西瓜枯萎病抗性分子標(biāo)記篩選與應(yīng)用

劉 廣， 黃曉云， 徐錦華， 張 曼， 姚協(xié)豐， 婁麗娜， 徐 建， 侯 茜， 朱凌麗， 羊杏平

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014；2.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，江蘇蘇州 215008)

西瓜枯萎病，別稱萎蔫病、死藤病、枯苗病，是由于西瓜的特異?；筒【怄哏牭毒?f. sp.)入侵根部感染而引起的可發(fā)生在西瓜植株整個(gè)生長(zhǎng)期的病害，尤其是在西瓜膨大期更易發(fā)生，表現(xiàn)為早期植株出現(xiàn)類似失水的癥狀，葉子有點(diǎn)萎蔫，慢慢地整株枯死?？菸?duì)西瓜產(chǎn)量的影響很大，會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收，給農(nóng)民帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此西瓜不能在同一地塊連作。但是由于土地資源的貧乏及溫室、大棚等保護(hù)地設(shè)施的大面積應(yīng)用，枯萎病發(fā)生日益嚴(yán)重，而針對(duì)枯萎病選育抗性強(qiáng)的西瓜新品種是解決這一難題最環(huán)保有效的措施之一。

一般采用枯萎病接種及田間檢測(cè)的方法來鑒定西瓜品種的抗性，耗時(shí)長(zhǎng)且需要大量的人力、物力。分子標(biāo)記是一種可以連續(xù)遺傳且在后代中能檢測(cè)到的DNA序列，可以反映植株個(gè)體之間或群體之間基因組差異的特異性DNA片段，已成功應(yīng)用于作物的抗性輔助選擇、指紋圖譜構(gòu)建、純度檢測(cè)等方面。本研究利用西瓜遺傳群體篩選與西瓜枯萎病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將篩選得到的分子標(biāo)記應(yīng)用于西瓜材料的枯萎病抗性選擇，從而得到抗性好的西瓜材料，用于后期的育種工作，這對(duì)于西瓜的抗性育種具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用1個(gè)雜交后代的抗感單株群體以及20個(gè)西瓜材料作為本次的試驗(yàn)材料。伊選作為母本，高感枯萎病生理小種1；sugarlee作為父本，高抗枯萎病生理小種1，2017年春季雜交后獲得F，2017年秋季進(jìn)行自交后，獲得49個(gè)單株F群體，2018年春季進(jìn)一步自交后，獲得F家系。20個(gè)西瓜材料及來源見表1。試驗(yàn)材料種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗(yàn)基地塑料大棚中。

表1 西瓜材料及來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苗期人工接種枯萎病病菌的抗性鑒定 利用尖孢鐮刀菌西瓜專門型生理小種1對(duì)西瓜幼苗進(jìn)行人工接種鑒定。參照吉加兵的方法進(jìn)行接種。當(dāng)西瓜幼苗培養(yǎng)到2葉1心時(shí)，取葉片用于DNA提取，然后用配制好的孢子懸浮液(孢子濃度為5×10個(gè)/mL)進(jìn)行根部接種。接種后保持環(huán)境溫度為18～26 ℃。約1周后開始發(fā)病，間隔2 d調(diào)查發(fā)病率以及病情指數(shù)。隨機(jī)提取病樣，分離病原物并進(jìn)行培養(yǎng)，用顯微鏡觀察病原。癥狀的分類基于Martyn的標(biāo)準(zhǔn)，高感(HS)病株率為81%～100%，感病(S)病株率為61%～80%，中抗(MR)病株率為41%～60%，抗病(R)病株率為21%～40%，高抗(HR)病株率為0～20%。其中感病型包括S和HS，病株率在61%及以上；抗病型包括HR、R、MR，病株率在60%及以下。感病對(duì)照(Sugar Baby)、中抗對(duì)照(Charleston Gray)、高抗對(duì)照(Calhoun Gray)來自美國，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室繁育。

1.2.2 基因組DNA的提取 當(dāng)西瓜品種生長(zhǎng)到2葉1心時(shí)，取幼嫩西瓜葉片1.5～3.5 g，利用液氮快速磨成粉末，加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解液，65 ℃水浴0.5～1.0 h，冷卻后加入同等體積的三氯甲烷與異戊醇的混合物(體積比為 24 ∶1)，輕輕搖晃25 min左右，在 12 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，抽提1～2次，然后加入10%醋酸鈉和預(yù)冷的異丙醇，在4 ℃冰箱中靜置3 h以上，收集的絮狀DNA用70%乙醇進(jìn)行洗滌，干燥后溶解于TE緩沖液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物合成 參考國內(nèi)外與西瓜枯萎病抗性相關(guān)的文獻(xiàn)，合成22個(gè)/對(duì)引物，其中2對(duì)切割擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)引物，6對(duì)插入/缺失(InDel)引物，5對(duì)序列特征擴(kuò)增區(qū)(SCAR)引物，2對(duì)衍生切割擴(kuò)增多態(tài)性序列(dCAPS)引物，7個(gè)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)引物(表2)。

表2 22個(gè)與西瓜枯萎病抗性基因相關(guān)的引物

1.2.4 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RAPD-PCR)的體系為 25 μL，其中引物2 μL，DNA 2 μL，ddHO 8 μL，Mix buffer 13 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，37 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠中(加入10% GoldView)進(jìn)行檢測(cè)。InDel/SCAR/CAPS/dCAPS-PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包含DNA 1 μL，上游引物1.25 μL，下游引物 1.25 μL，ddHO 8.5 μL，Mix buffer 13 μL。PCR擴(kuò)增過程為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。CAPS/dCAPS產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系為15 μL：10×buffer 1.5 μL，限制內(nèi)切酶Ⅰ(來源于Thermo Fisher Scientific公司)0.5 μL， PCR產(chǎn)物5 μL， ddHO 8.0 μL。65 ℃保持12 h，80 ℃保持20 h進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。擴(kuò)增樣品采用8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳，在120 V恒壓條件下電泳 1～2 h，銀染染色。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 通過Joinmap 4.0軟件進(jìn)行枯萎病抗性性狀連鎖的遺傳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜父母本、F1、F2三世代對(duì)枯萎病生理小種1的抗病性鑒定

表3 西瓜群體對(duì)枯萎病生理小種1的抗性鑒定結(jié)果

2.2 西瓜枯萎病生理小種1抗性基因Fon1標(biāo)記的定位分析

根據(jù)伊選×sugarlee F群體苗期枯萎病生理小種1的抗病性檢測(cè)結(jié)果，從F單株中取檢測(cè)結(jié)果表型為抗病性及表型為感病性的單株各5個(gè)， 利用它們的基因組DNA進(jìn)行混合構(gòu)建抗、感基因池。利用集團(tuán)混合分析(BSA)法對(duì) 22個(gè)CAPS、dCAPS、InDel、RAPD、SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與西瓜抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記(indel04、indel05、indel06)。分子標(biāo)記indel04產(chǎn)生了1個(gè)210 bp與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的特異標(biāo)記indel04210；分子標(biāo)記indel05產(chǎn)生了1個(gè)225 bp與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的特異標(biāo)記indel05225；分子標(biāo)記indel06產(chǎn)生了1個(gè)365 bp與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的特異標(biāo)記indel06365(圖1)。

然后利用 Joinmap 4.0 軟件對(duì)F代群體的單株進(jìn)行研究，通過對(duì) 49個(gè)F代分離群體單株的抗感表型和分子基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)indel04、indel05、indel06這 3個(gè)分子標(biāo)記位于的一側(cè)，連鎖距離分別為 7.5、10.7、13.7 cM(圖2)。

2.3 西瓜枯萎病抗性分子標(biāo)記在種質(zhì)資源中的鑒定

利用篩選得到的與西瓜枯萎病抗性基因緊密連鎖的indel04、indel05、indel06等3個(gè)分子標(biāo)記對(duì)20份西瓜材料進(jìn)行分子檢測(cè)(圖3)。這20份西瓜材料的抗性性狀已經(jīng)通過苗期接種鑒定確定其西瓜枯萎病抗感性，共有9個(gè)抗枯萎病的品種和11個(gè)感枯萎病的品種。試驗(yàn)結(jié)果顯示，indel04、indel05、indel06與苗期接種鑒定結(jié)果的符合率分別為85%、90%、90%(圖3，表4)。說明indel04、indel05、indel06這3個(gè)分子標(biāo)記可以應(yīng)用于西瓜材料針對(duì)枯萎病生理小種1的抗性鑒定，對(duì)西瓜的抗性育種具有重要作用。

表4 20個(gè)西瓜材料接種鑒定與分子鑒定結(jié)果

3 討論

枯萎病是西瓜栽培中的一種災(zāi)難性土傳真菌病害， 嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。 選育抗枯萎病的西瓜新品種是解決這一生產(chǎn)難題的有效措施。傳統(tǒng)的抗性品種篩選耗時(shí)費(fèi)力，開發(fā)利用與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，可有效提升育種時(shí)效，推進(jìn)抗性育種的進(jìn)程，對(duì)我國重茬嚴(yán)重的保護(hù)地栽培具有重要意義。

為了攻克這一難題，國內(nèi)外科研人員在西瓜抗枯萎病分子標(biāo)記的輔助育種中做了大量工作，獲得了一些與西瓜枯萎病抗性性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，但是由于遺傳群體不同，標(biāo)記類型不同，有的標(biāo)記重復(fù)性不佳，不能應(yīng)用于西瓜品種的抗性育種輔助選擇。本研究以父本sugarlee、母本伊選、F代、F代及F代為試驗(yàn)材料，研究了父本sugarlee對(duì)西瓜枯萎病的抗性遺傳規(guī)律，并在前人研究的基礎(chǔ)上，利用已發(fā)表的22個(gè)/對(duì)引物對(duì)遺傳群體親本及抗感池進(jìn)行了分析， 篩選得到3個(gè)與西瓜枯萎病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記(indel04、indel05、indel06)，并利用這3個(gè)標(biāo)記對(duì)20份西瓜材料進(jìn)行了分子檢測(cè)，與苗期枯萎病抗性鑒定結(jié)果基本一致，可應(yīng)用于之后的西瓜抗性育種輔助選擇，對(duì)推進(jìn)西瓜的抗性育種進(jìn)程及西瓜產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展具有重要意義。