崔芙蓉，王升厚，李夢(mèng)雪，柳葉飛，徐方旭*

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng) 110034）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）是一種藥食同源真菌，含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸及蟲(chóng)草多糖等活性成分[1-2]。在蛹蟲(chóng)草栽培過(guò)程中，白毛病危害較為嚴(yán)重，極易造成蛹蟲(chóng)草子實(shí)體倒伏和矮小畸形。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是人工合成或天然提取的具有激素生理活性的化合物，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，并取得了顯著效果。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛹蟲(chóng)草栽培過(guò)程中感染的病原真菌進(jìn)行分離純化及鑒定，通過(guò)侵染實(shí)驗(yàn)探究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GN-01對(duì)蛹蟲(chóng)草寄生性病原真菌的誘導(dǎo)抗病作用，旨在為白毛病的控制及預(yù)防提供理論依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

不同區(qū)域發(fā)病的蛹蟲(chóng)草、蛹蟲(chóng)草菌株P(guān)T07（沈陽(yáng)師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所提供）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（GN-01）、真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）培養(yǎng)基[4]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原真菌分離純化

刮取發(fā)病蛹蟲(chóng)草上的病原真菌菌絲，采用劃線法將其接種于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d；待有菌落形成時(shí)，挑取單個(gè)菌落，用點(diǎn)接法將其接種至PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直到純化出單一菌落，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 病原真菌形態(tài)鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)至生長(zhǎng)出完整的菌落，觀察菌落形態(tài)特征。利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA 斜面上，樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進(jìn)行真菌基因組DNA提取、真菌基因組PCR 擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物的回收及DNA序列的對(duì)比分析。將所得序列文件與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 病原真菌侵染蛹蟲(chóng)草子實(shí)體

GN-01 稀釋濃度（均為體積濃度）分別為1∶50（2 號(hào)）、1∶100（3 號(hào)）、1∶200（4 號(hào)）、1∶500（5號(hào)）、1∶1 000（6 號(hào)）、1∶3 000（7 號(hào)）、1∶3 500（8 號(hào)）和1∶4 000（9 號(hào)），對(duì)照組（1 號(hào)）為清水。分別在蛹蟲(chóng)草栽培培養(yǎng)基中和生長(zhǎng)過(guò)程中加入不同稀釋濃度的GN-01，并按照蛹蟲(chóng)草常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

將分離所得病原真菌接種于PDB 培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)7 d，將菌體打碎，用無(wú)菌水稀釋100 倍備用。選擇生長(zhǎng)到第35 d 的、2 種不同培養(yǎng)方式的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行病原菌侵染實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組補(bǔ)等量清水，在20 ℃培養(yǎng)55 d后測(cè)定防御酶活性及發(fā)病率。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 SOD和POD酶活性測(cè)定

SOD 和POD 酶活性測(cè)定的藥品配制及實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行。

1.3.2 發(fā)病率測(cè)定

按照公式（1）計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組別蛹蟲(chóng)草總發(fā)病率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌形態(tài)鑒定

分離所得病原真菌分別命名為BYJ1 和BYJ2。如圖1 所示，2 種病原真菌在PDA 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3～7 d后，菌絲部分為白色，不透明，菌絲致密，邊緣規(guī)則；菌落顏色正反一致，生長(zhǎng)速度較慢；菌絲分枝，有隔；有明顯成熟脫落的孢子且孢子較小，孢子直徑為3.8～4.5 μm。BYJ1 菌株菌絲寬度為2.0～5.0 μm，BYJ2菌株菌絲寬度為5.0～6.3 μm。

圖1 白毛病病原菌菌落形態(tài)

2.2 病原真菌的分子鑒定

將病原菌BYJ1 和BYJ2 所得序列進(jìn)行拼接后與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。由圖2 可知，BYJ1 為日耳曼曲霉（Aspergillus germanicus），BYJ2 為焦曲霉（Aspergillus ustus）。

圖2 白毛病菌株鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 GN-01對(duì)蛹蟲(chóng)草抗病能力的影響

2.3.1 GN-01對(duì)蛹蟲(chóng)草防御氧化酶活性的影響

隨著在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加GN-01 稀釋倍數(shù)的增大，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的SOD 和POD酶活性呈先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)，在稀釋倍數(shù)為3 000時(shí)（7 號(hào)樣品）防御氧化酶活性最高，說(shuō)明蛹蟲(chóng)草子實(shí)體在受到病原真菌侵害時(shí)，適當(dāng)濃度的GN-01 可誘導(dǎo)SOD 和POD 酶活性明顯上升，以抵抗病原真菌侵害（見(jiàn)圖3、圖4）。

圖3 不同濃度GN-01對(duì)蛹蟲(chóng)草SOD活性的影響

圖4 不同濃度GN-01對(duì)蛹蟲(chóng)草POD活性的影響

2.3.2 GN-01對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)病率的影響

由表1 可知，在培養(yǎng)基中添加或在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加稀釋50～4 000 倍的GN-01，蛹蟲(chóng)草白毛病發(fā)病率呈逐漸降低趨勢(shì)。這說(shuō)明蛹蟲(chóng)草受到病原真菌侵害時(shí)，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加稀釋50～4 000 倍的GN-01 可顯著減輕病原真菌的侵害，提高蛹蟲(chóng)草的抗病性。

表1 不同GN-01濃度下蛹蟲(chóng)草白毛病發(fā)病率

2.4 侵染實(shí)驗(yàn)

根據(jù)前述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇稀釋3 000 倍的GN-01 進(jìn)行病原真菌侵染抗性實(shí)驗(yàn)。如圖5 所示，與對(duì)照組相比，在栽培培養(yǎng)基中添加和在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加稀釋3 000 倍的GN-01，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的發(fā)病程度均呈著減輕，與前述的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖5 不同處理方式蛹蟲(chóng)草白毛病發(fā)病情況比較

3 討論與結(jié)論

植物誘導(dǎo)抗病性被認(rèn)為是植物保護(hù)技術(shù)的新途徑。蛹蟲(chóng)草自身具有一套完整的防御體系，生物或非生物脅迫都可刺激這種防御反應(yīng)，因此通常將防御酶活性變化作為衡量植株防御能力的重要指標(biāo)。SOD可清除自由基，延緩植物衰老；POD 可減少活性氧積累，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)完整。本實(shí)驗(yàn)以在蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基添加GN-01 和在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加GN-012 種實(shí)驗(yàn)所得的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體為原材料，對(duì)蛹蟲(chóng)草的防御酶活性進(jìn)行測(cè)定，以探究GN-01 對(duì)蛹蟲(chóng)草的誘導(dǎo)抗病性作用。結(jié)果表明，當(dāng)蛹蟲(chóng)草受到病原真菌侵害時(shí)，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加稀釋50～3 000 倍的GN-01 時(shí)，SOD 和POD 酶活性呈上升趨勢(shì)，且在GN-01稀釋倍數(shù)為3 000時(shí)，SOD 和POD 酶活性達(dá)到峰值，能有效減輕病原真菌的侵害，提升蛹蟲(chóng)草的抗病性，侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

將植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為病原菌抑制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)有較好的應(yīng)用前景，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長(zhǎng)過(guò)程中補(bǔ)加稀釋3 000 倍的GN-01，都可提高蛹蟲(chóng)草相關(guān)防御酶活性，有效防治蛹蟲(chóng)草寄生性病原真菌病害的發(fā)生。目前，蛹蟲(chóng)草寄生性病原真菌研究體系還不完整，大部分的致病機(jī)制有待深入研究，未來(lái)應(yīng)著重研究病原菌致病機(jī)制和篩選蛹蟲(chóng)草優(yōu)良抗病菌株。