王宇晴， 李喬喬， 闞文亮， 邳 植， 吳則東

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院/黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江省農(nóng)墾總局九三農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱 150080)

糖用甜菜(L.)為莧科甜菜屬二年生草本植物，廣泛分布在歐洲及北美洲地區(qū)，是除了甘蔗以外的一種重要的生產(chǎn)蔗糖的經(jīng)濟(jì)作物。糖甜菜自1906年引入我國以來，地方種植史已達(dá)百年有余，盡管近年來由于農(nóng)業(yè)政策的調(diào)整，甜菜種植面積有所縮減，但其作為我國的第二大糖料作物，基本每年占總產(chǎn)糖量的13% 左右。糖料生產(chǎn)要求甜菜品種高糖豐產(chǎn)多樣化，但隨著國內(nèi)自育品種的發(fā)展和國外品種的不斷補(bǔ)充和引入，又由于缺乏市場監(jiān)管以及規(guī)范的品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)體系，劣質(zhì)替優(yōu)、品系混亂、同種異名、張冠李戴等現(xiàn)象層出不窮，這給育種者以及農(nóng)民帶來極大的損害。然而來源于同個育種單位的甜菜品種可能使用相同或相似的優(yōu)良品系作為父母本，導(dǎo)致品種間遺傳差異縮小，遺傳背景相似，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)法難以高效鑒定。因此科學(xué)準(zhǔn)確地區(qū)分和鑒定甜菜品種，這對提高育種效率、保護(hù)消費(fèi)者和育種者權(quán)益具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

分子標(biāo)記技術(shù)是實(shí)現(xiàn)植物遺傳多樣性分析和品種鑒定的另一種途徑，2007年簡單重復(fù)序列(SSR)分子標(biāo)記被國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)確定為植物品種鑒定最有力的工具。SSR標(biāo)記能快速準(zhǔn)確鑒定農(nóng)作物品種的優(yōu)越性，也使得其成為構(gòu)建植物指紋圖譜的首選。然而分子身份證是在SSR指紋圖譜的基礎(chǔ)上，遵循一定原則對指紋信息進(jìn)行編碼，得到由字母和數(shù)字構(gòu)成的字符串，通過數(shù)字信息技術(shù)平臺構(gòu)建獨(dú)特的二維碼(或條形碼)的身份標(biāo)記。

近年來，黍稷、小麥、大豆、蘋果、茶樹等農(nóng)作物都基于SSR技術(shù)構(gòu)建了分子身份證，甜菜品種在遺傳多樣性及指紋圖譜構(gòu)建中也有相關(guān)研究報(bào)道，齊少瑋等采用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建了39個甜菜品種的指紋圖譜；吳則東等使用21對SSR引物對32個甜菜品種進(jìn)行指紋圖譜及遺傳多樣性分析；栗媛等使用5對SSR核心引物構(gòu)建了39份甜菜品種的分子身份證。上述研究雖然表明SSR分子標(biāo)記技術(shù)可有效用于甜菜品種指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析，也有試圖探究甜菜品種分子身份證的技術(shù)分析，但目前國內(nèi)并沒有對現(xiàn)有國家登記的甜菜品種構(gòu)建分子身份證的研究報(bào)道，也尚未制定甜菜品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。本研究旨在對國內(nèi)現(xiàn)有的111份甜菜登記品種，利用SSR標(biāo)記作品種鑒定以及分子身份證，基于最少引物區(qū)分最多品種的原則，進(jìn)行分子身份證的開發(fā)，為甜菜品種鑒定和種子市場的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)、品種鑒定技術(shù)奠定基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甜菜登記品種111份，其中來自國外的品種97份，來自石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、黑龍江大學(xué)等國內(nèi)自育的地方品種14份，材料由全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心提供(表1)。

表1 供試材料相關(guān)信息

1.2 SSR引物篩選

試驗(yàn)中用到的所有SSR引物均來源于黑龍江大學(xué)甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，利用李喬喬等文獻(xiàn)中所得的27對 SSR 引物序列信息， 進(jìn)行合成用于試驗(yàn)。從中篩選出22對分布在甜菜9條染色體上的SSR核心引物，采用HAP方式純化。

1.3 DNA的提取

于2020年7月在黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)試驗(yàn)地(126°58′E，45°90′N)采集樣品，每份甜菜品種根據(jù)最適取樣策略各取10株，選取嫩葉部分，混合取樣，用記號筆編號，放入制冰盒內(nèi)保存，帶回實(shí)驗(yàn)室并放置在-80 ℃超低溫冰箱儲藏。參試樣本按照十六烷基三甲基溴化銨(CATB)法提取DNA。用超微量紫外可見分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度，把DNA樣本調(diào)整濃度為10 ng/μL，置于4 ℃冰箱備用，并將DNA母液置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 PCR擴(kuò)增與電泳檢測

PCR擴(kuò)增體系為5 μL，包括1 μL模板DNA、2.5 μL 2×MIX (2×RapidMaster Mix)、0.4 μL正反向引物(10 pmol/L)、1.1 μL ddHO。

PCR程序視所用SSR引物退火溫度采用2種程序：(1)一是固定退火溫度PCR程序：反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃或60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃終延伸5 min。(2)Touch down PCR的程序：反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，以后65～56 ℃每降1度循環(huán)2次，直到56 ℃；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)20次；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增完成后，取1.5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上采用恒電壓(180 V)電泳1.5 h，最后根據(jù)Stothard等的比較結(jié)果，使用能高效靈敏檢測DNA且無毒的G-Red核酸染料對凝膠進(jìn)行泡染。隨后觀察、照相、讀帶。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.6 甜菜登記品種分子身份證的構(gòu)建

甜菜品種SSR分子身份證是由字符串、二維碼以及品種基本信息組合構(gòu)成。字符串是以不同SSR引物擴(kuò)增的條帶按照0、1、9構(gòu)成的數(shù)字集以及標(biāo)注引物的大寫英文字母 A～Z構(gòu)成的數(shù)字加字母組合而成；將字符串、品種基本信息(包括品種名稱、登記編號、育種者、來源)導(dǎo)入二維碼在線技術(shù)(https：//cli.im/)轉(zhuǎn)化成可掃描的二維碼；二者即構(gòu)成甜菜登記品種DNA分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜品種數(shù)字DNA指紋信息采集

對SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測可獲得清晰的條帶圖。根據(jù)22對SSR核心引物對111份甜菜登記品種擴(kuò)增出的等位基因進(jìn)行記錄，以此采集111份甜菜品種的數(shù)字DNA指紋信息，作為分子身份證字符串的依據(jù)。如圖1所示，以引物2170的擴(kuò)增產(chǎn)物為例，橫向約在Marker 200 bp位置上，81～111號甜菜品種擴(kuò)增情況為 00100 01110 11111 11111 11111 11111 1；縱向約在Marker 100～200 bp的位置81號甜菜品種的擴(kuò)增情況為0100。

2.2 遺傳多樣性分析

通過利用22對SSR引物分別對111份甜菜登記品種的混樣DNA進(jìn)行甜菜品種間遺傳多樣性分析。從擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目上(表2)看，22對SSR引物在111份甜菜品種 DNA 樣本中共檢測到 101個等位基因，每對引物檢測出3～7個等位基因，平均為4.59個；其中引物2305 以及1965檢測出的等位基因數(shù)最多，為7個，引物L(fēng)16、L64、BVV21、L59以及W15最少，為3個。多態(tài)性百分率在66.67%～100.00%之間，引物7236、2170、BQ588629、L37、L64、L70、TC55、W21、LNX47及W31的多態(tài)百分比最高，為100.00%，最低的是L16、BVV21、L59及W15，為66.67%。22對引物的Shannon’s信息指數(shù)在0.60～1.73之間，平均值為0.95；Nei’s期望雜合度在0.41～0.79之間，平均值為0.56；值介于0.91～0.99，平均值為0.96，參考Botstein的研究結(jié)果，可知22對引物值均大于0.5，為多態(tài)性豐富的SSR引物。綜上指標(biāo)表明22對SSR引物可區(qū)分111份甜菜登記品種以此構(gòu)建甜菜品種的分子身份證，且甜菜品種間具有一定的遺傳變異。

表2 22對SSR引物在111份甜菜登記品種中多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果

2.3 遺傳距離及聚類分析

利用22對分布在甜菜9條染色體上的SSR 引物，對111份來自不同國家地區(qū)的甜菜登記品種的DNA混合樣本進(jìn)行擴(kuò)增。通過擴(kuò)增結(jié)果獲得的等位基因利用MEGA 7.0計(jì)算遺傳距離，111份甜菜品種的遺傳距離范圍為0.059～0.564，平均值為0.325。其中來自荷蘭安地國際有限公司的甜菜品種SV1366與同屬于麥瑞博西索科有限公司的MA097、MA104、MA3005、MA3001以及MA2070的遺傳距離為0.505～0.564，極差最大；而品種MA3001和MA2070遺傳距離最近，源于同個公司，經(jīng)查證使用同一父本P2-35。

由圖2可知，在遺傳距離為0.16時，可將111份甜菜品種分為三大類群，類群G1有32份品種，類群G2有22份品種，類群G3有57份品種。類群G1在遺傳距離為0.14時可分為2個亞群G1-1和G2-2。G1-1在遺傳距離為0.11時劃分為次亞群G1-1-1和G1-1-2。亞群G1-1共有17份品種，其中95號品種新甜14號和100號品種XJT9909遺傳距離最近；在亞群G1-2中84號品種MA3001和85號品種MA2070遺傳距離最近。類群G2在遺傳距離為0.14時分為亞群G2-1和G2-22個類群。亞群G2-1中有品種20份，其中5號品種BETA468和29號品種KWS1231遺傳距離最近；亞群G2-2中僅有4號品種BETA796和56號品種KWS5599 2份材料。而類群G3在遺傳距離 0.14 時分為亞群G3-1和G3-2 2個類群。亞群G3-1中共有品種17份，其中13號品種LS1210和14號品種LS1321遺傳距離最近；亞群G3-2中有40份品種，品種間遺傳距離最近的是41號品種MK4085和42號品種SV1588。

就類群G1而言，由黑龍江大學(xué)、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所等地培育的國內(nèi)品種58號、91號、94號、95號、99～101號以及110號和111號與來自荷蘭安地國際有限公司的64號、71號、89號以及106號共同聚在亞類G1-1；而品種1號、18號、24號、25號、72號、74號、75號以及81～85號皆來源于麥瑞博西索科有限公司都聚在G1-2。源于美國BETASEED公司的4號、5號、30～32號、45號、86號、102號與來自KWS SAAT SE的29號、33號、48號、52號、54號、56號、57號、78～80號、97號、98號以及107號聚在類群G2。聚在類群G3的大部分甜菜品種皆來自荷蘭安地國際有限公司以及英國萊恩種業(yè)。綜上所述，聚類結(jié)果大致與甜菜品種的地理來源一致，屬于同一育種單位的甜菜品種，在聚類圖上顯示為一類，可能是因?yàn)橹品N公司在育種時在性狀或父母本的選擇上有相同或相似之處，聚類結(jié)果符合遺傳規(guī)律。此外，約50%的甜菜品種聚為G3類，這可能是由于這部分試驗(yàn)材料絕大部分是來源國外申請品種，親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳背景相似。

2.4 甜菜登記品種分子身份證的構(gòu)建

通過UPGMA聚類分析法，基于最少引物區(qū)分最多品種的原則，剔除條帶不清晰的引物，篩選出了6對(引物2305、TC122、4118、L7、L37、L59)能夠完全區(qū)分111份甜菜登記品種的優(yōu)質(zhì)引物。用上述6對標(biāo)記構(gòu)建甜菜登記品種的字符串?dāng)?shù)字 DNA 分子身份證，字符串由代表引物字母標(biāo)注和引物擴(kuò)增出的0、1數(shù)據(jù)集組成。A～F字母標(biāo)注是按照引物多態(tài)性比由高到低排序?yàn)長37、2305、TC122、4118、L7及L59。以品種 1號HI093為例，其字符串?dāng)?shù)字DNA 分子身份證為A1110B0000001C010010D 11111E11011F111。將上述字符串 DNA 分子身份證以及對應(yīng)的品種信息導(dǎo)入二維碼在線技術(shù)(https：//cli.im/)轉(zhuǎn)化成可掃描的二維碼，基于二者便成功構(gòu)建出 111 份甜菜登記品種的 DNA 分子身份證。圖3是甜菜品種HI0936的二維碼 DNA 分子身份證。

3 討論與結(jié)論

隨著數(shù)字時代的發(fā)展，數(shù)字信息技術(shù)也滲透到農(nóng)業(yè)領(lǐng)域上與生物技術(shù)碰撞，引領(lǐng)智慧農(nóng)業(yè)數(shù)字化，及時更新和構(gòu)建登記品種分子身份證，可為甜菜品種選育提供可靠的數(shù)據(jù)參考以及為育種者、消費(fèi)者提供有力保障。本研究基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，采用22對SSR引物對111份甜菜登記品種進(jìn)行遺傳多樣性分析并更新構(gòu)建甜菜分子身份證信息，111份甜菜品種平均遺傳距離為0.325，遺傳距離范圍在0.059～0.564之間；22對引物Shannon’s信息指數(shù)在0.60～1.73之間，平均值為0.95；Nei’s期望雜合度在0.41～0.79之間，平均值為0.56；值介于0.91～0.99，平均值為0.96；基于遺傳距離根據(jù)UPGMA法分為三大類群，試驗(yàn)材料的聚類結(jié)果符合遺傳規(guī)律，與地理來源一致。分析參數(shù)結(jié)果與丁劉慧子等對107份相同品種的結(jié)果相似，不但補(bǔ)充了后期登記的品種信息，而且在聚類結(jié)果顯示上更為清晰明朗。表明選用的22對SSR引物有效地構(gòu)建了甜菜登記品種的分子身份證信息以及滿足該目標(biāo)群體的遺傳多樣性研究。

構(gòu)建品種分子身份證通常是基于指紋圖譜信息，根據(jù)用最少的引物區(qū)分最多品種的原則，篩選出一定數(shù)目優(yōu)質(zhì)的引物進(jìn)行編寫，本研究參考肖文芳等的研究方法，從1對引物逐步增加引物數(shù)量，通過UPGMA法篩選出可將111 份甜菜品種全部區(qū)分的引物組合，最終確定組合為引物2305、TC122、4118、L7、L37以及L59。分子身份證編碼形式通常有多種，有應(yīng)用基因型編碼方法采用個位數(shù)字和小寫英文字母對不同帶型進(jìn)行編碼構(gòu)建種質(zhì)資源的分子身份證；也有根據(jù)獲得的帶型按照固定引物順序，用數(shù)字編碼，串聯(lián)各帶型編碼，形成數(shù)據(jù)代碼獲得分子身份證。本研究依據(jù)篩選出的引物組合指紋信息，為每一份登記品種進(jìn)行分子身份證編碼，6對引物多態(tài)性比最大的是2305，最小的是L59，由高到低用英文A～F依次編碼，串聯(lián)構(gòu)成了甜菜登記品種的分子身份證。

本研究構(gòu)建的甜菜登記品種分子身份證，從22對優(yōu)質(zhì)引物中篩選出的6對多態(tài)性高的引物可作為甜菜品種鑒定引物?；?對 SSR 引物的指紋信息構(gòu)建了111份甜菜登記品種的DNA 分子身份證，進(jìn)一步豐富該品種的可視化信息內(nèi)容，為甜菜品種的推廣以及品種選育提供科學(xué)依據(jù)，也為育種者和消費(fèi)者提供了有力的保障。