趙 業(yè),卜少陽,王 涵,崔 皓,郝志軍,許潤潤,李詩浩,程亞秋,馬 恬

(1.煙臺大學(xué)海洋學(xué)院,山東 煙臺264005;2.煙臺海關(guān)技術(shù)中心,山東 煙臺265699)

甜菜堿(Betaine)化學(xué)名為三甲基甘氨酸,系一種季胺型生物堿,廣泛存在于動植物體內(nèi)。甜菜堿含有三個有效的活性甲基,為動物機(jī)體內(nèi)最重要的甲基供體[1],可參與蛋白質(zhì)和脂肪代謝,具有促進(jìn)生長、改善酮體組成等功效[2-4]。同時,甜菜堿具有兩性兩極離子特征,是植物、細(xì)菌、動物體內(nèi)重要的滲透壓調(diào)節(jié)劑,能提高機(jī)體細(xì)胞應(yīng)對干旱、高溫、高鹽及高滲透壓等不良環(huán)境的耐受性,有效調(diào)節(jié)組織滲透壓和離子平衡,穩(wěn)定生物酶活性。研究表明,哺乳動物在細(xì)胞低滲腫脹和高滲萎縮時會釋放或累積甜菜堿以保持細(xì)胞體積穩(wěn)定[5-6]。魚類研究則表明,甜菜堿的存在可以使大西洋鮭(Atlanticsalmon)和歐鱒(Salvelinusconfluentus)改變肌肉水分含量從而適應(yīng)所處水體鹽度的變化,有利于其保持電解質(zhì)和滲透壓的平衡,提高成活率[7]。

生物體內(nèi)的甜菜堿主要由甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Betaine homocysteine methyltransferase, BHMT)催化分解。BHMT是一種巰基甲基轉(zhuǎn)移酶(含Zn2+),可催化甜菜堿和高半胱氨酸生成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸,進(jìn)而有效降低高半胱氨酸的濃度,而相關(guān)研究表明在高水平的高半胱氨酸濃度是誘導(dǎo)引發(fā)機(jī)體的心腦血管疾病的獨(dú)立危險因素[8]。同時,由于BHMT催化后的高半胱氨酸再甲基化無特殊輔酶依賴性,且反應(yīng)產(chǎn)物可促進(jìn)甲硫氨酸合成酶甲基化途徑的進(jìn)行,因此對于有效實(shí)現(xiàn)機(jī)體甲硫氨酸的循環(huán)利用尤為重要[9]。目前,已有研究報道多種水生生物bhmt基因序列,且主要集中在魚類中,如牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)、黃鱸(Percaflavescens)、金頭鯛(Sparusaurata)、斑馬魚(Daniorerio)[10],而在海洋無脊椎動物中該基因報道較少。

刺參(Apostichopusjaponicus),位列“海八珍”之首,因其具有較高的營養(yǎng)和藥用價值,目前已成為中國北方重要的海水養(yǎng)殖品種。刺參是狹鹽性動物,研究表明鹽度變化對刺參的存活生長、呼吸排泄、能量收支和免疫調(diào)控等均具有重要影響[11-14]。目前國內(nèi)外對于刺參養(yǎng)殖多為近海池塘養(yǎng)殖且養(yǎng)殖區(qū)域多位于潮間帶,養(yǎng)殖區(qū)池塘的海水鹽度極易受到雨季、潮汐等氣候因素從而發(fā)生急劇變化,因而鹽度已成為對刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成較大威脅甚至引發(fā)重大經(jīng)濟(jì)損失的重要因素。本實(shí)驗(yàn)主要利用RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆獲取了刺參bhmt1基因的全長cDNA,分析了其序列結(jié)構(gòu)特征;利用qRT-PCR技術(shù)分析了刺參bhmt1基因在組織中和不同低鹽脅迫下的表達(dá)模式,為進(jìn)一步探究bhmt1基因功能及揭示刺參應(yīng)對鹽度變化導(dǎo)致的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐,以期豐富刺參的生理生態(tài)學(xué)理論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)幼參于2021年3月5日購自山東安源科技有限公司,平均個體質(zhì)量3.6±0.26 g,平均體長4.3±0.6 cm。脅迫實(shí)驗(yàn)前均用520 cm×700 cm×400 cm 的塑料牛筋箱暫養(yǎng)7 d(共4箱,每箱100頭);養(yǎng)殖海水取自煙臺近海,經(jīng)沙濾沉淀除去雜質(zhì),pH為7.9±0.1,溶氧量為7.63 mg/L,水溫18±1 ℃,鹽度32,每次換水保證其曝氣48 h以上,充氧泵連續(xù)充氣;每日17:00全量更換海水,清理排泄物,并按體重2%比例投餌,保持自然光周期。選取健康刺參幼參進(jìn)行解剖,分別取腸道、呼吸樹、肌肉、體壁、體腔液等組織液氮速凍后于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。

選取養(yǎng)殖于天然海水(其鹽度為32,無低鹽脅迫)的刺參視作對照組,選擇鹽度為16和24的海水用以脅迫養(yǎng)殖刺參作為低鹽試驗(yàn)組。低鹽脅迫的海水為自來水經(jīng)曝氣放置24 h后與天然海水按照比例混合從而配制成鹽度分別為24和16的實(shí)驗(yàn)用水。將刺參幼參隨機(jī)分為五組,分別放入天然海水、鹽度為24和16的海水中進(jìn)行試驗(yàn)(試驗(yàn)用520 cm×500 cm×400 cm 塑料牛津箱,天然海水1箱,鹽度為24和16的各2箱,每箱放入刺參幼參60頭),并分別在試驗(yàn)開始后0、24、48、72和96 h進(jìn)行取樣,每個時間點(diǎn)每組隨機(jī)取10頭幼參,分別取幼參腸道和呼吸樹組織,并將樣本保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 總RNA提取

采用液氮研磨組織并利用碧云天RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒提取刺參組織總RNA,通過瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)檢測所提取的總RNA完整性、通過微量紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度并測定核酸濃度。提取合格的RNA置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 全長cDNA克隆

根據(jù)前期刺參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得的bhmt1基因部分序列進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)(表1)[15],利用SMART RACE cDNA末端擴(kuò)增試劑盒(Clontech, USA)對bhmt1基因分別進(jìn)行3′cDNA和5′cDNA全長克隆PCR,按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。利用OMEGA公司的膠回收試劑盒回收獲得膠塊中的DNA,連接至載體pMD19-T vector上,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到商品化感受態(tài)細(xì)胞JM109 (Takara, Japan)中,復(fù)蘇1 h后涂在含氨芐的LB平板上過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆于SOC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。菌液PCR驗(yàn)證所獲DNA條帶大小后,送華大基因測序公司進(jìn)行DNA序列測序[16]。

表1 引物序列

1.4 生物信息分析

利用DNAStar軟件對所獲得的序列進(jìn)行拼接,獲得完整bhmt1cDNA全長序列,并分析基因的開放閱讀框和氨基酸組成。利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對所獲取的bhmt1cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析。利用 NetNGlyc1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 和NetPhos3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 查找糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。利用SMART version 4.0工具(http://www.smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域,并用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 和SWISS-MODEL(http:swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)空間二級和三級結(jié)構(gòu)。利用Clustal W程序和MEGA 5.0程序進(jìn)行bhmt1基因的多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.5 bhmt1基因表達(dá)模式分析

采用 RT-qPCR 技術(shù),用 CFX96 Real Time PCR System (Bio-Rad,美國) 檢測刺參bhmt1基因在腸道、呼吸樹、肌肉、體壁、體腔液組織中 mRNA水平的組織表達(dá)模式。以刺參組織RNA為材料(RNA提取方法同上),利用PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time (Takara,Japan)試劑盒反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA,經(jīng)適當(dāng)稀釋后作為qRT-PCR反應(yīng)的模板。qRT-PCR反應(yīng)以actin基因作為內(nèi)參基因,bhmt1所用引物是在基因開放閱讀框序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)(表1)。反應(yīng)條件為:(1)95 ℃預(yù)變性5 s;(2)95 ℃變性10 s,60 ℃復(fù)性20 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán);(3)添加溶解曲線,以檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是否單一。每個反應(yīng)設(shè)置三次重復(fù),利用2-ΔΔCT算法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.6 低鹽脅迫下bhmt1基因時空表達(dá)特征

利用qRT-PCR技術(shù)分析bhmt1基因在各低鹽鹽度試驗(yàn)處理組24 h、48 h、72 h和96 h脅迫后各組織(腸道和呼吸樹)的表達(dá)水平,具體方法同1.5。每組樣本量為4頭,利用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析對照組和脅迫組組間的差異顯著性,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析鹽度16與24組間基因表達(dá)差異,視P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 刺參bhmt1基因的cDNA克隆及序列分析

刺參bhmt1基因cDNA全長為2328 bp,其中包含160 bp的5′UTR區(qū)域和917 bp的3′UTR區(qū)域。該基因的開放閱讀框長度為1251 bp,161～163 bp處為起始密碼子ATG,1409～1411 bp處為終止密碼子TAA,共編碼416個氨基酸。根據(jù)軟件預(yù)測其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為45.95 kU,等電點(diǎn)為5.64(圖1)。不含糖基化位點(diǎn),含有8個磷酸化位點(diǎn),分別為Y34、S64、S321、S326、S354、T385、S386、S405。利用SMART在線工具分析刺參bhmt1基因的功能結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明該基因序列包括三個可能作為底物結(jié)合位點(diǎn)的鋅指結(jié)構(gòu)序列:(1)DGG(AA positions:22—24),(2)T(AA positions:41),(3)E(AA positions:155)。此外,分析表明在人bhmt1基因中發(fā)現(xiàn)的與Zn2+結(jié)合的3個半胱氨酸殘基位點(diǎn)同樣在刺參bhmt1基因存在(AA positions:213,295,296黃色圈標(biāo)注),其中后2個半胱氨酸殘基所在的基序結(jié)構(gòu)GGCCGXXPXHI (AA positions 293～303綠色框標(biāo)注)是依賴Zn2+的硫醇和硒醇甲基轉(zhuǎn)移酶家族的典型結(jié)構(gòu)。該基因全長cDNA序列已經(jīng)提交NCBI網(wǎng)站,獲得注冊號為GenBank Accession No. MG734909。使用SWISSmodel 軟件對BHMT1氨基酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果表明BHMT1蛋白存在43.27% α 螺旋、 9.38% β 折疊、47.36%無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(圖2(a)),三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖2(b)和圖2(c)所示。

紅色框標(biāo)注為起始密碼子和終止密碼子，黃色圈標(biāo)注為與Zn2+結(jié)合的半胱氨酸殘基，綠色框標(biāo)注為典型GGCCGXXPXHI基序結(jié)構(gòu)。

2.2 序列同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將刺參蛋白BHMT1序列在NCBI中的Blast同源比對分析發(fā)現(xiàn),其與非洲爪蟾Xenopuslaevis(NP-001088416.1)的BHMT1序列同源性相對較高,相似度為68.17%,與智人Homosapiens(NP-001704.2)、小鼠Musmusculus(NP-057877.1)、牙鲆Paralichthysolivaceus(ABM88795.1)、紫海膽Strongylocentrotuspurpuratus(XP-781040.1)囊舌蟲Saccoglossuskowalevskii(XP-002737404.2)的BHMT1序列相似度分別為66.17%,66.50%,66.17%,66.67%,和66.08%(圖3)。值得一提的是,上述物種中BHMT1序列均含有三個可能作為底物結(jié)合位點(diǎn)的鋅指結(jié)構(gòu)序列和Zn2+結(jié)合的3個半胱氨酸殘基,說明上述位點(diǎn)保守性很強(qiáng)。

以刺參和從NCBI獲得的其他物種BHMT1蛋白序列為基礎(chǔ),利用NJ(neighbor-joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明,進(jìn)化樹分為兩大支,脊椎動物聚為一支,無脊椎動物中的紫海膽和囊舌蟲單獨(dú)聚為一支。刺參BHMT1介于兩支之間,親緣關(guān)系與脊椎動物相對更近,但相比其他脊椎物種同源關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4),刺參BHMT1的進(jìn)化地位與刺參生物學(xué)分類地位基本一致。

圖4 刺參與其他物種BHMT1氨基酸序列進(jìn)化樹

2.3 bhmt1基因在刺參不同組織的表達(dá)分析

RT-qPCR 結(jié)果顯示,刺參bhmt1在所檢測的腸道、呼吸樹、肌肉、體壁等組織中均有表達(dá),且在呼吸樹中表達(dá)水平最高,在肌肉、腸道、體壁中次之,在體腔液中幾乎不表達(dá)(圖5)。

圖5 刺參bhmt1的組織表達(dá)模式

2.4 不同程度低鹽脅迫對刺參腸道和呼吸樹組織bhmt1基因表達(dá)的影響

刺參幼參受不同程度的低鹽脅迫后bhmt1基因在兩種組織的表達(dá)情況如圖6所示。在鹽度為16的低鹽海水脅迫后各時間點(diǎn),刺參bhmt1基因在兩種組織中均出現(xiàn)了顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05),且在呼吸樹組織中差異上調(diào)表達(dá)倍數(shù)更高。在呼吸樹組織內(nèi),低鹽脅迫各時間點(diǎn)bhmt1基因表達(dá)量均極顯著高于對照組(P<0.01),在脅迫24 h后基因表達(dá)量達(dá)到最大值,為對照組的91.74倍,之后表達(dá)量隨脅迫時間延長逐漸下降;在腸道組織內(nèi),低鹽脅迫24 h后bhmt1基因表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05),且表達(dá)量隨脅迫時間延長逐漸上升,在脅迫72 h后達(dá)到表達(dá)量最大值,為對照組的61.98倍,之后出現(xiàn)表達(dá)量下降。在鹽度為24的低鹽海水脅迫后各時間點(diǎn)內(nèi),bhmt1基因在兩種組織中均出現(xiàn)了顯著上調(diào)表達(dá), 且兩種組織中表達(dá)倍數(shù)基本相似。

圖6 低鹽脅迫后刺參幼參兩種組織中bhmt1基因表達(dá)分析

脅迫24 h后,腸道和呼吸樹中bhmt1基因出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)(P< 0.05),在48 h和72 h經(jīng)歷短暫表達(dá)量回落后,在脅迫96 h時bhmt1基因表達(dá)量達(dá)到最大值且與對照組存在極顯著差異(P<0.01),此時腸道中該基因表達(dá)量為對照組的67.43倍,呼吸樹中該基因的表達(dá)量為對照組的84.68倍。此外,腸道組織中鹽度為16處理下bhmt1基因表達(dá)量在48 h顯著高于鹽度為24的基因表達(dá)量(P<0.01),而在96 h顯著低于鹽度為24的基因表達(dá)量(P<0.01),且呼吸樹組織中鹽度為16處理下bhmt1基因表達(dá)量在24～72 h均顯著高于鹽度為24的基因表達(dá)量(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

BHMT1具有Zn2+依賴的硫醇和硒醇甲基轉(zhuǎn)移酶家族的典型結(jié)構(gòu)特征,即具有GGCCGXXPXHI的結(jié)構(gòu)基序[10]。研究表明,該結(jié)構(gòu)基序序列高度保守,含有的三個半胱氨酸可與Zn2+結(jié)合并激活高半胱氨酸,如果其中任何一個半胱氨酸發(fā)生突變都會導(dǎo)致BHMT無法與Zn2+結(jié)合而失去催化功能[17-18]。對刺參bhmt1基因cDNA序列分析表明,刺參BHMT1由416個氨基酸組成并含有BHMT的典型基序結(jié)構(gòu)GGCCGFEPYHI,同時含有決定酶催化能力的與Zn2+結(jié)合的三個半胱氨酸(AA213、AA295和AA296)。此外,EVANS等發(fā)現(xiàn)的BHMT中可能作為甜菜堿結(jié)合位點(diǎn)的鋅指結(jié)構(gòu)序列同樣在刺參BHMT1序列中完全保守(D22-G23-G24,T41和E155)[19],因此刺參BHMT1上述特征結(jié)構(gòu)的保守性暗示著刺參BHMT1具有結(jié)合并催化同型半胱氨酸的能力。

在哺乳動物文獻(xiàn)報道中,BHMT主要在肝腎組織中表達(dá),其在肝臟組織中活性最高,表達(dá)量甚至占肝臟全部蛋白質(zhì)的0.6%～1.6%[20-23]。同時,不同物種BHMT的組織表達(dá)特征存在一定差異,如BHMT在人和豬的腎臟組織中表達(dá)較低,在大鼠腎臟中幾乎檢測不到表達(dá)量,而在成年反芻動物的肝胰腺中和恒河猴(Macacamulatta)的晶體中BHMT則呈現(xiàn)高表達(dá)活性[24-25]。據(jù)文獻(xiàn)報道,BHMT在日本石斑魚(Lateolabraxjaponicas)和鱸魚(L.japonicus)中主要在肝臟、消化道和腎臟組織中有表達(dá)[10]。本研究表明刺參bhmt1基因在呼吸樹、肌肉、腸道和體壁四種組織中均有表達(dá),且在呼吸樹中表達(dá)量高于其他組織。這與其他文獻(xiàn)報道有很大差異,可能與刺參獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)有關(guān)。目前文獻(xiàn)尚未報道刺參存在專門的滲透調(diào)節(jié)器官,而FOGLIETTA 等的研究則指出海參呼吸樹細(xì)胞遵守范托夫滲透法則,具有良好的滲透調(diào)節(jié)能力[26]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測這種良好的滲透調(diào)節(jié)能力很有可能歸因于bhmt1基因高表達(dá)催生的甜菜堿調(diào)控效果。

鹽度是影響刺參生理代謝的最重要的環(huán)境因子之一,對其存活、生長、發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)均有很大的影響[11]。作為典型的狹鹽性動物,刺參的極限鹽度生長范圍為22～36,最適鹽度生長范圍為28～34,鹽度過高或過低會引發(fā)刺參吐腸甚至死亡[11-12]。由于缺乏如硬骨魚腎臟的特異滲透調(diào)節(jié)器官,刺參不能自主調(diào)節(jié)體腔液的滲透壓,故其體腔液通常與周圍環(huán)境保持等滲,因此外界鹽度改變會引發(fā)刺參體腔液滲透壓的改變[27]。研究表明BHMT可通過調(diào)控體內(nèi)甜菜堿穩(wěn)態(tài)發(fā)揮對機(jī)體滲透壓變化的響應(yīng)。如有關(guān)哺乳動物和魚類的研究表明滲透壓改變BHMT的表達(dá),如豬在高滲條件下其肝臟、腎臟 BHMT表達(dá)降低[28];LU等則發(fā)現(xiàn)將香魚(Plecoglossusaltivelis)從淡水轉(zhuǎn)到海水后,其鰓中 BHMT 蛋白和 mRNA 均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)[29];錢云霞等研究則表明將鱸魚轉(zhuǎn)入低鹽環(huán)境后,bhmt在肝、腸、腎組織中均出現(xiàn)顯著上升表達(dá)[10]。本研究結(jié)果表明,兩種低鹽脅迫下,bhmt1基因在刺參腸道和呼吸樹組織中均有顯著上調(diào),從而提高了甜菜堿的分解水平,而低濃度甜菜堿有助于機(jī)體對于低滲環(huán)境的適應(yīng),這表明bhmt1很可能在刺參鹽度適應(yīng)過程中的滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其調(diào)控途徑的激酶途徑是否與脊椎動物相同則有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。同時,相對于鹽度24的低鹽脅迫,我們發(fā)現(xiàn)在鹽度為16的低鹽脅迫中,bhmt1基因上調(diào)倍數(shù)更高,且這一趨勢在呼吸樹組織中更明顯,暗示著bhmt1基因隨著低鹽程度加劇調(diào)控程度加深,且調(diào)控主要部位為呼吸樹組織。值得一提的是,甜菜堿作為機(jī)體面對不適環(huán)境的滲透物,可實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)重要細(xì)胞、蛋白質(zhì)和酶的保護(hù)[30],BHMT作為調(diào)節(jié)機(jī)體甜菜堿穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶,在生物應(yīng)對不良環(huán)境響應(yīng)中很可能發(fā)揮重要作用,如前期研究中在刺參夏眠過程中同樣發(fā)現(xiàn)了該基因在呼吸樹組織的顯著上調(diào)表達(dá)[15]。

綜上所述,本研究克隆了刺參bhmt1基因的cDNA全長,實(shí)時定量PCR分析表明該基因在刺參各組織器官中具有一定程度表達(dá),且在呼吸樹中表達(dá)最高;在不同程度低鹽脅迫時刺參呼吸樹和腸道組織中bhmt1基因均出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá),推測該基因參與了刺參鹽度變化的滲透壓適應(yīng)過程,為探究bhmt1基因功能及探究刺參滲透壓適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。