熟地黃的大麻素2型受體激動(dòng)劑活性及對骨代謝的調(diào)控作用研究

胡思婧，練晨霞，張 奇，周 灝，史曉林，程 剛，張泉龍，趙琦明，張巧艷，趙 瑛，秦路平*

? 藥理與臨床 ?

熟地黃的大麻素2型受體激動(dòng)劑活性及對骨代謝的調(diào)控作用研究

胡思婧1，練晨霞1，張 奇1，周 灝1，史曉林2，程 剛1，張泉龍1，趙琦明1，張巧艷1，趙 瑛3*，秦路平1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2. 浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310000 3. 咸陽市中心醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

探究熟地黃的大麻素2型受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）激動(dòng)活性及其對骨代謝的調(diào)控作用。采用雙熒光素酶報(bào)告基因建立CB2R調(diào)節(jié)劑篩選體系；分別給予熟地黃提取物或CB2R選擇性激動(dòng)劑HU308或CB2R反向激動(dòng)劑AM630處理，采用CCK-8法測定成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖活性；采用磷酸苯二鈉法測定成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的活性；采用流式細(xì)胞儀測定成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期；采用ALP染色觀察成骨細(xì)胞分化；采用茜素紅染色觀察成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的形成；采用TRAP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)目；采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色鏡觀察破骨細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）環(huán)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)；采用Western blotting檢測CB2R及骨代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)。500 μg/mL熟地黃顯著升高HEK293-CB2R細(xì)胞CB2R表達(dá)（＜0.001），抑制forskolin刺激的HEK293-CB2R細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的產(chǎn)生，并且其對CB2R的激動(dòng)活性可被AM630逆轉(zhuǎn)（＜0.001）。500 μg/mL熟地黃顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖（＜0.001），升高ALP活性（＜0.001），促進(jìn)骨礦化結(jié)節(jié)形成，上調(diào)CB2R及骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001），抑制p38的表達(dá)（＜0.05）；抑制破骨細(xì)胞形成分化，降低TRAP活性（＜0.001），抑制F-actin環(huán)的形成，下調(diào)CB2R、p-p38和骨吸收相關(guān)蛋白的表達(dá)（＜0.05、0.001）；熟地黃對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用可被AM630逆轉(zhuǎn)（＜0.05、0.01、0.001）。熟地黃具有特異性的CB2R激動(dòng)活性，并可通過CB2R調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能。

熟地黃；大麻素2型受體激動(dòng)劑；雙熒光素酶報(bào)告基因；成骨細(xì)胞；破骨細(xì)胞；地黃苷D

大麻素2型受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）為G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，參與炎癥、纖維化、疼痛及骨代謝等多種生物活性的調(diào)節(jié)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CB2R激動(dòng)劑如HU308及其對映體HU433參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，可減緩去卵巢誘導(dǎo)的大鼠骨丟失[2]；CB2R激動(dòng)劑4-喹諾酮-3-羧酰胺（4-quinolone-3-carboxamides，4Q3C）可減緩膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠炎性細(xì)胞浸潤、破骨細(xì)胞數(shù)量及骨骼組織破壞，CB2R反向激動(dòng)劑AM630可以逆轉(zhuǎn)4Q3C對CIA小鼠骨骼的保護(hù)作用。因此，CB2R激動(dòng)劑具有潛在的調(diào)節(jié)骨代謝的作用，可用于骨丟失相關(guān)疾病的治療[3-5]。大麻中含有多種結(jié)構(gòu)類型的CB2R激動(dòng)劑，同時(shí)也對CB1R有激動(dòng)作用，可導(dǎo)致精神樣不良反應(yīng)[6]。因此，從大麻以外的藥用植物及中藥中發(fā)現(xiàn)無精神樣不良反應(yīng)的CB2R調(diào)節(jié)劑，并研究其對骨代謝的調(diào)控作用，對于闡明植物藥及中藥抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制、發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的抗骨質(zhì)疏松先導(dǎo)化合物具有重要意義。

熟地黃為玄參科植物地黃(Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.的干燥根的炮制品，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓等功效，用于遺精、腰膝酸軟、消渴、淋證等的治療[7]。現(xiàn)代研究表明熟地黃含有環(huán)烯醚萜類、紫羅蘭酮類、苯乙醇苷類、三萜類、黃酮類及脂肪酸脂類等多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和降血糖等多種生物活性[8-11]。本課題組前期建立了雙熒光素酶標(biāo)記的CB2R調(diào)節(jié)劑篩選模型，對熟地黃等16味中藥進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)熟地黃具有特異性的CB2R激動(dòng)活性。因此，本研究在系統(tǒng)探索熟地黃提取物的CB2R激動(dòng)劑活性的基礎(chǔ)上，觀察其基于CB2R激動(dòng)活性的對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的調(diào)控作用，為熟地黃抗骨質(zhì)疏松機(jī)制的深入研究及從中獲得以CB2R為靶點(diǎn)的抗骨質(zhì)疏松先導(dǎo)化合物提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級3日齡Wistar大鼠，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號SCXK（浙）2021-0361。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫（25±2）℃、濕度45%～50%的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理規(guī)定（批準(zhǔn)號109653-143166）。

1.2 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（目錄號TCM13）、人類胚胎腎細(xì)胞HEK293（目錄號GNHu43）購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.3 藥材

熟地黃（批號200501）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院秦路平教授鑒定為玄參科植物地黃(Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.的干燥根的炮制品。

1.4 藥品與試劑

總RNA提取試劑盒（批號DP419）購自天根生化科技有限公司；NovoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號E047-01B）、Novo Start SYBR qPCR Super MixturecDNA擴(kuò)增試劑盒（批號E096-01A）購自Novoprotein公司；pIRES2-EGFP、pGL4.29［luc2P/CRE/Hygro］、pRL-TK9由上海生工生物工程有限公司合成；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號8117161）購自美國Gibco公司；α-MEM培養(yǎng)基（批號TBD41061）購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（批號2369247）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；磷酸酶蛋白酶抑制劑（批號P1045）、Western及IP裂解液（批號P0013J）、5×上樣緩沖液（批號P0015）、脫脂奶粉（批號P0216）、Western一抗稀釋液（批號P0023A）、牛血清白蛋白（批號ST023）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）、30%丙烯酰胺溶液（批號ST003）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8，批號ST788）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8，批號ST768）、過硫酸銨（批號ST005）、TEMED（批號ST728）、DAPI染色液（批號061819191015）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（批號121820210416）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號121820210416）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL，批號0615612F1322）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Tris（批號A501492-0500）、甘氨酸（批號A502065-0500）購自上海生工生物科技有限公司；胎牛血清（批號10091-148）、腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin（批號S1612）、CB2R反向激動(dòng)劑AM630（批號GC10147）、青霉素-鏈霉素（批號15140-122）購自美國GLPBIO公司；人環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）檢測試劑盒（批號MM-0006H1）購自酶免生物有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號SKK0946）購自日本W(wǎng)ako公司；ECL顯色液（批號1925901）購自美國Millipore公司；CCK-8增殖檢測試劑盒（批號ab228554）、CB2R選擇性激動(dòng)劑HU308（批號ab254226）、成骨細(xì)胞特異基因Osterix兔多克隆抗體（批號ab22552）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）兔單克隆抗體（批號ab214050）、p38兔單克隆抗體（批號ab182453）、I型膠原蛋白（type I collagen，COL-1）兔單克隆抗體（批號ab138492）購自英國Abcam公司；基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）兔多克隆抗體（批號BA2202）購自武漢博士德生物工程有限公司；成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）兔多克隆抗體（批號12556S）、活化T細(xì)胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）兔單克隆抗體（批號8032S）、c-Fos兔單克隆抗體（批號2250S）、p-p38兔單克隆抗體（批號4511S）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號AF7021）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號S0001）購自美國Affinity公司。

1.5 儀器

RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；XP105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；智能數(shù)顯多功能油水浴（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；ORW1.5S-5E型微波動(dòng)態(tài)萃取設(shè)備（南京澳潤微波科技有限公司）；離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；雙垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀器（美國Bio-Rad公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tec公司）；熒光相差倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

成骨細(xì)胞提取自1日齡Wistar大鼠的顱骨，用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，HEK293細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右進(jìn)行傳代。

2.2 CB2R雙熒光素酶篩選體系的建立

使用Primer Express軟件（Application Biosystems）設(shè)計(jì)標(biāo)志基因的引物對，以基因作為內(nèi)參，合成Eco RI黏結(jié)端和Bam HI黏結(jié)端的單鏈ERE齊聚物，并對其進(jìn)行退火處理，形成雙鏈分子。Eco RI和Bam HI雙酶切分離雙鏈寡聚體，用T4DNA連接酶連接，克隆到pIRES2-EGFP載體上熒光素酶編碼區(qū)的上游。

將5×105個(gè)HEK293細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，然后用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染?；旌弦褐泻袡z測報(bào)告質(zhì)粒、編碼熒光素酶的對照報(bào)告質(zhì)粒和效應(yīng)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒比例pIRES2-EGFP-CB2R∶pGL4.29 [luc2P/CRE/Hygro]∶pRL-TK＝2 μg∶10 μg∶1 μg。轉(zhuǎn)染24 h后，更換為含G418（800 μg/mL）和潮霉素（400 μg/mL）的培養(yǎng)基，3 d更換1次培養(yǎng)基，2周左右得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。隨機(jī)選取96孔板中的60個(gè)孔，30個(gè)孔為一組，每孔接種5×103個(gè)HEK293細(xì)胞后，分別加入含有1 μmol/Lforskolin的培養(yǎng)基作為陽性對照，含0.1% DMSO空白培養(yǎng)液作為空白對照，孵育6 h后測量雙熒光素酶的發(fā)光值，以相對熒光素酶發(fā)光值即螢火蟲熒光素酶化學(xué)發(fā)光值/海腎熒光素酶化學(xué)發(fā)光值，表示細(xì)胞CB2R的表達(dá)水平。高通量篩選系統(tǒng)定量評價(jià)指標(biāo)包括信號本地比、信號窗、信噪比、信號本底變異系數(shù)、Z’因子等，以確保其高效、準(zhǔn)確地應(yīng)用于高通量數(shù)據(jù)收集。

2.3 熟地黃提取物的制備及其對CB2R的激動(dòng)活性分析

2.3.1 熟地黃提取物的制備 取5 g熟地黃粉末于250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL純水，加熱回流1 h，傾出上層清液，再加入50 mL純水加熱回流1 h，合并煎液后，用布氏漏斗濾過，將濾液減壓濃縮定容至10 mL，得到生藥量為0.1 g/mL的水提取物。采用《中國藥典》2020版一部中熟地黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下方法測定指標(biāo)性成分含量，熟地黃提取物中地黃苷D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。

2.3.2 熟地黃提取物對CB2R的激動(dòng)作用分析 將HEK293-CB2R細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，饑餓培養(yǎng)24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物處理6 h，測定雙熒光素酶發(fā)光值。

2.3.3 對CB2R激動(dòng)作用的特異性檢測 將HEK293-CB2R細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，饑餓培養(yǎng)24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物，同時(shí)不加或者添加1 μmol/LCB2R反向激動(dòng)劑AM630處理細(xì)胞6 h，測定雙熒光素酶化學(xué)發(fā)光值。

2.3.4 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的測定 按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，加入100 μL IP裂解液，裂解30 min，收集細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。

2.4 熟地黃提取物對成骨細(xì)胞的作用研究

2.4.1 CCK-8檢測細(xì)胞活性 將大鼠顱骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物和1 μmol/L HU308處理細(xì)胞；在考察CB2R依賴性時(shí)，用1 μmol/L CB2R反向激動(dòng)劑AM630預(yù)處理30 min，再用500 μg/mL的熟地黃提取物或1 μmol/L HU308處理細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)30 min，測定450 nm處的吸光度（）值。

2.4.2 ALP活性測定和染色 大鼠顱骨細(xì)胞按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理，培養(yǎng)7 d后，按照試劑盒說明書測定ALP活性。棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，加入ALP染色液，37 ℃染色30 min，棄去染液，蒸餾水沖洗3次，于顯微鏡下觀察拍照。

2.4.3 成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)及茜素紅ARS染色 大鼠顱骨細(xì)胞按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理，培養(yǎng)14 d后，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，于3.7%甲醛中固定10 min，用含40 mmol/L茜素紅的ARS染料（pH 4.2）染色10 min，于光學(xué)顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)和數(shù)目。

2.4.4 成骨細(xì)胞周期檢測 大鼠顱骨細(xì)胞按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理，培養(yǎng)7 d后，藥物處理后的成骨細(xì)胞離心5 min，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，將細(xì)胞重懸于1 mL細(xì)胞周期檢測試劑A和10 μL試劑B中，渦旋10 s，室溫孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。

2.5 熟地黃提取物對破骨細(xì)胞的作用研究

2.5.1 CCK-8檢測細(xì)胞活性 將RAW264.7細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物和1 μmol/L HU308處理細(xì)胞；在考察CB2R依賴性時(shí)，用1 μmol/L CB2R反向激動(dòng)劑AM630預(yù)處理30 min，再用500 μg/mL的熟地黃提取物和1 μmol/L HU308處理細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，按照CCK-8試劑盒說明書測定細(xì)胞活性。

2.5.2 TRAP活性測定和染色 將RAW264.7細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，用25 ng/mL的RANKL誘導(dǎo)，使其分化為破骨細(xì)胞，按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后，以硫代巴比妥鈉洗滌細(xì)胞2次，每孔加入10 μL 0.1% Triton X-100反應(yīng)10 min，加入TRAP反應(yīng)液100 μL，37 ℃孵育30 min，每孔加入100 μL 1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，測定405 nm處的值。用PBS洗滌細(xì)胞，每孔加50 μL 4%多聚甲醛固定20 min，然后加入50 μL 0.2% Triton X-100透化5 min，按TRAP染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察拍照。

2.5.3 破骨細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）環(huán)的免疫熒光染色 將5×104個(gè)RAW264.7細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿（直徑 35 mm）中，培養(yǎng)24 h，按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理5 d，用4%多聚甲醛固定30 min，用5 g/mL鬼筆環(huán)肽在37 ℃下染色40 min，用PBS洗滌，再用4′,6′-二氨基-2-苯基吲哚在室溫下染色10 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞的F-actin環(huán)結(jié)構(gòu)。

2.6 Western blotting檢測CB2R、成骨相關(guān)蛋白和破骨相關(guān)蛋白表達(dá)

按“2.4.1”項(xiàng)和“2.5.1”項(xiàng)下方法處理后，提取成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后，分別加入CB2R抗體（1∶500）、GAPDH抗體（1∶1000）、成骨相關(guān)蛋白抗體（1∶1000）和破骨相關(guān)蛋白抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入相應(yīng)二抗（1∶1000），37 ℃孵育1 h，用MONAD QuickChemi 5100化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析條帶。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 熟地黃提取物的CB2R激動(dòng)活性分析

本研究建立了一種基于雙熒光素酶的高通量篩選模型來檢測CB2R和熟地黃提取物之間的相互作用。應(yīng)用構(gòu)建的HEK293-CB2R細(xì)胞體系評價(jià)其篩選CB2R調(diào)節(jié)劑的性能，發(fā)現(xiàn)信號本底值為4.8，信噪比為31.1，表明本底水平對高通量篩選的結(jié)果無顯著影響。forskolin陽性對照組和DMSO空白對照信號平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為（63.3±4.4）%和（13.1±1.6）%，信號窗為50.2%，信號本底變異系數(shù)分別為7.0%和7.6%，Z’因子為0.64，表明本模型性能較好，具有較高的可行性和可靠性。

為了驗(yàn)證該系統(tǒng)在篩選CB2R激動(dòng)劑方面的可行性，檢測了CB2R激動(dòng)劑HU308處理的HEK293-CB2R細(xì)胞的相對熒光素酶活性，如圖1-A所示，與只轉(zhuǎn)染空載體的HEK293細(xì)胞相比，HU308顯著增加了相對熒光素酶的活性（＜0.001），1 μmol/L HU308作用6 h后相對熒光素酶發(fā)光值最高。本課題組前期利用雙熒光素酶篩選模型對16種中藥提取物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)熟地黃提取物的CB2R激動(dòng)活性可能具有特異性。如圖1-B所示，100、250、500、750、1000 μg/mL熟地黃提取物作用于HEK293-CB2R細(xì)胞6 h后，以500 μg/mL熟地黃提取物作用效果最明顯。因此，后續(xù)研究中，用500 μg/mL熟地黃提取物觀察其CB2R激動(dòng)活性及對骨代謝的調(diào)控作用。如圖1-C所示，1 μmol/L HU308和500 μg/mL熟地黃提取物均能顯著上調(diào)HEK293-CB2R細(xì)胞CB2R蛋白表達(dá)（＜0.001）。

A-HU308對HEK293-CB2R細(xì)胞雙熒光素酶活性分析 B-熟地黃提取物對HEK293-CB2R細(xì)胞CB2R雙熒光素酶活性的影響 C-熟地黃提取物對HEK293-CB2R細(xì)胞CB2R蛋白表達(dá)的影響 D-AM630對HU308和熟地黃提取物在HEK293-CB2R細(xì)胞中CB2R激動(dòng)活性的逆轉(zhuǎn)作用 E-熟地黃提取物對HEK293-CB2R細(xì)胞cAMP的抑制作用 與對照組比較：###P＜0.001；與無AM630的同組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

進(jìn)一步用CB2R反向激動(dòng)劑AM630確證熟地黃提取物CB2R激動(dòng)活性的特異性，如圖1-D所示，用AM630預(yù)先處理HEK293-CB2R細(xì)胞30 min，可以逆轉(zhuǎn)HU308和熟地黃提取物對HEK293-CB2R細(xì)胞CB2R的激動(dòng)作用（＜0.001），表明熟地黃具有特異性的CB2R激動(dòng)活性。CB2R通過與G蛋白偶聯(lián)抑制細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）的活性，抑制細(xì)胞cAMP的產(chǎn)生。本研究用forskolin刺激HEK293- CB2R細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增加，再用CB2R激動(dòng)劑HU308或熟地黃提取物處理細(xì)胞，測定細(xì)胞內(nèi)cAMP含量。如圖1-E所示，HU308和熟地黃提取物均能夠抑制forskolin刺激的HEK293-CB2R細(xì)胞中cAMP的產(chǎn)生，其半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值分別為60.57 nmol/mL和（482.3±59.9）μg/mL。

3.2 熟地黃以CB2R為靶點(diǎn)促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成作用

如圖2所示，CB2R選擇性激動(dòng)劑HU308和熟地黃提取物可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、ALP活性和骨礦化結(jié)節(jié)的形成（＜0.001）。熟地黃提取物作用成骨細(xì)胞后，G1期細(xì)胞比例降低，S期及G2期細(xì)胞比例增加，表明熟地黃提取物可能通過驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期從G1期過渡到S期及G2期來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖（圖2-D）。CB2R反向激動(dòng)劑AM630能降低熟地黃提取物對成骨細(xì)胞骨形成的促進(jìn)作用（＜0.01、0.001），逆轉(zhuǎn)熟地黃提取物對成骨細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用，表明熟地黃提取物在一定程度上以CB2R相關(guān)的方式發(fā)揮增強(qiáng)成骨細(xì)胞的骨形成作用。

A-成骨細(xì)胞增殖 B-成骨細(xì)胞ALP活性 C-成骨細(xì)胞ALP染色 D-成骨細(xì)胞細(xì)胞周期分析 E-成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色 a-對照組 b-HU308組 c-HU308＋AM630組 d-熟地黃提取物組 e-熟地黃提取物＋AM630組 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與無AM630的同組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 熟地黃提取物對成骨細(xì)胞CB2R及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，熟地黃提取物和HU308顯著增加成骨細(xì)胞CB2R的表達(dá)（＜0.01、0.001），AM630預(yù)處理可以降低其對成骨細(xì)胞CB2R蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（＜0.01、0.001）。熟地黃提取物和HU308可顯著上調(diào)成骨細(xì)胞骨形成關(guān)鍵蛋白COL-1、OPN、Runx2和Osterix的表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001），AM630預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)熟地黃提取物和HU308對成骨細(xì)胞關(guān)鍵蛋白表達(dá)的上調(diào)作用（＜0.05、0.01、0.001）。CB2R與p38/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路聯(lián)系密切，熟地黃提取物和HU308可顯著降低成骨細(xì)胞中p38的表達(dá)（＜0.05），AM630預(yù)處理后可以逆轉(zhuǎn)熟地黃提取物和HU308對成骨細(xì)胞p38表達(dá)的影響（＜0.05、0.01）。

圖3 熟地黃提取物對成骨細(xì)胞CB2R及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.4 熟地黃提取物以CB2R為靶點(diǎn)抑制破骨細(xì)胞形成和分化的作用

如圖4-A～C所示，HU308和熟地黃提取物作用72 h對RAW264.7細(xì)胞的活性沒有顯著的影響，但可顯著抑制由RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中TRAP酶的活性（＜0.001），減少TRAP染色陽性破骨細(xì)胞的數(shù)目。

F-actin環(huán)是破骨細(xì)胞中形成的微管和微絲結(jié)構(gòu)，在骨礦物質(zhì)基質(zhì)的密封區(qū)形成和骨吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如圖4-D所示，HU308和熟地黃提取物處理RAW264.7細(xì)胞分化的破骨細(xì)胞5 d后，熒光顯微鏡下可見破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的厚度變薄，結(jié)構(gòu)不完整。CB2R反向激動(dòng)劑AM630可顯著降低熟地黃對破骨細(xì)胞TRAP活性及其形成分化的抑制作用（＜0.001），逆轉(zhuǎn)其對破骨細(xì)胞F-actin環(huán)形成的抑制作用。

A-RAW264.7細(xì)胞的增殖 B-破骨細(xì)胞TRAP活性 C-破骨細(xì)胞TRAP酶染色（紅色箭頭表示成熟的破骨細(xì)胞） D-破骨細(xì)胞F-actin環(huán)染色（紅色箭頭表示破骨細(xì)胞的F-actin環(huán)）

3.5 熟地黃提取物對破骨細(xì)胞CB2R及骨吸收相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，熟地黃提取物可顯著增加破骨細(xì)胞CB2R的表達(dá)（＜0.05），AM630能夠逆轉(zhuǎn)其對破骨細(xì)胞CB2R表達(dá)的激動(dòng)作用（＜0.001）。NFATc1和c-Fos是破骨細(xì)胞形成分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，MMP9是破骨細(xì)胞分泌的降解骨基質(zhì)的關(guān)鍵蛋白酶。熟地黃提取物顯著抑制破骨細(xì)胞MMP9、NFATc1和c-Fos的表達(dá)及p38的磷酸化水平（＜0.05、0.001），AM630能夠逆轉(zhuǎn)其對破骨細(xì)胞內(nèi)NFATc1、MMP9、c-Fos及p-p38表達(dá)的抑制作用（＜0.05、0.01）。

圖5 熟地黃提取物對破骨細(xì)胞CB2R及骨吸收相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

本研究應(yīng)用穩(wěn)定、可靠的雙熒光素酶報(bào)告基因的CB2R調(diào)節(jié)劑篩選體系分析了熟地黃提取物對CB2R的特異性激動(dòng)活性及其對成骨和破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)熟地黃對CB2R具有特異的激動(dòng)作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、ALP活性、骨礦化結(jié)節(jié)形成及骨形成關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的形成分化、TRAP活性及骨吸收關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，并且熟地黃對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用可被CB2R反向激動(dòng)劑AM630逆轉(zhuǎn)，表明熟地黃可能以CB2R為靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控骨代謝的作用。

本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)染CB2R的HEK293細(xì)胞篩選具有CB2R激動(dòng)活性的中藥，并通過在僅轉(zhuǎn)染EGFP的HEK293細(xì)胞及應(yīng)用CB2R反向激動(dòng)劑明確熟地黃提取物對CB2R的激動(dòng)活性的特異性。同時(shí)，考慮到激活CB2R可抑制AC活性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平降低，通過觀察熟地黃提取物對轉(zhuǎn)染CB2R的HEK293細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其抑制細(xì)胞內(nèi)cAMP的IC50值為（482.3±59.9）μg/mL，進(jìn)一步確證了熟地黃的CB2R激動(dòng)活性。

成骨細(xì)胞是體內(nèi)參與骨形成的功能細(xì)胞，可表達(dá)CB2R。CB2R選擇性激動(dòng)劑如HU308等也表現(xiàn)出確切的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，CB2R激動(dòng)劑β-石竹烯呈劑量相關(guān)性顯著增加骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的礦化，抑制骨髓細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化[13]。CB2R部分激動(dòng)劑厚樸酚能夠保護(hù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞免受抗霉素A的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、ALP活性及骨基質(zhì)礦化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)熟地黃提取物可通過激活CB2R調(diào)控成骨細(xì)胞CB2R/p38通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、礦化及骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)，CB2R反向激動(dòng)劑AM630可以逆轉(zhuǎn)熟地黃提取物對成骨細(xì)胞的作用，表明熟地黃提取物通過激活CB2R抑制p38信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與礦化和骨形成作用。

破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收活性的功能細(xì)胞，CB2R激動(dòng)劑直接作用于破骨細(xì)胞，抑制其形成、分化和骨吸收作用。CB2R部分激動(dòng)劑甲基厚樸酚可顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的多核破骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的形成，抑制破骨細(xì)胞c-Fos、NFATc1及p38相關(guān)通路的激活[15]；CB2R激動(dòng)劑樺木酸顯著抑制破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的形成，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞性骨吸收[16]。本研究發(fā)現(xiàn)熟地黃提取物能夠減少RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的數(shù)量、破骨細(xì)胞的分化及F-actin環(huán)的形成，降低破骨細(xì)胞特異性蛋白MMP9、NFATc1及c-Fos的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞CB2R的表達(dá)和p38的磷酸化，CB2R反向激動(dòng)劑AM630可逆轉(zhuǎn)熟地黃提取物對破骨細(xì)胞的作用，表明熟地黃提取物通過激活CB2R，干預(yù)p38相關(guān)通路，降低p38的磷酸化水平，從而抑制破骨細(xì)胞的形成與分化和骨吸收活性。

熟地黃為抗骨質(zhì)疏松中藥方劑中使用頻率最高的中藥，含有環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷、紫羅蘭苷及脂肪酸類成分，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、糖尿病性骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥均有良好的防治作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，熟地黃中環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇通過蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）途徑促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，在顱骨缺損的去卵巢模型大鼠中可促進(jìn)骨骼再生和血管形成[18-19]；苯丙素苷類成分毛蕊花糖苷能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收，并可以減輕去卵巢誘導(dǎo)的骨丟失[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，熟地黃提取物可通過CB2R調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能，表明熟地黃通過多成分、多靶點(diǎn)和多途徑發(fā)揮調(diào)控骨代謝的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Agonistic activity ofon cannabinoid receptor 2 and its regulatory effects on bone metabolism

HU Si-jing1, LIAN Chen-xia1, ZHANG Qi1, ZHOU Hao1, SHI Xiao-lin2, CHENG Gang1, ZHANG Quan-long1, ZHAO Qi-ming1, ZHANG Qiao-yan1, ZHAO Ying3, QIN Lu-ping1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Zhejiang Xinhua Hospital, Hangzhou 310000, China 3. Xianyang Central Hospital, Xianyang 712000, China

To investigate the agonistic activity of Shudihuang (, RRP) on cannabinoid receptor 2 (CB2R) and its regulatory effects on bone metabolism.The CB2R regulator screening system was established by using double luciferase reporter gene. After treatment with RRP extract or CB2R selective agonist HU308 or CB2R inverse agonist AM630, the proliferation of osteoblasts and osteoclasts was detected by CCK-8. The activities of alkaline phosphatase (ALP) in osteoblasts and tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) in osteoclasts were determined by disodium phenylphosphate method. The cell cycle of osteoblasts was determined by flow cytometry. The osteoblastic differentiation was observed by ALP staining. Alizarin red staining was used to observe the formation of bone mineralized nodules in osteoblasts. The number of osteoclasts was observed by TRAP staining. The structure and morphology of F-actin ring in osteoclasts were stained with rhodamine-phalloidin and observed with laser confocal microscopy. The expressions of CB2R and related proteins with bone metabolism were detected by Western blotting.500 μg/mL RRP significantly increased CB2R expression in HEK293-CB2R cells (< 0.001), inhibited the production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in HEK293-CB2R cells stimulated by forskolin, and its agonistic activity on CB2R could be reversed by AM630 (< 0.001). 500 μg/mL RRP significantly promoted the proliferation of osteoblasts (< 0.001), increased the activity of ALP (< 0.001), promoted the formation of bone mineralized nodules, and up-regulated the expressions of CB2R and bone formation-related proteins (< 0.05, 0.01, 0.001), inhibited the expression of p38 (< 0.05); 500 μg/mL RRP inhibited the formation and differentiation of osteoclasts, decreased TRAP activity (< 0.001), inhibited the formation of F-actin ring, down-regulated CB2R, p-p38 and bone resorption-related proteins expressions (< 0.05, 0.001); The effect of RRP on osteoblasts and osteoclasts could be reversed by AM630 (< 0.05, 0.01, 0.001).RRP has specific CB2R agonistic activity, and can regulate the functions of osteoblasts and osteoclasts through CB2R.

; cannabinoid receptor 2 agonist; double luciferase reporter gene; osteoblast; osteoclast; rehmannioside D

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6481 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.020

2022-07-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973534）

胡思婧，女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞旨捌渥饔醚芯俊-mail: hsj960321@163.com

趙 瑛，主管護(hù)師，主要從事臨床護(hù)理工作。E-mail: zhao13892919525@163.com

秦路平，博士，教授，主要從事中藥資源及品質(zhì)評價(jià)研究。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]