陳 陽，陳俏純，鄧 鵬，何志勇，王召君，陳秋銘，陳 潔，曾茂茂

（江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

雜環(huán)胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）是蛋白食品經(jīng)高溫加工過程產(chǎn)生的一類具有致畸、致癌性的化合物，目前已經(jīng)分離鑒定出30 種左右，部分HAAs在埃姆斯測驗中表現(xiàn)出比黃曲霉毒素B和苯并(a)芘更強(qiáng)的誘變特性。在乳腺癌、前列腺癌和肝癌等疾病形成中，HAAs發(fā)揮的作用與其經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化吸收后形成的高水平DNA加合物有關(guān)。因動物源食品相對植物基食品中存在獨(dú)有的肌酸（酐），動物源制品尤其是肉制品含有較多種類及含量的HAAs，這是世界衛(wèi)生組織將紅肉及其制品列為致癌物的原因之一。

食品中HAAs的研究多針對其在食品加工過程中的形成及抑制。李雨竹等發(fā)現(xiàn)，生姜和辣椒可以減少鹵煮牛肉中HAAs，而其特征成分6-姜酚和辣椒素的抑制作用更強(qiáng)。薛超軼等認(rèn)為，組氨酸可以濃度依賴性地抑制烤牛肉餅中-咔啉類雜環(huán)胺，脯氨酸對2-氨基-3,8-二甲基咪唑并喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-]quinoxaline，MeIQx）的抑制能力同樣呈濃度依賴關(guān)系。Li Yong等研究發(fā)現(xiàn)，鹽的加入將降低烤牛肉餅的蒸煮損失，這增加了肉餅的適口性，但導(dǎo)致更多HAAs生成。此外，由于植物油分解的復(fù)雜性和油中抗氧化劑的差異，植物油在抑制HAAs方面仍需進(jìn)一步研究。除了食品加工常用的油脂、香辛料及磷酸鹽等輔料或添加劑之外，藍(lán)莓、木瓜和鱷梨等富含抗氧化成分的水果及其提取物因具有較強(qiáng)的自由基清除作用而常見于抑制HAAs生成的研究中。以上研究在阻斷因肉制品熱加工過程HAAs生成而引起的HAAs膳食暴露方面取得了長足進(jìn)展，但目前尚未有可以完全抑制高溫加工熟肉制品中所有HAAs的方法。因此，基于天然植物單體成分在減少膳食攝入HAAs毒性方面的研究也有一些報道。Serap等發(fā)現(xiàn)葉綠素a和葉綠素b可以防止由MeIQx引起的DNA損傷；Anna等證實咖啡因、己酮可可堿和茶堿可以與HAAs形成π-π堆疊復(fù)合物，并降低HAAs的致突變性；Bear等研究發(fā)現(xiàn)，香葉木苷、柚皮苷、柚皮素和蘆丁等柑橘類黃酮對由細(xì)胞色素P450 1A2介導(dǎo)的HAAs致突變性具有預(yù)防潛力。

Arkadiusz認(rèn)為，HAAs是以游離態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)2 種形式存在于食品中，而體外消化實驗中經(jīng)消化酶解測得顯著高于常規(guī)有機(jī)溶劑萃取的HAAs含量證實了這一觀點。蛋白質(zhì)在胃腸道消化階段被廣泛水解形成游離氨基酸或肽，部分研究顯示，低聚肽的吸收效率要高于游離氨基酸，這意味著HAAs的膳食暴露量要高于以往研究中使用有機(jī)溶劑萃取所得HAAs含量，甚至可能因為肽吸收的原因也高于消化過后的游離態(tài)HAAs含量。因此，同時測定膳食中游離態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)HAAs的含量可以更好地預(yù)估真實膳食暴露HAAs水平。根據(jù)前述，針對食品加工過程中HAAs生成抑制的研究重點是篩選有效的天然植物及其提取物，然而目前沒有明確關(guān)于這些外源添加物對于消化過程HAAs釋放影響的研究報道?；谑澄锘|(zhì)的復(fù)雜性及外源添加物對消化過程干預(yù)機(jī)制的不明確性，本研究分析生活中較為常見的蘋果與葡萄對烤牛肉餅消化過程中的游離態(tài)及蛋白結(jié)合態(tài)HAAs的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛里脊肉（2～3 歲魯西公黃牛，體質(zhì)量約800 kg），購于無錫華潤萬家超市萬順路店；新鮮蘋果和葡萄購于無錫歐尚超市高浪店。

17 種HAAs標(biāo)準(zhǔn)品，包括2-氨基-9-吡啶并[2,3-]吲哚（2-amino-9-pyrido[2,3-]indole，AC）、2-氨基-3甲基-9-吡啶并[2,3-]吲哚（2-amino-3-methyl-9pyrido[2,3-]indole，MeAC）、1-甲基-9-吡啶并[3,4-] 吲哚（1-methyl-9-pyrido[3,4-]indole，harman）、9-吡啶并[3,4-]吲哚（9-pyrido[3,4-]indole，norharman）、2-氨基-6-甲基二吡啶并[1,2-:3’,2’-]咪唑、2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4,5-]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-]pyridine，PhIP）、2-氨基-1,6-二甲基咪唑并[4,5-]吡啶、2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑并[4,5-]吡啶、2-氨基-3-甲基-3-咪唑并[4,5-]喹啉（2-amino-3-methyl-3-imidazo[4,5-]quinoline，IQ）、 2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-]喹啉（2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-]quinoline，MeIQ）、2-氨基-1-甲基咪唑并[4,5-]喹啉（2-amino-1-methylimidazo[4,5-]quinoline，IQ[4,5-]）、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-]喹喔啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-]quinoxaline，IQx）、MeIQx、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-]喹喔啉、 2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-]喹喔啉、2-氨基-3,4,7,8-四甲基-3-咪唑并[4,5-]喹喔啉、2-氨基-5-苯基吡啶（2-amino-5-phenylpyridine，Phe-P-1）（純度＞99.9%） 圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司；-淀粉酶（酶活力12 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力30 U/mg）、胰酶（酶活力4 U/mg）、豬膽鹽（膽酸含量≥60%） 上海源葉生物技術(shù)有限公司；硅藻土、NaOH、HCl、乙酸乙酯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜級） 德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI） 美國Waters公司；Fotector Plus全自動固相萃取儀、AUTO EVA全自動濃縮儀 中國?？苾x器有限公司；SCC61萬能蒸烤箱 德國Rational公司。

1.3 方法

1.3.1 烤牛肉餅的制備

生牛里脊肉糜（40.0±0.1） g用內(nèi)徑6 cm的鐵圈定型成餅狀后在烤箱中225 ℃烘烤20 min（每面烘烤10 min）。冷卻至室溫后，將所有烤牛肉餅攪碎后充分混勻。隨后進(jìn)行冷凍干燥，并在-80 ℃下保存。

1.3.2 牛肉餅的體外消化

實驗組樣品為體外消化前分別向2.5 g凍干牛肉餅中加入現(xiàn)攪碎新鮮蘋果泥和葡萄泥（添加量分別為凍干牛肉餅質(zhì)量的50%、100%和150%），再進(jìn)行體外消化；對照組樣品則直接稱量相同質(zhì)量凍干牛肉餅進(jìn)行體外消化。體外消化參考Minekus等的方法。

1.3.3 體外消化液中游離態(tài)HAAs的提取

體外消化結(jié)束后取全部消化液，加入一定量的NaOH調(diào)節(jié)pH值至約12.0，以抑制消化酶活性并提高HAAs的萃取效率，加入40 mL乙酸乙酯40 kHz、50 ℃超聲提取45 min，收集混合液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后得上層乙酸乙酯相，重復(fù)提取2 次。氮吹濃縮乙酸乙酯相至20 mL左右，固相萃取前加入100 μL 2 mol/L HCl溶液中和殘留的NaOH。提取液隨后進(jìn)行固相萃取。

1.3.4 體外消化液中結(jié)合態(tài)HAAs的提取

參考Chen Jing等的方法，略有改動。在用乙酸乙酯提取出游離HAAs后，剩余的下層液體濃縮至約20 mL后轉(zhuǎn)移到48 mL耐壓瓶中，加入等體積的濃鹽酸使鹽酸濃度約為6 mol/L，于110 ℃烘箱中水解24 h后，將水解液過濾定容至100 mL，取10 mL進(jìn)行固相萃取。

1.3.5 固相萃取

采用全自動固相萃取儀和MCX固相萃取小柱對樣品進(jìn)行分離富集和純化。分別使用6 mL色譜級甲醇、超純水、乙酸乙酯活化MCX固相萃取小柱，然后上樣HAAs提取液，隨后依次用6 mL 0.1 mol/L HCl和甲醇淋洗小柱，最后使用6 mL甲醇-氨溶液（19∶1，/）洗脫保留在小柱中的HAAs，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥?.3 mL色譜級甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后使用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

1.3.6 UPLC-MS/MS檢測條件

HAAs的定性及定量分析采用本課題組前期研究中的方法，使用Waters Acquity UPLC BEH C色譜柱分離17 種HAAs，柱溫45 ℃，以100%乙腈（A）和0.1%甲酸（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫：0～2 min，2%流動相A；2～12 min，2%～20%流動相A；12～14 min，20%～100%流動相A；14～17 min，100%～2%流動相A； 17～20 min，2%流動相A?？傔\(yùn)行時間為20 min，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。ESI-MS操作條件如下：正離子模式（ESI）運(yùn)行，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣（氮?dú)猓囟?00 ℃，毛細(xì)管電壓3.50 kV，錐孔氣（氮?dú)猓┝髁?0 L/h，脫溶劑氣流量700 L/h，碰撞氣（氬氣）流量0.15 mL/min。MS檢測采用多反應(yīng)監(jiān)測模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS/MS圖譜采集及定性、定量分析均采用Mass Lynx V4.1軟件。數(shù)據(jù)顯著性分析使用Minitab 19軟件完成，做圖軟件為Origin 2022b教育版，主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析作圖使用Metaboanalyst在線網(wǎng)站（https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果與葡萄對烤牛肉餅消化后游離態(tài)HAAs含量的影響

由表1可知，烤牛肉餅中存在8 種游離態(tài)HAAs，含量從低到高依次為AC、Phe-P-1、MeIQx、IQ[4,5-]、MeAC、PhIP、Harman、Norharman，對照組總游離態(tài)HAAs含量達(dá)到112.41 ng/g，各HAAs含量為0.11～88.41 ng/g。PhIP、Harman和Norharman占據(jù)總游離HAAs的98%，食品組分的差異和各HAAs的生成所需前體物的不同是各HAAs在烹飪過程含量差異變化的最主要原因。添加水果泥的烤牛肉餅消化液中含有更多含量的游離態(tài)HAAs，最高達(dá)到236.30 ng/g，相對提高110%。除添加蘋果泥的烤牛肉餅PhIP含量略有下降外，其余各HAAs都有所增加，相對增加5%～183%。蘋果泥與葡萄泥加入后，消化液中Phe-P-1、Harman、Norharman和總游離HAAs呈現(xiàn)含量依賴性顯著增加 （＜0.05）；游離態(tài)AC和MeIQx的含量同樣表現(xiàn)出含量依賴性增加，但不具有顯著性差異；IQ[4,5-]、MeAC和PhIP的含量變化則未與水果泥的添加量呈現(xiàn)出良好規(guī)律性。

表1 蘋果與葡萄對烤牛肉餅消化后游離態(tài)HAAs含量的影響Table 1 Free HAAs content in digested products of roast beef patties affected by apple and grape ng/g

2.2 蘋果與葡萄對烤牛肉餅消化后蛋白結(jié)合態(tài)HAAs 含量的影響

由表2可知，烤牛肉餅中存在3 種蛋白結(jié)合態(tài)HAAs，含量從低到高依次為Harman、MeAC和Norharman，對照組總蛋白結(jié)合態(tài)HAAs含量達(dá)到176.80 ng/g，各HAAs含量為42.50～76.96 ng/g。蛋白結(jié)合態(tài)HAAs的來源可以分為蛋白對游離態(tài)HAAs的選擇性物理吸附；游離HAAs與蛋白通過形成穩(wěn)定的酰胺鍵結(jié)合；蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)直接生成結(jié)合態(tài)HAAs。添加蘋果泥的烤牛肉餅消化液中除Harman外的各蛋白結(jié)合態(tài)HAAs和總結(jié)合態(tài)HAAs含量都含量依賴性顯著下降 （＜0.05），結(jié)合態(tài)MeAC、Norharman和Harman含量分別最高減少59%、74%和82%。葡萄泥的加入量與蛋白結(jié)合態(tài)HAAs之間沒有明顯的規(guī)律，100%葡萄泥添加量消化液中蛋白結(jié)合態(tài)HAAs含量高于其他添加量組，最高分別減少30%、61%和77%的結(jié)合態(tài)MeAC、Norharman和Harman。

表2 蘋果與葡萄對烤牛肉餅消化后蛋白結(jié)合態(tài)HAAs含量的影響Table 2 Protein-bound HAAs content in digested products of roast beef patties affected by apple and grape ng/g

2.3 相關(guān)性分析

由圖1A可知，對照組與水果泥添加組消化液中的HAAs總含量沒有顯著性差異，表明水果泥的引入并未引起HAAs總量的變化。由圖1B可知，結(jié)合態(tài)HAAs與游離態(tài)HAAs之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中蛋白結(jié)合態(tài)Harman與游離態(tài)Harman相關(guān)系數(shù)為-0.66（＜0.01），蛋白結(jié)合態(tài)Norharman與游離態(tài)Norharman相關(guān)系數(shù)為-0.53 （＜0.05），表明水果泥的確促進(jìn)了蛋白結(jié)合態(tài)HAAs在消化過程向游離態(tài)HAAs的轉(zhuǎn)化。Chen Jing等發(fā)現(xiàn)，蛋白結(jié)合態(tài)HAAs與游離態(tài)HAAs的種類并不會完全一致，而食品基質(zhì)對蛋白結(jié)合態(tài)HAAs釋放的種類及含量存在顯著影響。Xue Chaoyi等研究發(fā)現(xiàn)，正常消化酶的劑量對水溶性肌漿蛋白和鹽溶性肌原纖維蛋白上結(jié)合的HAAs具有有限的釋放能力，隨著消化酶劑量的增加，游離態(tài)HAAs的含量也會增加，并且關(guān)鍵消化酶為腸消化階段的胰蛋白酶，在相同消化酶劑量下，辣椒和洋蔥等香辛料及蘋果等均促進(jìn)了蛋白結(jié)合態(tài)HAAs的釋放，這與外源添加物對消化酶活性的影響、促進(jìn)消化底物的暴露與消化酶的有效結(jié)合有關(guān)。

圖1 消化液中總HAAs含量（A）及游離態(tài)與蛋白結(jié)合態(tài) HAAs相關(guān)性分析（B）Fig. 1 Total HAAs in digested products of roast beef patties (A), and correlation analysis between free and protein-bound HAAs (B)

2.4 PCA與聚類分析

由圖2A可知，第1和第2主成分可以解釋原始數(shù)據(jù)集68.7%的特征，對照組與水果泥添加組在第1主成分方向可以較好地分離，根據(jù)PCA得分圖可以確定，對消化過程HAAs釋放綜合影響程度從低到高依次為50%蘋果、100%葡萄、100%蘋果、50%葡萄、150%葡萄和150%蘋果。由圖2B可知，樣本分類主要聚為3 類。100%葡萄與50%蘋果與對照組為聚為一類，表明100%葡萄與50%蘋果與對照組的組成更為接近；其次，可以看出50%葡萄與100%蘋果組影響效果接近，聚為一類；最后，150%蘋果與150%葡萄組合聚為一類。PCA與聚類熱圖相互印證，表明數(shù)據(jù)分析結(jié)果可靠。聚類熱圖中還顯示，在測試指標(biāo)中，蛋白結(jié)合態(tài)HAAs歸為一簇，與游離態(tài)HAAs具有較大差異，符合實際測定。

圖2 各組消化液的PCA得分圖（A）及聚類分析圖（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and cluster heatmap (B) of digested products of roast beef patties with different amounts of added apple or grape puree

3 結(jié) 論

烤牛肉餅消化后存在8 種游離態(tài)HAAs和3 種蛋白結(jié)合態(tài)HAAs，水果的攝入會造成蛋白結(jié)合態(tài)HAAs的釋放，并且有隨著水果攝入量增加蛋白結(jié)合態(tài)HAAs釋放增強(qiáng)的趨勢。以往研究大多專注于肉制品熟制過程中游離態(tài)HAAs的生成抑制，忽視了食品中蛋白結(jié)合態(tài)HAAs在消化過程會因蛋白水解造成釋放的事實，未來應(yīng)加強(qiáng)外源添加物對蛋白結(jié)合態(tài)HAAs影響的監(jiān)測和減控，以避免低估膳食暴露HAAs含量。