免疫印跡法檢測ENA抗體在診斷自身免疫性疾病中的應(yīng)用價值

王 勇，童華誠，王 蓓，于 慧，吳萍萍

（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇 南京 211102）

自身免疫性疾病是指機體對自身抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，引起自身組織損害的一類疾病，包括混合性結(jié)締組織病（MCTD）、多發(fā)性肌炎/ 皮肌炎（PM/DM）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征（SS）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）等[1]。此病患者的機體可產(chǎn)生病理性自身免疫反應(yīng)，破壞和損傷自身的組織和細胞成分，引起組織損害和多器官功能障礙。此病通常累及血液、關(guān)節(jié)、肌肉、骨骼及關(guān)節(jié)周圍的軟組織等全身各個系統(tǒng)。臨床研究表明，抗干燥綜合征抗原B 抗體、抗雙鏈DNA 抗體、抗核糖體P 蛋白抗體等常見的抗體在鑒別診斷各類自身免疫性疾病中有較高的敏感性和特異性，是診斷自身免疫性疾病的關(guān)鍵指標(biāo)[2]?？箍扇苄钥乖‥NA）抗體是針對核內(nèi)可提取性核抗原的一種自身抗體，主要包括抗核糖核蛋白抗體（RNP）和抗酸性核蛋白（Sm）抗體等。采用間接免疫熒光法、膠體金法、免疫斑點法、免疫印跡法（IBT）等檢測ENA 抗體，有助于臨床上診斷及鑒別診斷自身免疫性疾病[3]。本文主要是探討采用IBT 檢測ENA 抗體在診斷自身免疫性疾病中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年1 月至2021 年1 月我院收治的自身免疫性疾病患者72 例作為研究對象。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：病情符合自身免疫性疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4-5]；病歷資料完整、真實；對診治的依從性良好；溝通能力正常；知曉研究內(nèi)容，并簽署了知情同意書。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：免疫功能嚴(yán)重低下；處于妊娠期或哺乳期；合并有精神疾?。簧w征不穩(wěn)定；臨床資料不全；機體狀況較差，對檢查及相關(guān)治療的依從性或耐受性不佳。隨機將其分為觀察組和對照組，每組各有患者36 例。在觀察組患者中，有男18 例，女18 例；其年齡為28 ～60 歲，平均年齡為（48.5±6.1）歲。在對照組患者中，有男20 例，女16 例；其年齡為29 ～60 歲，平均年齡為（48.9±6.2）歲。兩組患者的一般資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫斑點法 采用酶聯(lián)免疫斑點法對對照組患者進行ENA 抗體檢測，方法是：采集患者的外周靜脈血3 mL（不在標(biāo)本中加入抗凝血），經(jīng)離心處理（轉(zhuǎn)速為3000 r/min）后分離出血清。采用酶聯(lián)免疫斑點法測定血清中ENA 抗體的表達情況，ENA 抗體主要有抗SS-A 抗體、抗SS-B 抗體、抗U1-nRNP抗體、抗Sm 抗體、抗Scl-70 抗體、抗Jo-1 抗體等。檢測所用的試劑盒購自歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒的說明書完成相關(guān)操作。

1.2.2 IBT 采用IBT 對觀察組患者進行ENA 抗體檢測，方法是：采集患者的外周靜脈血3 mL（不在標(biāo)本中加入抗凝血），經(jīng)離心處理（轉(zhuǎn)速為3000 r/min）后分離出血清。將檢測膜條放入溫育槽中，并在每槽中加入1.5 mL 的樣本緩沖液，搖擺搖床溫育5 min。在裝有膜條的測定槽中加入1 mL 的洗滌劑和10 μL的血清，置于37℃的溫水中洗滌30 min。取出后連續(xù)洗滌4 次，每間隔1 min 需通過濾紙進行吸干處理。之后行第一步溫育處理：吸去槽內(nèi)液體，在溫育槽中分別加入1.5 mL 已稀釋（1:101）的血清，搖擺搖床溫育30 min。清洗：吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5 mL工作濃度的清洗緩沖液清洗膜條3 次，每次5 min。第二步溫育：吸去槽內(nèi)液體，在槽內(nèi)分別加入1.5 mL 的酶結(jié)合物，搖擺搖床溫育30 min。清洗：吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5 mL 工作濃度的清洗緩沖液清洗膜條3 次，每次5 min。第三步溫育：吸去槽內(nèi)液體，在槽內(nèi)分別加入1.5 mL 的底物液，搖擺搖床溫育10 min。終止：吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗3 次，每次1.5 mL。采用臺式掃描儀掃描，并采用EUROLineScan 軟件評價結(jié)果。檢測所用的試劑盒為歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)的抗核抗體譜（IgG）檢測試劑盒，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒的說明書完成相關(guān)操作。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察采用IBT 對觀察組患者進行ENA 抗體檢測的結(jié)果。統(tǒng)計并比較兩組患者中不同類型自身免疫性疾 ?。≒M/DM、RA、SLE、MCTD、SS） 患 者ENA抗體的陽性檢出率。記錄觀察組患者室內(nèi)質(zhì)控抗體的檢出率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

經(jīng)Microsoft Excel 建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 22.0軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗，計量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用IBT 對觀察組患者進行ENA 抗體檢測的結(jié)果

采用IBT 對觀察組患者進行ENA 抗體檢測出的ENA 抗體主要為抗SS-A 抗體、抗SS-B 抗體、抗U1-nRNP 抗 體、抗Sm 抗 體、抗Scl-70 抗 體、抗Jo-1 抗體等。在本組36 例患者中，有29 例（占80.56%）患者檢出至少2 種ENA 抗體。

2.2 兩組患者中不同類型自身免疫性疾病患者ENA 抗體的陽性檢出率

本研究中兩組患者所患的自身免疫性疾病主要有MCTD、PM/DM、SLE、SS、RA。與對照組患者相比，觀察組患者中的PM/DM、RA、SLE、MCTD、SS 患者其ENA 抗體的陽性檢出率均顯著高于對照組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組患者中不同類型自身免疫性疾病患者ENA 抗體的陽性檢出率[例（%）]

2.3 觀察組患者室內(nèi)質(zhì)控抗體的檢出率

采用IBT 對觀察組患者進行ENA 抗體檢測時，其抗Jo-1、Scl-70 室內(nèi)質(zhì)控抗體的檢出率均為100.00%，抗SS-A 室內(nèi)質(zhì)控抗體的檢出率為97.22%，抗U1-nRNP 室內(nèi)質(zhì)控抗體的檢出率為97.22%，抗SS-B、Sm 室內(nèi)質(zhì)控抗體的檢出率均為94.44%。提示采用IBT 進行ENA 抗體檢測可靠、準(zhǔn)確。

3 討論

自身免疫性疾病是由自身免疫應(yīng)答反應(yīng)異常所導(dǎo)致的一類疾病。此病通常會侵犯人體的多個器官和系統(tǒng)。通過分析PM/DM、RA、SLE、MCTD、SS 等自身免疫性疾病的共同點，發(fā)現(xiàn)在此類患者的血液中均能檢測出多種高滴度的器官特異性和非特異性自身抗體，這些抗體均存在免疫學(xué)改變，其在自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷及活動性監(jiān)測中有較高的應(yīng)用價值[6]。ENA 抗體是一類能夠在血液中檢測到的抗核抗體，其核內(nèi)成分復(fù)雜，包括核糖核酸、脫氧核糖核酸等。IBT 可從分子水平和抗原不同表位，有效識別出抗體作用的抗原蛋白多肽分子量的不同，是一種全新的檢測技術(shù)[7]。相較于酶聯(lián)免疫斑點法，IBT 能夠?qū)崿F(xiàn)對多種抗體的識別，具有更高的敏感度和特異性，能有效鑒別診斷出易混淆的自身免疫性疾病，為后續(xù)的相關(guān)治療提供實驗室依據(jù)[8]。ENA 抗原主要存在于細胞核與細胞質(zhì)中，其中Sm 與RNP 通常是由攜帶有尿嘧啶核苷的U 族RNA 與抗核蛋白所構(gòu)成的抗原，而SS-A 和SS-B 多是由RNA 與其他蛋白結(jié)合產(chǎn)生的物質(zhì)[9]。流免疫電泳法（CIE）也是臨床上檢測ENA 抗體的一種方法。研究指出，采用CIE 檢測ENA 抗體時，存在純化困難的問題，會影響診斷的敏感性和特異性，且僅僅能夠檢測出4 種ENA 抗體。而采用SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行ENA 抗體檢測時，能通過分子篩的功能使ENA 中的各種抗原成分在分離之后轉(zhuǎn)印在硝酸纖維素膜上，然后再通過酶聯(lián)免疫吸附法顯示出相應(yīng)抗體反應(yīng)的顯色帶，使ENA 對自身免疫性多肽抗體的表位進行有效劃分，進而可使診斷的敏感性和特異性得到顯著提升[10-11]。不同自身免疫性疾病患者的體內(nèi)存在多種ENA 抗體，因此需采用合適的手段對其實施ENA 抗體檢測[12-13]。

本研究的結(jié)果證實，采用IBT 檢測ENA 抗體對診斷自身免疫性疾病具有較高的應(yīng)用價值。本方法值得在臨床上推廣應(yīng)用。