王 鍇,高銀鶴,王 革,徐瑤瑤,劉 盛,趙 烽

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué))、新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺(tái) 264005)

新型冠狀病毒肺炎(新冠肺炎,COVID-19)已知癥狀為發(fā)熱、乏力、干咳,伴隨有咽痛、鼻塞、流涕和腹瀉[1],隨著病情的進(jìn)一步加重會(huì)逐漸發(fā)展為中東呼吸綜合征(MERS)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)等較嚴(yán)重疾病[2]。從新冠肺炎患者的數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn),肺炎患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低,眾多炎癥因子(如IL-6、TNF等)顯著增高[3],這些炎癥因子可以和自身受體相結(jié)合,引起肺纖維化、內(nèi)皮功能障礙及炎癥反應(yīng),從而進(jìn)一步引發(fā)多種疾病,如肺水腫、心律失常和凝血障礙等[4-5]。因此,抑制炎癥因子對(duì)于治療新冠肺炎有至關(guān)重要的意義。

連花清瘟膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040063)主要由連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、板藍(lán)根、甘草等組成,能夠清瘟解毒,宣肺泄熱,在臨床上常運(yùn)用于流行性感冒的治療,還能緩解新冠肺炎中包括發(fā)燒、鼻塞、流涕、咳嗽等的一些臨床癥狀[6],但其治療新冠肺炎的作用機(jī)制仍未明確。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選連花清瘟膠囊治療新冠肺炎的有效成分及炎癥相關(guān)的作用靶點(diǎn),并對(duì)與靶點(diǎn)相關(guān)的生物過程和作用通路進(jìn)行富集,通過構(gòu)建多個(gè)化合物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)來(lái)探討連花清瘟膠囊治療新冠肺炎的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

Chem Office 2016, Swiss Target Prediction database (http://www.swisstarget prediction.ch/), Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/), STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/), PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/),Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/), PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/), Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/), Cytoscape3.7.1和Moe2008.10等。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,CO2培養(yǎng)箱,酶標(biāo)儀,固體NaNO2,Griess試劑,槲皮素,山奈酚和芫花素等。

1.2 方法

1.2.1 活性成分和靶點(diǎn)的篩選 將連花清瘟膠囊中的活性成分板藍(lán)根、大黃、甘草、廣藿香、金銀花、苦杏仁、連翹、麻黃和魚腥草輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)得到的化合物結(jié)構(gòu)使用PubChem確證,并保存成SMILES格式;將化學(xué)式導(dǎo)入Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中,選擇“Homo sapiens”為研究物種獲得藥物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2.2 疾病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的獲取 GeneCards知識(shí)庫(kù)自動(dòng)整合來(lái)自大約150個(gè)網(wǎng)絡(luò)資源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù),包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、遺傳、臨床和功能信息。以“COVID-19”和“炎癥”作為關(guān)鍵詞,從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出共1042個(gè)新冠病毒相關(guān)基因的信息;從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出466個(gè)炎癥相關(guān)靶點(diǎn)信息,選取其中相關(guān)分?jǐn)?shù)大于10分的靶點(diǎn)。

1.2.3 復(fù)方-疾病交集基因的獲取 應(yīng)用Venny 2.1平臺(tái)處理藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn),得到三者的韋恩圖,交集靶點(diǎn)作為潛在的靶點(diǎn)。

1.2.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將連花清瘟膠囊的活性化學(xué)成分與新冠病毒相關(guān)的潛在靶標(biāo)輸入 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值為0.4。將得到的蛋白相互作用結(jié)果以TSV的格式,導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.1 軟件,對(duì)PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行互作分析。其中,化合物和靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)表示,化合物和靶點(diǎn)之間的相互作用由邊表示,節(jié)點(diǎn)的大小、顏色的深淺變化代表度(Degree)值的大小,并根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值篩選出核心靶點(diǎn)。

1.2.5 富集分析 GO(Gene Ontology)是基因本體聯(lián)盟建立的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。GO數(shù)據(jù)庫(kù)有三類,即細(xì)胞成分(CC)、生物過程(BP)和分子功能(MF),分別描述了基因產(chǎn)物所在的細(xì)胞環(huán)境、所涉及的生物過程和可能的分子功能?；贛etascape數(shù)據(jù)對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行 GO功能富集分析以及 KEGG通路分析。選擇物種為人(Homo sapiens),設(shè)定閾值p<0.01,點(diǎn)擊分析后可以得到相關(guān)的通路信息。

1.2.6 分子對(duì)接 將篩選出來(lái)的10個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式能量最小化,3D優(yōu)化后,保存成mol格式。選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前29位的靶點(diǎn)作為受體,通過MOE軟件去除掉多余小分子后,質(zhì)子化并使其能量最小,然后導(dǎo)入優(yōu)化好的配體進(jìn)行分子對(duì)接,得到化學(xué)成分與靶點(diǎn)相互作用產(chǎn)生的對(duì)接分?jǐn)?shù)。對(duì)接分?jǐn)?shù)≤-37.68、≤-29.31及≤-20.93 kJ/mol分別代表較強(qiáng)、良好和一定的結(jié)合活性。

1.2.7 Griess法檢測(cè)化合物對(duì)炎癥介質(zhì)NO的影響 為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)連花清瘟膠囊發(fā)揮抗炎作用的核心成分的研究,進(jìn)一步探究了核心成分對(duì)炎癥介質(zhì)NO的影響,采用Griess法檢測(cè)NO2-的濃度,從而間接反映細(xì)胞所產(chǎn)生NO的濃度。步驟如下: (1)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取NaNO2粉末0.69 g放入潔凈干燥的離心管中,加入10 mL培養(yǎng)基,配制成1 mol/L的NaNO2溶液,使用前用培養(yǎng)基分別稀釋成5、20、40、60、80、100 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,另設(shè)置0 μmol/L空白培養(yǎng)基溶液。不同濃度的NaNO2溶液各取100 μL加到96孔板中,再分別加入100 μL Griess試劑。通過酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定其吸光度,并繪制NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞按照細(xì)胞計(jì)數(shù)方法稀釋至1×106個(gè)/mL,然后按照每孔200 μL的體積,將細(xì)胞液接種于96孔板中。(3)將鋪有RAW 264.7細(xì)胞的96孔板放入條件為5% CO2,37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,待細(xì)胞貼壁后加入化合物。(4)將實(shí)驗(yàn)分為三組:空白組、化合物組、LPS組,每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔?？瞻捉M只加0.4 μL的 DMSO,給藥組加入2 μL的LPS(終濃度1 μg/mL)和0.4 μL不同濃度的山奈酚、槲皮素和芫花素(終濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μmol/L),LPS組加入0.4 μL DMSO和2 μL 的LPS(終濃度1 μg/mL)。之后將96孔板放入條件為5% CO2,37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。(5)24 h后,每孔吸取100 μL的細(xì)胞上清液加到另一酶標(biāo)板中,同時(shí)100 μL/孔加入預(yù)先混合均勻的Griess試劑,搖床上低速振搖10 min,540 nm處測(cè)吸光度(A540)。(6)將A540代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞上清液中NO2-的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方化學(xué)成分及藥物靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中,以DL(類藥性指數(shù):Drug-likeness)大于或等于0.18和OB(口服生物利用:Oral Bioavailability)大于或等于30%為篩選條件,輸出各中藥成分的化合物靶點(diǎn)信息(表1)。

表1 連花清瘟膠囊中有效成分具體信息

2.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

對(duì)Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)去重篩選后,共計(jì)收集連花清瘟膠囊的活性化學(xué)成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)907個(gè),中藥-有效成分-靶點(diǎn)具體信息見表1。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)最終得到炎癥靶點(diǎn)466個(gè),新型冠狀肺炎靶點(diǎn)1042個(gè)。將化合物與疾病的靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 在線做圖工具平臺(tái)后,得到韋恩圖(圖1),得到連花清瘟膠囊干預(yù)新冠肺炎的潛在靶點(diǎn)57個(gè),其中關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及IL6、TNF、TLR4、CXCL8和NOS2等。

圖1 連花清瘟膠囊,炎癥和新冠肺炎的靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將化合物、潛在靶點(diǎn)等信息導(dǎo)入Cytoscape軟件,使用Cytoscape3.7.1中的 Network Analyze工具建立“化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)”,如圖2所示。

圖2 活性成分和靶點(diǎn)的作用網(wǎng)絡(luò)

由圖2可見，網(wǎng)絡(luò)共有155個(gè)節(jié)點(diǎn)、572條邊。圓形代表活性化學(xué)成分,方形代表核心靶標(biāo),不同藥物用不同顏色表示,化合物和靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)由各條邊來(lái)表示,其中與核心靶點(diǎn)聯(lián)系最密切的10個(gè)化合物按照度值大小排列在表2中,參數(shù)的度值越大,表明該化合物相關(guān)的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多,其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性就越大。連花清瘟膠囊中含有多味中藥,而一種化學(xué)成分通常對(duì)應(yīng)著多個(gè)交集基因靶點(diǎn),且一個(gè)交集基因與靶點(diǎn)與多個(gè)化學(xué)成分相聯(lián)系,這說(shuō)明連花清瘟膠囊治療新冠肺炎是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路相互作用而產(chǎn)生作用的,其核心成分共10個(gè),包括山奈酚、槲皮素和芫花素等。

表2 核心中藥成分和度值信息

2.4 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因進(jìn)行導(dǎo)入,初步構(gòu)建蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò),見圖3。構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖包含57個(gè)節(jié)點(diǎn)、710條邊,靶點(diǎn)的顏色越深代表與該靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)越多,在疾病治療中起到的作用越大。以“Degree>中位數(shù)(23)”篩選出核心靶點(diǎn) 29個(gè)(表 3)，推測(cè)以上靶點(diǎn)可能是治療新冠肺炎的重要靶點(diǎn)。

表3 核心靶點(diǎn)和度值信息

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 富集分析

為了進(jìn)一步探究連花清瘟膠囊治療新冠肺炎的作用機(jī)制,運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)中的GO生物功能和KEGG通路，分別對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行基因本體論功能富集分析和基因組百科全書通路分析。富集結(jié)果如圖4所示,多種途徑相互作用發(fā)揮抗炎作用,形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。不同的顏色代表不同的路徑,顏色深度代表P值的大小。在GO生物功能分析(P<0.01)中涉及到的通路有很多,其中與炎癥有關(guān)的信號(hào)通路分別是脂多糖反應(yīng)通路、細(xì)胞因子調(diào)控通路、急性炎癥反應(yīng)通路和外界刺激調(diào)控通路等。圖片中l(wèi)og10P值越小, 說(shuō)明核心靶點(diǎn)與該通路聯(lián)系密切的可能性越大,該通路在治療新冠病毒的過程中可能發(fā)揮較大作用。KEGG通路(P<0.01)中可能在治療作用中扮演著重要角色的通路有MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等。通過以上兩種富集分析功能可以得知,連花清瘟膠囊治療新型冠狀病毒存在多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用,可以調(diào)節(jié)不同的生物通路發(fā)揮藥效。

圖4 富集分析結(jié)果

2.6 分子對(duì)接

以得到的核心中藥成分為分子探針,選擇PPI網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)蛋白作為篩選對(duì)象,以結(jié)合能作為篩選指標(biāo),在MOE(Molecular Operating Environment)分子對(duì)接軟件平臺(tái)上進(jìn)行了分子對(duì)接研究。從表4的對(duì)接結(jié)果看出,得到的核心中藥成分中的槲皮素,山奈酚以及芫花素,與篩選出的29個(gè)核心靶點(diǎn)均有較強(qiáng)作用,其中靶點(diǎn)NOS2和以上三種化合物的結(jié)合能最低, 說(shuō)明連花清瘟膠囊治療新冠肺炎的主要中藥核心成分可能為山奈酚、槲皮素和芫花素,核心靶點(diǎn)可能為NOS2。

表4 受體和配體的結(jié)合能

2.7 Griess法檢測(cè)化合物對(duì)炎癥介質(zhì)NO的影響

為了驗(yàn)證連花清瘟膠囊核心成分山奈酚、槲皮素和芫花素與核心靶點(diǎn)NOS2的關(guān)系,采用Griess法檢測(cè)其對(duì)炎癥介質(zhì)NO的影響。由圖5可見,隨著槲皮素、山奈酚和芫花素濃度的升高,LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO逐漸減少,表明這三種核心成分對(duì)炎癥介質(zhì)NO均有一定的抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系。

圖5 槲皮素、山奈酚和芫花素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì) 胞釋放NO的抑制作用

3 討 論

連花清瘟膠囊入血成分具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),能通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子及信號(hào)通路發(fā)揮清除抗原、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)組織器官的作用,從而發(fā)揮對(duì)新冠肺炎的治療作用[7]。通過介導(dǎo)MAPK/NF-κB信號(hào)通路可以調(diào)控體內(nèi)炎癥因子水平從而降低脂多糖引起的肺部炎癥反應(yīng),對(duì)肺損傷進(jìn)行保護(hù)[8-9]。本研究的富集分析結(jié)果顯示,連花清瘟膠囊核心成分通過多條信號(hào)通路參與炎癥的治療作用,如MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路,各通路相互作用構(gòu)成復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò),共同抑制新型冠狀病毒肺炎。通過激活NF-κB信號(hào)通路,p38磷酸化增強(qiáng)和ERK磷酸化降低后,可以提高NOS2上調(diào)和NO產(chǎn)生[10]。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示,連花清瘟膠囊靶點(diǎn)NOS2與核心成分中，山奈酚、槲皮素和芫花素的相互作用最強(qiáng),推測(cè)連花清瘟膠囊中的活性成分可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥靶點(diǎn),抑制炎癥的發(fā)展,從而發(fā)揮治療新冠肺炎的作用。

山奈酚有較好的抗炎活性[11],可降低小鼠放射性肺損傷的程度,對(duì)小鼠放射性肺損傷具有防治作用,其機(jī)制可能與山奈酚抑制NF-κB及MAPK通路有關(guān)[12]。王旭杰等[13]發(fā)現(xiàn),山奈酚可能通過與 SARS-CoV-2RBD區(qū)域殘基相結(jié)合,阻斷病毒S蛋白與ACE2受體間的相互作用。槲皮素對(duì)脂多糖(LPS)引起的機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)具有抑制作用,干預(yù)炎癥因子的表達(dá),可以達(dá)到抗炎、抗病毒等療效[14-15]。經(jīng)過200 mg/kg槲皮素治療的小鼠肺組織炎性病變明顯減輕,并且NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降,提示槲皮素抑制金黃色葡萄球菌肺炎小鼠炎癥反應(yīng)與其抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路有關(guān)[16];槲皮素抗分選酶A可對(duì)肺炎鏈球菌生物被膜形成產(chǎn)生抑制作用[17],從而產(chǎn)生治療肺炎的作用。曾垣燁等[18]的研究揭示了槲皮素在新冠肺炎治療中的抗炎作用:通過有效調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞因子的釋放,抑制炎癥風(fēng)暴,改善肺功能。徐宇琴等[19]的研究也表明,槲皮素和山奈酚能降低促炎因子 IL-6 、TNF-α 、IL-1β的水平,進(jìn)而抑制核因子-κB,從而抑制炎癥反應(yīng),并能夠有效緩解肺損傷。芫花素具有抗炎和抗癌等作用[20-22],可以調(diào)控NF-κB信號(hào)通路干預(yù)炎癥[23],在肺炎含量測(cè)定、鑒定、藥理實(shí)驗(yàn)研究方面都具有重要意義。本研究中初步抗炎活性實(shí)驗(yàn)亦表明,山奈酚、槲皮素和芫花素均能通過抑制NO水平而表現(xiàn)出較好的抗炎活性,這與連花清瘟膠囊干預(yù)新冠肺炎炎癥機(jī)制,從而產(chǎn)生治療作用的目的相吻合。

4 結(jié) 論

連花清瘟膠囊中的山奈酚、槲皮素和芫花素等可能是治療新冠肺炎的有效成分，這些成分調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá),通過在多靶點(diǎn)、多通路的作用,進(jìn)而起到改善炎癥、調(diào)節(jié)免疫和治療新冠肺炎的效果。通過初步實(shí)驗(yàn)闡明了山奈酚、槲皮素和芫花素均能通過抑制炎癥介質(zhì)NO的表達(dá)從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性,進(jìn)而達(dá)到治療新冠肺炎的目的,進(jìn)一步的機(jī)制研究仍在進(jìn)行中。本研究為新冠肺炎的治療及拓展中藥藥物的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。