Survivin基因沉默對骨肉瘤裸鼠自噬相關蛋白的影響

白 星 周 嬌 杜少蕊 田 昕

骨肉瘤是一種復雜的基因性疾病[1]，其轉移率和病死率很高，常規(guī)治療手段效果不佳[2]。既往研究結果顯示，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與Survivin基因密切相關，抑制 Survivin 基因可影響骨肉瘤的細胞增殖、細胞凋亡以及侵襲和轉移[3]。我們構建了重組腺病毒載體Survivin-shRNA，并通過皮下異種移植法構建裸鼠骨肉瘤模型，分析Survivin基因沉默對骨肉瘤裸鼠自噬相關蛋白LC3、P62與mTOR的表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗動物與試劑

MG-63細胞株來源于上海生命科學研究院細胞資源中心；LC3、P62、mTOR試劑購自美國Sigma公司，SPF級裸鼠共48只，購自于西安交大動物實驗中心。整個實驗過程符合《關于善待實驗動物的指導性意見》(國家科學技術部，2006年頒布)標準。

1.2 裸鼠骨肉瘤模型的構建

構建Survivin-shRNA載體并轉染至MG-63細胞，挑選轉染穩(wěn)定的細胞用于下一步實驗。隨機將其分為3組：CON組、GFP組、Survivin-shRNA組。取1×107單細胞懸液，加入50 ml PBS，先在5只裸鼠皮下注射，當裸鼠體內的腫瘤生長達到長徑5 mm時切除。然后將瘤體切碎，組織塊以1～2 mm3大小重新接種，即可獲得裸鼠骨肉瘤模型。

1.3 腫瘤生長曲線的繪制

裸鼠腫瘤細胞接種完成后,逐日觀察接種部位有無感染,腫瘤生長后有無自然消退，采用卡尺測定腫瘤體積，采用(長×寬)2/2即可計算出腫瘤體積，并據此繪制腫瘤生長曲線。

1.4 Western blot檢測LC3、P62及mTOR蛋白表達

將裸鼠骨肉瘤組織標本切取后，機械研磨成細胞或組織碎片，PBS洗滌后離心沉淀，以5倍冰預冷的懸浮緩沖液分散細胞；離心10 min后吸出上清液移于試管中，沸水浴加熱3 min，提取骨肉瘤組織蛋白。蛋白的表達水平根據GAPDH標化并通過軟件進行灰度掃描、定量。

1.5 免疫組織化學法檢測LC3、P62及mTOR蛋白表達水平

標本用4%多聚甲醛常規(guī)固定，蠟塊制作并切片；分別加0.3%過氧化氫甲醇溶液30 min、0.3%Triton X-100 30 min、血清稀釋液稀釋的一抗，4℃ 24～48 h，然后加PBS稀釋的二抗，室溫孵育2 h，加ABC復合物，沖洗后加顯色液進行免疫組織化學顯色，裸鼠骨肉瘤組織標本切取后，用4%多聚甲醛常規(guī)固定，取材并置20%蔗糖溶液中過夜。蠟塊制作、切片；加0.3%過氧化氫甲醇溶液30 min，PBS清洗；加配好的0.3%Triton X-100 30 min，PBS清洗；加血清稀釋液稀釋的一抗，4℃ 24～48 h，吸去抗體，PBS清洗；加PBS稀釋的二抗，室溫孵育2 h，PBS清洗；加ABC復合物，室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3，蒸餾水沖洗3遍；加顯色液進行免疫組織化學顯色，在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖3遍，加PBS終止反應；梯度酒精脫水之后，封片，在顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 腫瘤生長曲線

用卡尺測定腫瘤體積，結果如圖1所示，與CON和GFP組相比，Survivin-shRNA組裸鼠體內腫瘤生長速度較緩慢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 裸鼠骨肉瘤生長曲線

2.2 Western blot結果顯示各組裸鼠蛋白表達水平

Western blot結果發(fā)現(xiàn)，與CON和GFP組相比，Survivin-shRNA組中LC3、P62蛋白表達水平升高，mTOR蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖2所示。

圖2 Western blot分析各組蛋白表達水平

2.3 免疫組織化學結果顯示各組裸鼠蛋白表達水平

免疫組織化學結果顯示，LC3與P62表達在治療組中明顯高于對照組，而mTOR表達相反，經檢驗差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如圖3所示。

圖3 免疫組織化學結果顯示各組蛋白表達水平

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，病變來源于間充質細胞，多發(fā)于四肢長骨干骺端，以股骨遠端最常見，以紡錘形的惡性腫瘤細胞形成不成熟的骨質為特點[4]。近年來骨肉瘤發(fā)病率持續(xù)上升，轉移率和病死率很高，治療方法主要包括傳統(tǒng)手術切除、新輔助化療和放療，但患者預后未見明顯改善，治療效果往往不滿意[5]。在骨肉瘤患者中，1/5因初診時已遠處轉移，治療失敗和死亡[6]。近年來，基因干擾技術發(fā)展越來越成熟，大量研究表明，基因干擾可通過阻斷Survivin表達來抑制腫瘤細胞[7]?；蛑委熍c傳統(tǒng)藥物相比，特異性強，效果較好，人體反應較輕。國內外學者對于Survivin基因與惡性腫瘤關系進行了深入研究，我們前面的實驗也發(fā)現(xiàn)，Survivin在骨肉瘤中特異高表達，因此Survivin靶向治療的嘗試將很有前途[8]。

骨肉瘤嚴重影響青少年的身體健康和生命安全，因此建立準確的、具有骨肉瘤特性的動物模型至關重要。本實驗采用皮下異種移植法，從整個實驗的過程和結果來看，該方法造模成功率較高，值得推廣應用。本實驗通過卡尺測定并通過公式計算腫瘤體積，并且繪制了腫瘤生長曲線，結果顯示，Survivin-shRNA組的腫瘤體積增加的幅度明顯較對照組小，這表明Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤的生長。

細胞通過自身溶酶體清除受損的細胞器以及功能異常的蛋白質的過程，我們稱之為細胞自噬。就本質而言，自噬是一種保護機制，平時可使體內細胞免受損傷。然而，過度的自噬效應則會帶來細胞死亡的風險[9]。自噬相關蛋白中，LC3相當重要，可分為Ⅰ型和Ⅱ型，LC Ⅰ存在于胞質中，LC3Ⅱ存在于自噬體膜上，參與自噬機制[10]。本研究Western Blot法和免疫組織化學法結果均發(fā)現(xiàn)，與CON和GFP組相比，Survivin-shRNA組中LC3、P62蛋白表達水平升高，mTOR蛋白表達水平降低，表明Survivin基因沉默后，裸鼠骨肉瘤細胞自噬活性上升，這有利于殺滅腫瘤細胞。

綜上所述，Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤細胞增殖能力，其機制可能是與調節(jié)自噬相關蛋白LC3、P62與mTOR的表達有關。