張雪，韓麗娟，陳莉霞，侯生珍，桂林生，王志有，楊葆春

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

黑藏羊是青藏高原地區(qū)具有特殊養(yǎng)殖效益和經(jīng)濟(jì)價值的藏羊品種之一[1]。黑藏羊主要產(chǎn)自青海省貴南縣，并于2017年5月被納入中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。隨著人們健康意識的提高，黑藏羊肉因其脂肪含量低、蛋白質(zhì)含量高、礦物質(zhì)和維生素種類豐富、氨基酸和脂肪酸營養(yǎng)價值高、適口性好、香氣濃郁、膻味小等優(yōu)點(diǎn)而備受消費(fèi)者的青睞[2]。羊骨作為黑藏羊屠宰后主要副產(chǎn)物，占黑藏羊肉總量20%～30%[3]，羊骨資源極為豐富，但目前黑藏羊骨大部分被用作粗飼料或隨意丟棄，沒有進(jìn)行深度加工和利用，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[4]。

大量研究表明，畜骨具有很高的營養(yǎng)價值，可以預(yù)防各種營養(yǎng)不足[5]。畜骨中含有骨膠、生長素、氨基酸等人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)，且其蛋白質(zhì)和脂肪含量可與鮮肉媲美。畜骨在產(chǎn)品加工利用方面也具有較大的前景。畜骨中的蛋白質(zhì)通過酶法水解后可用來生產(chǎn)混合膠原肽；骨髓中的骨髓油可用來開發(fā)各類輔料，如軟膠囊壁材、藥材黏合劑等；此外畜骨還可作為生物活性鈣源，目前使用比較廣泛的骨鈣產(chǎn)品有超細(xì)骨粉、膠原多肽鈣和骨鈣粉等[6]。

目前國內(nèi)外對于畜骨的研究多集中于牛骨營養(yǎng)價值分析。李享等[7]的研究結(jié)果表明牦牛骨的營養(yǎng)品質(zhì)比西門塔爾牛骨更好，為牦牛骨資源利用和精深加工提供了依據(jù)。吳婷等[8]研究5個不同品種牛骨營養(yǎng)組成，為牛骨進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。Mello等[9]對牛骨髓的脂質(zhì)進(jìn)行分析，為開發(fā)高附加值牛骨產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)；張晉華等[10]明確羊駝骨的成分特點(diǎn)和利用價值，為合理開發(fā)羊駝骨資源提供了理論依據(jù)。然而，目前對藏羊骨尤其是黑藏羊骨營養(yǎng)品質(zhì)和產(chǎn)品開發(fā)的研究鮮有報(bào)道，其關(guān)于營養(yǎng)品質(zhì)的數(shù)據(jù)十分匱乏，不利于今后黑藏羊骨資源的深入開發(fā)。因此，本研究通過對黑藏羊骨的營養(yǎng)價值進(jìn)行分析，并與湖羊骨的營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行比較，為黑藏羊骨的資源化利用和高值化產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)，這對提高黑藏羊產(chǎn)業(yè)的綜合效益也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑藏羊骨（肱骨）：采自青海省貴南縣；湖羊骨（肱骨）：采自青海省共和縣。兩種羊骨隨機(jī)選取于健康無病且月齡相同的黑藏公羊（6只）和湖公羊（6只），于溫度-20℃冷凍貯存。

石油醚：天津歐博凱化工有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；甲基紅：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠：上海展云化工有限公司。以上試劑均為分析純。甲酸（色譜純）：美國Fluka公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：德國Merck公司；正己烷（優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)；氯仿（優(yōu)級純）：上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白：南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DC-305高速多功能粉碎機(jī)：浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；SX2-8-10馬弗爐：長沙市華光電爐廠；K9840自動凱氏定氮儀、SOX406脂肪測定儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司；CT3-10K質(zhì)構(gòu)儀：美國Brookfield公司；U/V-1780紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；5500 QTRAP質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀、7890/5975C氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；5430R低溫高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；H1650-W冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

在4℃下解凍羊骨12 h，剔除羊骨表面肌肉、脂肪、骨連接處結(jié)締組織及骨髓后，清水洗凈、瀝干水分，破碎成塊后用高速多功能粉碎機(jī)破碎成粉過80目篩，密封后于-80℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.2 羊骨硬度測定

參考劉建華等[12]方法，采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行樣品硬度測定。探頭選用HDP/BS，測試前速度為1.5 mm/s，測試速度為2.0 mm/s，測試后速度為10.0 mm/s，觸發(fā)力為5 g。記錄峰值讀數(shù)，單位為g。

1.3.3 基本營養(yǎng)成分含量測定

水分含量參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中的直接干燥法進(jìn)行測定[13]；灰分含量參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》中的馬弗爐高溫灼燒法進(jìn)行測定[14]；粗蛋白含量參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測定[15]；粗脂肪含量參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》中的索氏提取法進(jìn)行測定[16]。

1.3.4 多肽含量測定

參照陳學(xué)紅等[17]的方法并作修改。制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.058 4x-0.002 4，R2=0.998 4。

參照陳學(xué)紅等[17]和何榮海等[18]的方法，將骨粉配制成0.4 mg/mL的水溶液。取骨粉水溶液與10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）水溶液混合（1∶1，體積比），振蕩、10 000 r/min離心10 min除去蛋白后，用5%TCA再次去除蛋白。取上清液與雙縮脲試劑混合（3∶2，體積比），2 000 r/min離心10 min。取上清液測定其吸光度（OD540nm），對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求羊骨水溶液中多肽濃度（mg/mL），從而求得羊骨多肽含量（g/100 g）。

1.3.5 游離氨基酸組成及含量測定

參照吳琴燕等[19]的方法并作修改。稱取骨粉60 mg經(jīng)液氮研磨后，分別加入0.5 mL甲醇-乙腈水溶液（2∶2∶1，體積比），渦旋 1 min后低溫超聲 60 min，-20℃條件下靜置1 h沉淀蛋白，取上清液進(jìn)行冷凍干燥。采用超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，采用多反應(yīng)檢測掃描（multi reaction monitoring,MRM）模式來檢測待測離子對。提取色譜峰面積和保留時間并用標(biāo)準(zhǔn)品校正保留時間，進(jìn)行定性定量分析。

1.3.6 氨基酸評分和化學(xué)評分分析

根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）建議的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)評分模式（FAO/WHO模式），以及中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的全雞蛋蛋白質(zhì)評分模式（Egg模式），分別按照公式（1）～（3）計(jì)算氨基酸評分（amino acid score,AAS）、化學(xué)評分（chemical score,CS）和必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index,EAAI）[20]。根據(jù)所測樣品中蛋白質(zhì)含量，將樣品中必需氨基酸含量（mg/g骨粉）換算為蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量（mg/g蛋白質(zhì)）。

式中：Ax為骨粉蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量，mg/g；Ao為FAO/WHO評分標(biāo)準(zhǔn)模式中同種必需氨基酸含量，mg/g。

式中：Cx為骨粉蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量，mg/g；Co為Egg評分標(biāo)準(zhǔn)模式中同種必需氨基酸含量，mg/g。

式中：n為必需氨基酸數(shù)；t為骨粉蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量，mg/g；s為標(biāo)準(zhǔn)模式中同種必需氨基酸含量，mg/g。

1.3.7 脂肪酸組成及含量測定

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測定》[21]中的內(nèi)標(biāo)法測定脂肪酸。使用氯仿-甲醇溶液提取樣品，然后用硫酸-甲醇溶液甲酯化，水楊酸甲酯作內(nèi)標(biāo)，混合均勻后加入進(jìn)樣瓶，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spec-trometry,GC-MS）檢測。根據(jù)色譜峰面積及保留時間，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定性定量分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度 50 ℃，保持 3 min；以10℃/min速度升高至220℃，維持5 min；載氣氦氣，流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口溫度280℃；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；電子轟擊電離源（electron impact ionization,EI）；單離子檢測掃描（single ion monitoring,SIM）模式；電子能量70 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行測定3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件和SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑藏羊骨與湖羊骨硬度對比分析

黑藏羊骨與湖羊骨硬度見圖1。

圖1 骨硬度Fig.1 Bone hardness

由圖1可知，黑藏羊骨與湖羊骨硬度分別為16 643.00 g和15 988.00 g，黑藏羊骨與湖羊骨硬度差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 黑藏羊骨與湖羊骨基本營養(yǎng)成分含量對比分析

黑藏羊骨與湖羊骨基本營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 骨基本營養(yǎng)成分含量Table 1 Bone basic nutrient content g/100 g

由表1可知，黑藏羊骨與湖羊骨水分含量分別為14.32、9.40g/100g；灰分含量分別為40.29、50.20 g/100 g；粗蛋白含量分別為27.74、16.21 g/100 g；粗脂肪含量分別為8.43、4.63 g/100 g。黑藏羊骨灰分含量極顯著低于湖羊骨（P＜0.01），水分、粗蛋白、粗脂肪含量極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。蛋白質(zhì)和脂肪含量是評價食品營養(yǎng)價值的重要參考因素[22]。李享等[7]研究表明牦牛骨粗蛋白含量為19.88%～20.37%，粗脂肪含量為15.55%～22.46%，說明黑藏羊骨與牦牛骨相比具有高蛋白、低脂肪特點(diǎn)。吳婷等[8]的研究發(fā)現(xiàn)不同部位畜骨營養(yǎng)成分差異顯著，說明不同畜種和畜骨部位都可能是黑藏羊骨與牦牛骨營養(yǎng)成分差異顯著的原因。此外，由于黑藏羊常年生活在高海拔地區(qū)，缺氧的環(huán)境造就了黑藏羊骨強(qiáng)大的造血功能來維持血液中血紅蛋白對氧氣的運(yùn)輸，而骨髓中的脂肪細(xì)胞對造血微環(huán)境有抑制作用，這可能是黑藏羊骨與牦牛骨相比具有高蛋白低脂肪特征的原因之一[23-25]。Zhang等[26]的研究表明藏羊肉中蛋白質(zhì)含量為26.45 g/100 g，脂肪含量為4.70 g/100 g，說明藏羊骨的營養(yǎng)價值可以與藏羊肉媲美。雖然黑藏羊骨脂肪含量與湖羊骨及藏羊肉相比較高，但低于其他畜骨和畜肉脂肪含量，滿足低脂肪食品的要求[27]，且較高的脂肪含量可以提高食品風(fēng)味[28]，因此黑藏羊骨不僅營養(yǎng)價值高于湖羊骨，其風(fēng)味也優(yōu)于湖羊骨，說明黑藏羊骨更加符合人們對高品質(zhì)食品的追求，黑藏羊骨極具開發(fā)潛力。

2.3 黑藏羊骨與湖羊骨多肽含量對比分析

黑藏羊骨與湖羊骨多肽含量見圖2。

圖2 骨多肽含量Fig.2 Bone peptide content

由圖2可知，黑藏羊骨與湖羊骨多肽含量分別為6.87 g/100 g和4.00 g/100 g，黑藏羊骨多肽含量顯著高于湖羊骨（P＜0.05）。羊骨蛋白質(zhì)主要組成物質(zhì)為膠原蛋白，多肽作為膠原蛋白主要水解產(chǎn)物[29]，具有抗氧化、抑制微生物、抗骨質(zhì)疏松、提高免疫力、抗高血壓等生物學(xué)功能[30]。研究結(jié)果表明黑藏羊骨具有更好的營養(yǎng)價值和生物學(xué)功能，可作為提取骨多肽的良好生物來源。

2.4 黑藏羊骨與湖羊骨游離氨基酸組成及含量對比分析

黑藏羊骨與湖羊骨游離氨基酸組成及含量見表2。

氨基酸的類型和含量決定了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[31]。由表2可知，羊骨中共檢出19種氨基酸，其中包括8種必需氨基酸，2種半必需氨基酸，8種非必需氨基酸，以及1種亞氨基酸（羥脯氨酸）。黑藏羊骨和湖羊骨TAAs含量分別為 45.94、21.89 mg/g，EAAs含量分別為13.24、5.88 mg/g，鮮味氨基酸（delicious amino acids，DAAs）含量分別為 14.27、5.76 mg/g。黑藏羊骨 TAAs、EAAs、DAAs含量均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。在黑藏羊骨的必需氨基酸中，賴氨酸含量最高（3.15 mg/g），其次為纈氨酸（2.89 mg/g）和亮氨酸（2.23 mg/g），均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。亮氨酸和纈氨酸是組成支鏈氨基酸的重要部分，它們具有調(diào)控機(jī)體糖和脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成以及增強(qiáng)免疫等多種生物學(xué)功能[32]。在黑藏羊骨鮮味氨基酸中，丙氨酸含量最高（6.94 mg/g），其次為谷氨酸（3.89 mg/g）和甘氨酸（3.44 mg/g），均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。谷氨酸對鮮味有貢獻(xiàn)，甘氨酸和丙氨酸則表現(xiàn)出甜味[33]，它們能賦予食品更好的風(fēng)味。甘氨酸、賴氨酸、脯氨酸作為膠原蛋白特征性氨基酸可與羥脯氨酸一起表征畜骨中的膠原蛋白含量[34]，其中黑藏羊骨脯氨酸（2.91 mg/g）含量極顯著高于湖羊骨（P＜0.01），羥脯氨酸（0.28 mg/g）含量也顯著高于湖羊骨（P＜0.05），表明黑藏羊骨膠原蛋白含量顯著高于湖羊骨，與多肽含量的結(jié)果一致，對于開發(fā)高附加值產(chǎn)品具有廣泛前景。

2.5 黑藏羊骨與湖羊骨氨基酸評分及化學(xué)評分對比分析

黑藏羊骨與湖羊骨氨基酸評分和必需氨基酸指數(shù)見表3。

表3 骨氨基酸評分和必需氨基酸指數(shù)Table 3 Amino acid scores and essential amino acid indexes of bone

由表3可知，黑藏羊骨的第一限制氨基酸為蘇氨酸（0.06），湖羊骨的第一限制氨基酸為色氨酸（0.04），說明在羊骨中蘇氨酸和色氨酸提供的營養(yǎng)價值較低，而在牛骨中甲硫氨酸+半胱氨酸為第一限制氨基酸[7]，表明不同畜骨的氨基酸功能存在差異。黑藏羊骨中賴氨酸評分最高，為0.28，纈氨酸和亮氨酸也有較好的氨基酸評分，分別為0.26、0.20，這與牛骨中的結(jié)果一致[7]。其中黑藏羊骨賴氨酸和纈氨酸評分極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。湖羊骨中亮氨酸評分最高，為0.20，與黑藏羊骨相同。以FAO/WHO模式作為評價標(biāo)準(zhǔn)，黑藏羊骨和湖羊骨EAAI分別為1.02和0.99。綜上，黑藏羊骨AAS高于湖羊骨，表明黑藏羊骨蛋白質(zhì)質(zhì)量優(yōu)于湖羊骨。兩種羊骨CS和必需氨基酸指數(shù)結(jié)果見表4。

表4 骨化學(xué)評分和必需氨基酸指數(shù)Table 4 Chemical scores and essential amino acid indexes of bone

由表4可知，以Egg模式作為評價標(biāo)準(zhǔn)，黑藏羊骨和湖羊骨EAAI分別為0.98和0.95?；瘜W(xué)評分結(jié)果與氨基酸評分結(jié)果保持一致，再次表明黑藏羊骨蛋白質(zhì)質(zhì)量優(yōu)于湖羊骨，更接近全雞蛋蛋白質(zhì)。EAAI是衡量樣品蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的主要指標(biāo)，EAAI越接近1，樣品蛋白質(zhì)必需氨基酸組成越接近標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，營養(yǎng)價值越高[35]。黑藏羊骨EAAI為0.98～1.02，湖羊骨EAAI為0.95～0.99，黑藏羊骨比湖羊骨更接近標(biāo)準(zhǔn)值，并且高于豬骨（0.66）[36]，表明黑藏羊骨是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。

2.6 黑藏羊骨與湖羊骨脂肪酸組成及含量對比分析

黑藏羊骨與湖羊骨脂肪酸組成及含量見表5。

表5 骨脂肪酸組成及含量Table 5 Fatty acid composition and content of bone

續(xù)表5 骨脂肪酸組成及含量Continue table 5 Fatty acid composition and content of bone

由表5可知，在黑藏羊骨與湖羊骨中共檢出29種脂肪酸，其中包括飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）12種，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）6種，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFAs）11種。黑藏羊骨與湖羊骨總脂肪酸（total fatty acids，TFAs）含量分別為 5 736.85、2 785.94 mg/100 g。黑藏羊骨 TFAs、SFAs、MUFAs、PUFAs含量均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。黑藏羊骨和湖羊骨中n-6/n-3 比值分別為 6.41、3.29，C16：0/C18：1 比值分別為0.49和0.36，其中黑藏羊骨n-6/n-3比值顯著高于湖羊骨（P＜0.05），兩種羊骨的 C16：0/C18：1 比值差異不顯著。油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸是羊骨的特征脂肪酸，這與吳婷等[8]的研究結(jié)果一致。不飽和脂肪酸具有多種生理調(diào)節(jié)功能，包括清理血栓、調(diào)節(jié)血脂、提高視力等[37]。在黑藏羊骨單不飽和脂肪酸中，油酸含量最高（2 639.61 mg/100 g），棕櫚油酸次之（85.76 mg/100 g）。油酸可以在一定程度上降低高血脂患者血脂水平同時預(yù)防心血管疾病，此外油酸還是肉制品中主要的風(fēng)味脂肪酸[38]。棕櫚油酸能影響脂肪的形成，對肥胖癥起到一定的治療效果，還可以影響多種血糖代謝關(guān)鍵酶、調(diào)節(jié)患者的胰島素分泌[39]。而多不飽和脂肪酸能夠降低血清中膽固醇含量[40]，在多不飽和脂肪酸中，n-6/n-3比值是評價食品營養(yǎng)價值以及是否可以作為健康食品提供給消費(fèi)者的重要指標(biāo)[41]。建議在人類飲食中，n-6/n-3的比值介于4～6之間，以幫助維持良好的心血管健康[42]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)降低人類飲食中C16：0/C18：1有利于提高胰島素敏感性[43]，從而降低患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，黑藏羊骨脂肪酸在含量和組成上均優(yōu)于湖羊骨，具有較好的營養(yǎng)價值和生理功能，相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)潛力大。

3 結(jié)論

本文研究了青海黑藏羊骨硬度、水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、多肽含量、游離氨基酸組成、氨基酸評分和脂肪酸組成，并與湖羊骨進(jìn)行了對比分析。黑藏羊骨水分、粗脂肪、粗蛋白含量均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01），多肽含量也顯著高于湖羊骨（P＜0.05），而灰分含量極顯著低于湖羊骨（P＜0.01）。黑藏羊骨總氨基酸、必需氨基酸、鮮味氨基酸含量均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01）。黑藏羊骨第一限制氨基酸為蘇氨酸，湖羊骨第一限制氨基酸為色氨酸，黑藏羊骨具有較高的氨基酸評分、化學(xué)評分和必需氨基酸指數(shù)，氨基酸組成更接近FAO/WHO模式和全雞蛋模式。黑藏羊骨總脂肪酸、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量均極顯著高于湖羊骨（P＜0.01），n-6/n-3比值也顯著高于湖羊骨（P＜0.05），更接近有利于人體健康的標(biāo)準(zhǔn)值。本文研究結(jié)果顯示，黑藏羊骨的營養(yǎng)品質(zhì)較好，且優(yōu)于湖羊骨，研究結(jié)果為黑藏羊骨進(jìn)一步加工利用提供了依據(jù)。