燈盞細辛聯(lián)合依帕司他對糖尿病腎病模型大鼠的治療作用及機制

屈雅娟，張敬芳，孫 旗，王 雄，易文媛，吳子湘，郭承熙，陳天禹，董博然

(長沙醫(yī)學院第一臨床學院，湖南 長沙 410219)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者發(fā)生致殘致死的主要因素[1-2]。DN的治療措施以降糖、降壓、飲食控制為主，雖可以減少尿蛋白，但對延緩病情進展的效果有限，會導(dǎo)致終末期腎病的發(fā)生，而終末期腎病患者的5年生存率低于20%[3-4]。近年來，醛糖還原酶抑制劑(Aldose reductase inhibitor，ARIs)以及抗氧化等特殊療法獲得了極佳的療效，愈發(fā)受到臨床重視[5]。由于DN的發(fā)病機制復(fù)雜，單純的西藥對癥治療方案的療效具有局限性，而中西醫(yī)結(jié)合治療可充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢，已成為臨床科研的重點領(lǐng)域和熱門[6-7]。

燈盞細辛為菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz的干燥全草，具有活血化瘀、消炎止痛、抗氧化等多種藥理作用，其主要成分黃酮類化合物-燈盞花素可通過抑制醛糖還原酶(Aldose reductase，AR)、氧化應(yīng)激等多種機制，達到預(yù)防和治療DN的目的[8-9]。西藥依帕司他(Epalrestat，EPST)能有效抑制多元醇通路(Polyol pathway，PP)的激活，改善腎功能障礙，為機體腎組織形成屏障[10-11]。目前鮮有研究報道燈盞細辛聯(lián)合EPST治療DN的應(yīng)用價值。所以本研究建立DN大鼠模型，采用中藥燈盞細辛聯(lián)合西藥EPST抗DN，研究其對DN大鼠腎組織PP中AR表達的調(diào)控作用以及對腎功能損傷和腎臟氧化應(yīng)激的影響，探究其可能的作用機制，為臨床治療DN提供新型的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：50只清潔級的8周齡健康SD大鼠體重(200±20) g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK(湘)2019-0004]。大鼠在實驗期間都置于每日光照12 h、溫度22～26 ℃、濕度40%～70%的清潔級環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境至少1周后開始實驗。

1.1.2 主要藥物： 燈盞細辛提取物(燈盞花素)(批號：20210601)；依帕司他(批號：21080045)。

1.1.3 試劑和主要儀器：高脂高糖飼料(58.8%基礎(chǔ)飼料、20.0%豬油、1.0%膽固醇、0.2%膽鹽、20.0%糖)，購自南京盛民科研動物養(yǎng)殖場；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，購自北京白鯊易科技有限公司，批號：BS185；AR和大鼠尿微量白蛋白(24 h urinary microcontent albumin，24 h UmAlb)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN，批號：20211214)、肌酐(Serum creatinine，Scr，批號：20211018)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，批號：20210909)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA，批號：20210916)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH，批號：20210607)和考馬斯亮藍色檢測試劑盒(批號：20211109)均購自南京建成生物工程研究所；7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)；XSP-8CA型光學顯微鏡(上海雙旭電子有限公司)；DNM9602型酶標儀(北京朗普新技術(shù)有限公司)；RM2126型石蠟切片儀器(徠卡公司)；HWJ-3-160型恒溫培養(yǎng)箱、HCF8型離心機(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；HH-2型水浴鍋(常州市江南實驗儀器廠)；JB包埋機、JK烤片機、DG-P8攤片機、JJ-12J脫水機(武漢俊杰電子有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DN模型建立：隨即選擇10只大鼠為正常對照組，并持續(xù)給予普通飼料喂食至實驗結(jié)束。而對其他大鼠在進行1周的高脂高糖飲食喂養(yǎng)后，于腹腔內(nèi)一次性注入STZ 55 mg/kg(需禁食不禁水12 h，注射用枸櫞酸緩沖液以濃度為1%配制)。3 d后用血糖儀測尾靜脈血，如血糖值≥16.7 mmol/L，則糖尿病模型構(gòu)建完成。再進行14 d的高脂高糖飲食喂養(yǎng)，并采集24 h尿液，若24 h UmAlb在30～300 mg/24 h之間，即可確定DN大鼠模型已成功構(gòu)建。

1.2.2 實驗分組及給藥：將成模的40只大鼠隨即平均分為模型組、EPST組[100 mg/(kg·d)]、燈盞細辛組[200 mg/(kg·d)]及EPST+燈盞細辛組(兩藥物同劑量聯(lián)合給藥)，用5 g/L CMC-Na配制成混懸液，灌胃6周，空白組和模型組給予等體積溶媒。

1.3 觀測指標

1.3.1 一般形態(tài)學觀察：實驗過程中，觀察大鼠的毛發(fā)光澤度、活動情況、精神狀態(tài)以及飲食飲水量。

1.3.2 HE染色觀察腎組織病理形態(tài)：取部分腎臟組織，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液灌洗后，脫水，透明，浸蠟包埋，制成切片，行HE染色，再脫水封蠟，用光鏡顯微鏡觀察。

1.3.3 空腹血糖和體重檢測：實驗期間，每2周測1次FBG和體重。禁食不禁水12 h后，測定大鼠體重，接著用采血針扎大鼠尾部末梢，再用血糖儀測FBG。

1.3.4 腎功能指標檢測：造模6周后，使用代謝籠收集24 h大鼠尿液，采用ELISA法檢測24 h UmAlb；取大鼠腹主動脈血后，將獲得的血樣本1500 g離心10 min，在移取其上清液后，用全自動生化分析儀檢驗BUN、Scr。

1.3.5 試劑盒檢測腎組織SOD活性、MDA和GSH含量：取部分腎臟組織先用0.9%氯化鈉溶液漂洗，按1∶9的配比添加0.9%氯化鈉水溶液，1500×g離心10 min(4 ℃)，制備組織勻漿。嚴格按照各試劑盒說明書的方法進行SOD活性，MDA和GSH含量的測定。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.3.6 ELISA檢測腎組織AR活性； 腎組織先用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗，按∶9添加0.9%氯化鈉水溶液，1500×g離心10 min(4 ℃)，制備組織勻漿。嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法進行腎組織樣本中的AR活性的測定。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 正常對照組大鼠毛色光澤順滑、活動能力好、精神狀態(tài)佳；模型組大鼠皮毛枯黃無光澤、身體呈現(xiàn)弓背、多飲、多食、多尿、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、嗜睡、肢體發(fā)冷、大便呈稀溏樣等特征；與模型組比較，EPST組、燈盞細辛組和EPST+燈盞細辛組大鼠整體狀態(tài)好轉(zhuǎn)，其中，EPST+燈盞細辛組大鼠在所有給藥組中整體狀態(tài)恢復(fù)最佳。

2.2 各組大鼠腎臟形態(tài)學比較 光鏡下結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎小球、腎小管、腎囊腔、基底膜以及系膜區(qū)正常；模型組大鼠較正常對照組，出現(xiàn)腎小球肥大、囊腔縮小，基質(zhì)膜和系膜區(qū)加厚，腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡樣變性，管腔面積明顯增加；EPST組、燈盞細辛組和EPST+燈盞細辛組較模型組，腎小球和腎小管均有不同程度地改善，EPST+燈盞細辛組改善作用最明顯，腎小球大小與結(jié)構(gòu)均趨向正常化，且基底膜未見明顯增生，腎小管上皮細胞未見明顯空泡變性(圖1)。

圖1 各組大鼠腎臟形態(tài)學比較(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠FBG和體重水平比較 相較于正常對照組，各干預(yù)組在造模后3 d，F(xiàn)BG水平顯著升高(P<0.01)，且血糖值均超過16.7 mmol/L，提示造模成功，各組大鼠均處在高血糖水平環(huán)境中；而各干預(yù)組在造模前，體重無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；EPST組、燈盞細辛組、EPST+燈盞細辛組在藥物干預(yù)6周后，F(xiàn)BG均低于模型組(P<0.01)，體重均高于模型組(P<0.01)；與燈盞細辛或者EPST組比較，EPST+燈盞細辛組大鼠FBG降低(P<0.05)，體重升高(P<0.05)，提示EPST和燈盞細辛能降低DN大鼠的FBG和升高大鼠的體重，而燈盞細辛聯(lián)合EPST給藥治療效果最顯著。見表1。

表1 各組大鼠FBG及體重水平比較

2.4 各組大鼠腎功能水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠的BUN、Scr、24 h UmAlb水平均顯著性增加(P<0.01)，表明機體發(fā)生了腎功能損傷；于模型組比較，EPST組、燈盞細辛組、EPST+燈盞細辛組的BUN、Scr、24 h UmAlb水平顯著降低(P<0.01)，其中EPST+燈盞細辛組的BUN、24 h UmAlb水平顯著低于EPST組或燈盞細辛組(P<0.05)，說明燈盞細辛聯(lián)合EPST給藥可緩解DN大鼠腎損傷，且作用優(yōu)于任一單獨給藥組。見表2。

表2 各組大鼠腎功能水平比較

2.5 各自大鼠氧化應(yīng)激水平比較 模型組大鼠腎臟SOD、GSH水平較正常對照組顯著降低(P<0.01)，而MDA濃度顯著提高(P<0.01)，提示糖代謝紊亂已經(jīng)造成了機體的氧化應(yīng)激損傷；各給藥組大鼠腎臟SOD、GSH水平較模型組顯著升高(P<0.01)，而EPST+燈盞細辛組大鼠腎臟SOD水平較EPST組或燈盞細辛組顯著升高(P<0.05)，EPST+燈盞細辛組大鼠腎臟GSH含量雖與EPST組比較，無統(tǒng)計學差異(P>0．05)，但仍然有升高；各給藥組大鼠腎臟MDA濃度較模型組顯著降低(P<0.01)，EPST+燈盞細辛組大鼠腎臟MDA濃度較EPST組或燈盞細辛組顯著降低(P<0.05)，說明燈盞細辛與EPST聯(lián)合給藥可顯著降低DN大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷，且作用最顯著。見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激水平比較

2.6 各組大鼠腎臟AR活性比較 與正常對照組比較，模型組腎臟AR活性顯著增強(P<0.01)，說明機體腎組織AR活性升高，PP激活，機體已經(jīng)發(fā)生糖代謝紊亂。EPST組、燈盞細辛組較模型組顯著降低(P<0.01)，其中EPST+燈盞細辛組腎臟AR活性顯著低于EPST組或燈盞細辛組(P<0.05)，說明燈盞細辛與EPST聯(lián)合給藥可顯著降低DN大鼠腎臟AR活性，抑制PP激活，且作用最顯著。見表4。

表4 各組大鼠腎臟AR活性比較(ng/mg)

3 討 論

本研究在實驗過程中，各干預(yù)組大鼠在注射STZ后，機體的FBG濃度和24 h UmAlb含量顯著升高且出現(xiàn)糖尿病“三多一少”典型癥狀，提示DN模型造模成功。燈盞細辛結(jié)合EPST給藥6周后，DN大鼠的整體狀態(tài)改善顯著，F(xiàn)BG顯著下降以及體重顯著升高，且其治療效果優(yōu)于燈盞細辛和EPST單獨給藥組，表明燈盞細辛聯(lián)合EPST對DN大鼠具有治療作用，而且作用強于單純的西藥或者中藥治療。

DN的主要表現(xiàn)是腎小球硬化和蛋白尿異常增多，當?shù)鞍啄虺掷m(xù)地不斷增多時，機體腎功能損害程度就不斷加重[12-13]。24 h UmAlb為診斷腎臟功能性衰竭的關(guān)鍵性指標[14]。Scr和BUN的濃度則與腎小球濾過能力密切相關(guān)，Scr和BUN濃度異常升高說明腎小球功能障礙，腎臟出現(xiàn)損傷[15-16]。本研究結(jié)果表明，以燈盞細辛結(jié)合EPST給藥6周后，對DN大鼠腎功能改善作用顯著強于模型組和任一單獨給藥組，其24 h UmAlb、Scr、BUN水平均與正常對照組最接近，且HE結(jié)果表明，燈盞細辛聯(lián)合EPST 灌胃6周后，腎臟病變程度最低，腎小球和腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)均趨向正常，提示以燈盞細辛結(jié)合EPST給藥能彼此協(xié)調(diào)，提高藥物的藥理作用，從而提高腎功能，對DN具有一定的治療效果。

葡萄糖代謝紊亂會促使PP、氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物等多種病理因素增強[17]。其中，抑制PP過度活化已成為了臨床上干預(yù)DN的研究熱點，而AR是催化該通道完成的主要限速酶，當血糖含量不斷增加時，會激活A(yù)R，并過度強化PP，從而使腎髓質(zhì)細胞內(nèi)的葡萄糖大量地轉(zhuǎn)化成山梨醇，而由于山梨醇的不斷增加，使細胞的滲透壓過大，發(fā)生水腫，進而出現(xiàn)大量的蛋白尿和腎小球肥大以及腎間質(zhì)纖維化[18]。本研究結(jié)果表明，燈盞細辛聯(lián)合EPST給藥后，腎組織AR活性顯著降低，其對AR活性的抑制作用優(yōu)于任一單獨給藥組，提示了燈盞細辛聯(lián)合EPST可能通過降低AR活性，抑制PP激活，延緩DN的進展。

在高糖環(huán)境中，PP過度活化不僅僅會導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，SOD、CAT等抗氧化酶活性下降，也導(dǎo)致NADPH大量消耗，造成抗氧化劑GSH減少，進而引起機體氧化和抗氧化系統(tǒng)紊亂[19]。在生物體中，SOD可以高效地清除機體內(nèi)產(chǎn)生的超氧自由基，其降低與DN的發(fā)生密切相關(guān)。而膜脂過氧化物終產(chǎn)物MDA為氧化應(yīng)激標志物，可降低血糖和尿糖水平[20]。此外，GSH是重要的細胞內(nèi)抗氧化劑。SOD、MDA和GSH通常用于評估機體的抗氧化水平[21]。所以，本研究在發(fā)現(xiàn)燈盞細辛聯(lián)合EPST可通過降低PP中AR活性保護DN腎臟的基礎(chǔ)上，進一步探索燈盞細辛聯(lián)合EPST是否能在抑制腎組織AR活性的同時，也協(xié)同抑制氧化應(yīng)激改善DN腎損傷的過程。研究結(jié)果表明，EPST+燈盞細辛組SOD、GSH水平較單獨給藥組顯著升高，而MDA則顯著降低。提示EPST+燈盞細辛組可在抑制腎組織AR的同時，可能也同樣抑制氧化應(yīng)激，且兩者聯(lián)合干預(yù)作用更強。本研究初步證實了燈盞細辛聯(lián)合EPST對DN的治療作用可能與其抑制PP活化并協(xié)同抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，但要明確具體機制，仍需進一步深入探究。

綜上所述，燈盞細辛和EPST聯(lián)合給藥對DN有干預(yù)作用，且優(yōu)于其他單獨給藥組，其可能與中藥與西藥發(fā)揮相輔相成的作用，并通過下調(diào)腎組織AR活性來抑制PP的激活，協(xié)同抑制腎組織氧化應(yīng)激增加有關(guān)。