖掘野生小米辣特有基因功能、小米辣生長與微生物協(xié)同機(jī)制、指示微生物功能研究起到積極作用。