吉西他濱聯(lián)合放射對(duì)人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株裸鼠移植瘤EphB4、Caspase3表達(dá)的影響

李芬芬 季 斌

外科手術(shù)切除被認(rèn)為唯一治愈可能，手術(shù)切除后5年生存率仍然很低，在15%～30%[6-8]，可能提示早期胰腺癌患者在最初診斷時(shí)不能單純從手術(shù)中獲益，可能與術(shù)前影像學(xué)檢查中看不到的微轉(zhuǎn)移有關(guān)。在二十多年的時(shí)間里，單一吉西他濱(GEM)是唯一被批準(zhǔn)并廣泛使用的藥物[9]。與5-氟尿嘧啶(5-FU)相比，吉西他濱治療患者的中位總生存率(5.65 vs 4.41個(gè)月)和1年生存率(18% vs 2%)顯著改善[10]?；仡櫺詳?shù)據(jù)表明，對(duì)于無(wú)法切除的局部晚期胰腺癌，增加放療劑量提高生存率。

Caspases通常在細(xì)胞凋亡的早期階段被激活[11]。Caspase-3被稱(chēng)為家族的主要?jiǎng)Ｗ邮?，通過(guò)裂解細(xì)胞底物，在細(xì)胞凋亡死亡中發(fā)揮重要作用[12]。caspase-3的表達(dá)水平是一種已知的評(píng)估誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的方法[13]。EphB4通過(guò)其相應(yīng)的配體EphrinB2激活，控制細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用、血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14-15]。有報(bào)道稱(chēng)，高表達(dá)EphB4可促進(jìn)胰腺癌、結(jié)腸直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌的生長(zhǎng)和遷移，而這種作用可通過(guò)下調(diào)EphB4逆轉(zhuǎn)，使EphB4成為癌癥治療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)[16-18]。

1 材料與方法

1.1 材料

吉西他濱粉劑、MTT試劑盒購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。mRNA分析試劑焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)、Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR試劑盒由瑞士Roche公司提供。兔抗人EphB4,Caspase3一抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。直線加速器購(gòu)自美國(guó)瓦里安公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c-nu/nu裸小鼠36只，4～5周齡，雄性，18～20 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)。

1.2 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，使用含有10%胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞株呈貼壁上皮細(xì)胞，待細(xì)胞融合度>70%時(shí)，進(jìn)行清洗、消化、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)所用。

1.3 MTT法檢測(cè)人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞增殖

將CFPAC-1細(xì)胞約為1×104/ml，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)到細(xì)胞單層鋪滿孔底。加藥組：對(duì)照組、1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml吉西他濱加入后細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h；放射組：細(xì)胞置于直線加速器6MV-X線下，照射線劑量分為0 Gy，2 Gy，4 Gy，6 Gy，8 Gy，以400 cGy/min的速率不同照射劑量照射后，細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h。篩選出最佳的放射劑量后，加入吉西他濱各劑量組24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)48 h。得出最佳放射劑量后，加入吉西他濱各個(gè)劑量組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h。待三個(gè)96孔板實(shí)驗(yàn)孔每孔加入5 g/l的MTT20 μl溶液，避光繼續(xù)培育4 h后加入150 μl DMSO后平板搖床搖10 min，結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)550吸光值值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。繪制藥物劑量-抑制率曲線圖后，計(jì)算IC50值，細(xì)胞增殖存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.4 人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株裸小鼠移植瘤建模及分組

在無(wú)菌空氣層流室內(nèi)，裸小鼠先飼養(yǎng)適應(yīng)7天。PBS把細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞在95%以上，細(xì)胞濃度調(diào)為 1×107/ml，36只BALB/c-nu/nu裸小鼠每只左下肢外側(cè)偏背部接種0.2 ml(2×106個(gè)細(xì)胞)，約5～8 d成瘤，待腫瘤長(zhǎng)到大小約1 cm時(shí)進(jìn)行干預(yù)。36只裸小鼠全部成瘤，隨機(jī)分為6組：A組：生理鹽水腹腔注射(按鼠重計(jì)算)；B組：?jiǎn)未握丈?5 Gy；C組：腹腔注射吉西他濱25 mg/kg；D組：腹腔注射吉西他濱50 mg/kg；E組：腹腔注射吉西他濱25 mg/kg，24 h后單次照射15 Gy；F組：腹腔注射吉西他濱50 mg/kg，24 h后單次照射15 Gy。照射方法：每次1只裸小鼠，四肢固定，采用直線加速器6MV-X線15 Gy照射，只把左下肢外側(cè)偏背側(cè)腫瘤置于放射野中，瘤體上放置1.5 cm濕紗布，其它部位用鉛橡皮遮蔽。

1.5 人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株裸小鼠移植瘤體積、體重測(cè)量及標(biāo)本處理

六組進(jìn)行細(xì)胞種植后，于第1、5、11、17、23、28天測(cè)量每只裸鼠的體重及瘤體積變化情況，使用游標(biāo)卡尺來(lái)測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，腫瘤體積(V)的計(jì)算公式：V=a×b2/2。共觀察28天，觀察結(jié)束后處死裸鼠，立即剔除其他組織，剝離取出瘤塊稱(chēng)重。腫瘤抑制率=(對(duì)照組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量)/對(duì)照組平均腫瘤重量×100%。

1.6 RT-PCR檢測(cè)組織中EphB4、Caspase3基因表達(dá)

用Trizon試劑提取組織總RNA并檢測(cè)總RNA的濃度及純度。首先取500 ng總RNA與1 μl引物、無(wú)核酸酶的高純水混合至12 μl ，65 ℃ 5 min，將下列組分按照順序加入以上混合液中5X反應(yīng)緩沖液4 μl、RiboLockTMRNA酶抑制劑1 μl、10 mM dNTP Mix 2 μl、RevertAidTMM-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，總體積20 μl，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，第一鏈cDNA合成；DNA為模板進(jìn)行RT-PCR并以GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行，見(jiàn)表1。

初中函數(shù)是初中階段教學(xué)的重點(diǎn)難點(diǎn)。初中函數(shù)是一個(gè)全新的概念，函數(shù)的學(xué)習(xí)與數(shù)列、排列組合、方程、不等式等知識(shí)點(diǎn)都有著重要的聯(lián)系，初中數(shù)學(xué)普遍存在脫離現(xiàn)實(shí)生活、教學(xué)方法單一的特點(diǎn)，以至于學(xué)生學(xué)習(xí)函數(shù)時(shí)興趣不高，課堂氛圍不夠活躍。教師在函數(shù)教學(xué)過(guò)程中會(huì)遇到很多難題，以及函數(shù)對(duì)邏輯思維能力要求比較高，影響了初中數(shù)學(xué)函數(shù)教學(xué)的質(zhì)量。因此，初中教師應(yīng)積極豐富初中函數(shù)的教學(xué)方式，改變傳統(tǒng)的教學(xué)模式，培養(yǎng)學(xué)生的函數(shù)解題思維，重視函數(shù)的實(shí)際應(yīng)用，擺脫初中數(shù)學(xué)函數(shù)教學(xué)的困境，提升初中階段函數(shù)教學(xué)的質(zhì)量。

表1 EphB4、Caspase3、GAPDH引物序列

將FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μl 、forward primer(5 μM)1.2 μl、reverse primer(5 μM)1.2 μl、ddH2O 6.6 μl，總體積20 μl混勻后加入2 μl模板DNA；PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃15 s(或10 s)40 cycles，58 ℃～60 ℃ 60 s(或30 s)，開(kāi)始運(yùn)行程序。

1.7 裸小鼠移植瘤組織HE染色

取腫瘤組織塊固定之后石蠟包埋，5 μm切片。低濃度至高濃度酒精脫水-二甲苯中透明-蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗1 h，鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，伊紅液2 min，脫水透明，中性樹(shù)脂封固。

1.8 免疫組化檢測(cè)裸小鼠移植瘤中EphB4、Caspase3蛋白表達(dá)的變化

玻片處理，修組織塊，包埋組織，切片，撈組織，脫蠟，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，血清封閉，滴加一抗(多克隆抗體EphB4,Caspase3工作濃度為1∶150)，加二抗，加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素復(fù)合物，加顯色劑，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。陰性對(duì)照是用PBS緩沖液來(lái)代替一抗。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 吉西他濱、放射、聯(lián)合組處理對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的影響

對(duì)照組(A組)、放射組(B組)、用藥組(C組、D組)、聯(lián)合組(E組、F組)六組干預(yù)后觀察28 天后裸小鼠未發(fā)生死亡，大體形態(tài)學(xué)觀察六組裸小鼠外觀上有較大的差異，其中對(duì)照組裸小鼠最早出現(xiàn)行動(dòng)不便、意識(shí)遲緩、體型消瘦等現(xiàn)象。移植瘤切面觀呈白色、質(zhì)脆，六組移植瘤體重大體觀呈腫瘤結(jié)節(jié)簇生。與A組相比較， C組、D組腫瘤體積和重量明顯降低(P<0.01)，并且C組、D組之間有差異(P<0.05)；E組、F組比B組的腫瘤體積和重量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且E組、F組兩組間有差異(P<0.05)；E組、F組比B組、C組和D組腫瘤的體積和重量明顯下降(P<0.05)；見(jiàn)表2。六組的抑瘤率(表3)，F(xiàn)組裸小鼠的皮下移植瘤的體積最小、腫瘤重量最輕，抑瘤率最高。

表2 各組裸小鼠皮下移植瘤體積

表3 各組裸小鼠瘤重量和抑瘤率(n=6)

2.2 人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株增殖活力的測(cè)定(MTT)

單純吉西他濱兩組、單純放射兩組對(duì)人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株生長(zhǎng)有明顯抑制作用，呈劑量、時(shí)間依賴(lài)的趨勢(shì)。隨著吉西他濱濃度的升高、放射劑量的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，表明細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)；得出6MV-X線直線加速器照射8 Gy放射劑量為最佳放射劑量，在不同劑量吉西他濱下培養(yǎng)細(xì)胞24 h后6MV-X線直線加速器照射8 Gy放射劑量后對(duì)細(xì)胞有比單純用藥組、單純放射組更為明顯的抑制作用，呈劑量依賴(lài)的趨勢(shì)，細(xì)胞存活率逐漸降低更明顯。

2.3 EphB4基因、Caspase3基因在人胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1裸鼠移植瘤中的表達(dá)

EphB4受體、Caspase3受體mRNA在六組腫瘤組織中均有表達(dá)。與對(duì)照組相比較，EphB4受體在單純用藥組表達(dá)明顯降低(P<0.05)，并且聯(lián)合組表達(dá)最低(P<0.01)；C組、D組兩組比較有明顯下降(P<0.05)；E組、F組兩組比較有明顯下降，并且比B組顯著下降(P<0.05)。Caspase3基因表達(dá)與EphB4基因相反。

2.4 EphB4受體、Caspase3受體在人胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1裸鼠移植瘤的表達(dá)

EphB4、Caspase3抗體的陽(yáng)性染色主要分別位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐染色，陰性、陽(yáng)性的表達(dá)根據(jù)細(xì)胞染色的強(qiáng)度以及染色細(xì)胞所占的面積這兩者積分之和來(lái)判斷。染色強(qiáng)度積分判斷：無(wú)染色為0分，輕度染色為l分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分；染色面積積分判斷：無(wú)細(xì)胞染色為0分，<25%細(xì)胞染色為l分，25%～50%細(xì)胞染色為2分，>50%細(xì)胞染色為3分。胰腺癌細(xì)胞的染色強(qiáng)度及染色面積兩者積分相加，依次為：(-)：0；(+)：l～2；(++)：3～4；(+++)：5～6；兩者積分之和>2為表達(dá)陽(yáng)性，≤2為表達(dá)陰性。組織切片于400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，同一條件下拍照攝片。EphB4蛋白染色：與A組相比，C組、D組明顯降低(P<0.05)，E組、F組降低最為明顯(P<0.01)； E組、F組與B組、C組、D組相比，表達(dá)明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)組表達(dá)為最低。Caspase-3蛋白染色：與EphB4蛋白相反。

3 討論

胰腺癌是美國(guó)第四大癌癥死亡原因，5年生存率為3%[19]。GLOBALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)顯示胰腺癌是全球男性和女性第7死亡原因[20]，預(yù)計(jì)在歐盟國(guó)家胰腺癌超過(guò)乳腺癌成為第3死亡原因[21]?？汕谐认賹?dǎo)管腺癌(PDAC)目前的治療標(biāo)準(zhǔn)是先手術(shù)后輔助化療[22]。然而，由于缺乏適當(dāng)?shù)脑缙跈z測(cè)和篩查方法，大多數(shù)胰腺癌患者被診斷為晚期或轉(zhuǎn)移性疾病。只有15%～20%的胰腺癌患者在確診時(shí)接受手術(shù)治療，即使是已經(jīng)接受手術(shù)切除的患者，因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者會(huì)在一年內(nèi)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)[23]。這些令人沮喪的結(jié)果的根本原因與輔助手術(shù)治療的不良療效、未檢測(cè)到的微轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性的發(fā)展有關(guān)。即使是R0切除患者的5年生存率仍然很低，約為20%。胰腺癌是一種全身性疾病，因?yàn)榧词故窃缙诩膊〉拇蠖鄶?shù)患者最終也會(huì)發(fā)展為轉(zhuǎn)移。盡管吉西他濱具有一定的抗腫瘤活性并提高輔助治療的生存率，但迄今為止，大多數(shù)胰腺癌患者的治療重點(diǎn)仍然是姑息性的。

凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，對(duì)于維持體內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[24]。

不管凋亡是如何啟動(dòng)的，一個(gè)半胱氨酸導(dǎo)向的蛋白酶家族，即caspases，會(huì)從非活性的酶原樣狀態(tài)被系統(tǒng)激活，并在成熟后，針對(duì)大量的細(xì)胞蛋白進(jìn)行水解。由于其活性的性質(zhì)，Caspases是高度調(diào)控的蛋白，因?yàn)椴贿m當(dāng)?shù)幕罨瘯?huì)產(chǎn)生毀滅性的影響。凋亡caspases一般分為“啟動(dòng)子”和“劊子手”。caspases的關(guān)鍵生物學(xué)功能與凋亡和程序性死亡有關(guān)[25-26]，也與非細(xì)胞死亡功能的炎癥、樹(shù)突、細(xì)胞分化和遷移中有關(guān)[27]，分為兩個(gè)不同的途徑[28]。Caspase-3通過(guò)結(jié)構(gòu)蛋白的切割導(dǎo)致核包膜的破壞和基因組DNA的破壞。低水平的caspase-3活性對(duì)幾種細(xì)胞的關(guān)鍵發(fā)育過(guò)程是必要的[29]。

增殖信號(hào)的持續(xù)刺激和相關(guān)監(jiān)測(cè)機(jī)制的失調(diào)是腫瘤形成的重要原因。生長(zhǎng)因子可以激活生長(zhǎng)因子受體，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖。EphB4是受體酪氨酸激酶家族的重要成員，在各種癌癥中過(guò)表達(dá)并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和遷移[30-31,17]。EphB4在正常和惡性細(xì)胞中都有促進(jìn)細(xì)胞遷移潛能的報(bào)道[32]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建人胰腺癌裸小鼠移植瘤模型來(lái)觀察在無(wú)干預(yù)(A組)、干預(yù)組(B組、C組、D組、E組、F組)情況下生存28天后，在宏觀上，觀察長(zhǎng)徑、短徑以及瘤重的變化，并從微觀上熒光定量PCR檢測(cè)組織中EphB4、Caspase3基因表達(dá)、免疫組織化學(xué)染色法觀察EphB4、Caspase3蛋白形態(tài)的變化，論證一定劑量的吉西他濱對(duì)局部胰腺癌具有放射治療的效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，25 mg/kg吉西他濱+放射聯(lián)合組、50 mg/kg吉西他濱+放射聯(lián)合組的腫瘤體積、重量明顯小于其它組，而且50 mg/kg吉西他濱+放射聯(lián)合組的抑瘤率最高；在微觀上觀察干預(yù)組的(B組、C組、D組、E組、F組)EphB4、Caspase3的表達(dá)較對(duì)照組(A組)明顯增加，聯(lián)合組表達(dá)(E組，F(xiàn)組)強(qiáng)于其它單純放射組(B組)和用藥組(C組、D組)，F(xiàn)組的表達(dá)最強(qiáng)，各干預(yù)組之間具有顯著的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的吉西他濱用藥對(duì)于放射有增敏療效，對(duì)局部放射治療有明顯效果，為指導(dǎo)胰腺癌的治療提供了科學(xué)依據(jù)。

盡管胰腺癌的治療已經(jīng)取得了進(jìn)展，但吉西他濱仍然是晚期PDAC新輔助、輔助和姑息治療的基礎(chǔ)。為了獲得有效的治療方案，臨床醫(yī)生主要依靠平衡抗腫瘤作用和對(duì)正常組織的毒性。吉西他濱分子的許多化學(xué)修飾和封裝設(shè)計(jì)的已經(jīng)提出克服耐藥性機(jī)制。通常，保護(hù)胺功能(4-(N)位)的前藥物會(huì)阻斷cda誘導(dǎo)的吉西他濱失活，而將吉西他濱包封到脂質(zhì)體和NPs等膠體系統(tǒng)中，可以改善其藥代動(dòng)力學(xué)特征，從而改善生物分布和位點(diǎn)特異性給藥。