張海龍，劉優(yōu)優(yōu)，何云鳳，黨儒堯，陳 玥，劉夢雪，李佩國，李蘊玉

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島 066604)

雞大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)病是養(yǎng)雞場最常見的細(xì)菌病之一，具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。發(fā)病雞和帶菌雞是雞大腸桿菌病的主要傳染源，E.coli可通過呼吸道、消化道、空氣等多種途徑傳播[2-3]，不同日齡的雞均可感染發(fā)病，常與呼吸道疾病混合感染，使蛋雞養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益降低。E.coli血清型眾多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并且具有一定的區(qū)域性，不同血清型的菌株缺乏交叉免疫。致病性的強弱不僅與血清型有關(guān)，還與自身攜帶的毒力有關(guān)，致病性E.coli基因組可編碼黏附素、攝鐵系統(tǒng)等多種毒力因子，這些毒力因子入侵宿主體內(nèi)，使機體各組織器官受損嚴(yán)重[4]。目前，對于E.coli病的防治主要依賴抗生素，但耐藥性的增加，藥物殘留等問題，引起人們對食品安全的擔(dān)憂。本試驗對2021年從河北省秦皇島地區(qū)分離的36株致病性E.coli進(jìn)行血清型、毒力基因及耐藥性檢測，為該地區(qū)E.coli病的用藥提供臨床指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2021年從河北秦皇島地區(qū)不同養(yǎng)雞場分離鑒定的36株致病性E.coli，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。E.coli質(zhì)控菌株ATCC 25922由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器普通營養(yǎng)瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL2000 DNA Marker、2×Taq Marker Mix 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；E.coli血清型鑒定用O型血清因子購自天津生物芯片技術(shù)有限公司；17種藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；PCR儀(C1000 TOUCH) 購自德國Analytikjena公司；臺式離心機(TDL-40B)購自BIOBASE公司。

1.3 分離菌株的血清型檢測參考文獻(xiàn)[5]的方法，采用大腸桿菌O型血清因子進(jìn)行玻片凝集試驗，檢測分離的36株致病性E.coli的血清型。

1.4 分離菌株的毒力基因檢測按照DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取，根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]由北京生物工程有限公司合成毒力基因Vat、astA、hlyF、colv、Ler、eaeA、fimC、tsh、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA等16對引物(引物序列見表1)。以提取的DNA為模板，采用 PCR方法進(jìn)行毒力基因的檢測。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52～66℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6 μL，總體積為20 μL。對膠回收分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，分離菌株的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中參考株的基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.5 藥物敏感性試驗對分離的36株致病性E.coli采用CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推薦的K-B藥敏紙片法進(jìn)行試驗，抗生素分別為β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松)，四環(huán)素類(土霉素、多西環(huán)素)，喹諾酮類(諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星)，氨基糖苷類(卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星)，大環(huán)內(nèi)酯類(替米考星)，磺胺類(磺胺間甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明、磺胺二甲氧嘧啶)，酰胺醇類(氟苯尼考)，林可胺類(林可霉素)。以E.coliATCC25922為質(zhì)控菌株，以敏感(sensitivity,S)、中介(intermediate,I)、耐藥(resistance,R)3種形式判定藥敏試驗結(jié)果。

1.6 耐藥基因的檢測按照DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，參考文獻(xiàn)[8-9]由北京生工合成25種E.coli的耐藥基因引物(引物序列見表2)，包括β-內(nèi)酰胺類(CMY-2、KPC、Oxa-1、Oxa-5、SHV)、四環(huán)素類(Tet(C)、Tet(E)、Tet(G))、喹諾酮類(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、gyrA)、氨基糖苷類(aadA1、aadA2、StrA、StrB、aadD)、大環(huán)內(nèi)酯類(ermB、ermA、mefA)、磺胺類(dhpS、Sul-1、Sul-2、Sul-3)。以提取的DNA為模板，采用 PCR方法進(jìn)行耐藥基因的檢測，PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 40 s，52～58℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，DNA模板 3 μL，ddH2O 5 μL，總體積為20 μL。

表1 毒力基因引物序列

表2 耐藥基因引物序列

續(xù)表2

2 結(jié)果

2.1 分離菌株血清型檢測結(jié)果用E.coli標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子進(jìn)行玻片凝集試驗檢測分離菌株的血清型，結(jié)果顯示36株致病性E.coli共有10種不同的血清型，34株定型，2株未定型。以O(shè)78、O2、O1為主要流行的血清型，分別占比25.00%，19.44%，16.67%；而O9、O18和O147檢出的菌株數(shù)均為1株，各占比2.78%(表3)。

表3 36株雞源致病性E.coli血清型檢測結(jié)果

2.2 分離菌株毒力基因檢測結(jié)果通過PCR方法檢測16種毒力基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，36株致病性E.coli攜帶14種不同毒力基因，未檢測到Ler、eaeA2種毒力基因(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1～14泳道.fimC、tsh、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA、ompT、Iss、vat、astA、hlyF和colv;15.空白對照

36株致病性E.coli中，iutB毒力基因檢出率最高，為88.89%(32/36)；其次為tsh、fimC和hlyF毒力基因檢出率也較高，分別為80.56%,72.22%,72.22%；ompT、iroN、irp2、iucD、Iss和astA的檢出率在36.11%～66.67%之間；而Vat、colv毒力基因檢出率較低，分別為11.11%和16.67%(表4)。

表4 36株雞源致病性E.coli毒力基因檢測結(jié)果

2.3 分離菌株藥物敏感性試驗結(jié)果由表5可知，36株致病性E.coli對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶的耐藥率較高，均在86.11%以上；對復(fù)方新諾明、氟苯尼考、頭孢曲松、替米考星的耐藥率在77.78%～83.33%之間，對多西環(huán)素、土霉素、氨芐西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、恩諾沙星的耐藥率在38.89%～69.44%之間；而林可霉素、卡那霉素、阿米卡星的耐藥率較低，均在27.78%以下。

表5 36株雞源致病性E.coli耐藥性檢測結(jié)果

2.4 分離菌株多重耐藥結(jié)果由圖2可知，2021年分離的36株菌最少耐4種藥物，有2株，占比5.56%；最多耐16種藥物，有4株，占比11.11%；對11種藥物耐藥的菌株數(shù)最多，有8株，占比22.22%；對5，7，8，15種藥物耐藥的菌株數(shù)均為1株，各占比2.78%。

圖2 36株致病性E.coli對17種抗菌藥物的多重耐藥情況

2.5 分離菌株耐藥基因檢測結(jié)果分離的36株致病性E.coli以Sul-1、dhpS、qnrD和Sul-2耐藥基因為主，檢出率在83.33%以上，Sul-3、gyrA、mefA、qnrC、Tet(G)和ermB耐藥基因的檢出率為61.11%～77.78%，SHV、Oxa-5、aadA1和CTX-2耐藥基因的檢出率較低，分別為25.00%,22.22%,8.33%,2.78%，而KPC、qnrA和qnrB基因均未檢出(表6)。

表6 36株雞源致病性E.coli耐藥基因檢測結(jié)果

3 討論

3.1 秦皇島地區(qū)雞源致病性E.coli的血清型分析E.coli的血清型不同，其致病力強弱也有所不同。周明夏等[10]對江蘇省部分地區(qū)的159株雞源E.coli進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示除41株未定型外，剩下的118株以O(shè)24、O78、O88和O65為優(yōu)勢血清型，分別占比10.06%,2.52%,2.52%,2.52%。張召興等[11]對邢臺地區(qū)的32株致病性E.coli進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示32株E.coli有5株未定型，其余的27株共屬于 11 個血清型， O78、O148、O2和O8為主要流行血清型，分別占比 18.9%,15.6%,12.5%,12.5%。本試驗通過對秦皇島地區(qū)的36株致病性E.coli進(jìn)行血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)36株E.coli中有2株未定型，34株定型的E.coli以O(shè)78、O2和O1為主要流行的血清型，分別占比25.00%，19.44%,16.67%。由此表明，致病性E.coli的流行血清型與地區(qū)存在緊密的聯(lián)系,地區(qū)不同所流行的血清型也有所差異。

3.2 秦皇島地區(qū)雞源致病性E.coli的毒力基因分析禽致病性E.coli入侵機體后，不同的毒力因子之間互相組合，共同發(fā)生作用，從而導(dǎo)致雞發(fā)病。不同的毒力因子所導(dǎo)致的致病性強弱也有所差異。張子越等[12]對山東部分地區(qū)的20株E.coli進(jìn)行10種毒力基因的檢測，結(jié)果表明13株含有 5種以上毒力基因，占總菌株的65%；4株同時含有7種毒力基因，占總菌株數(shù)的20%；僅有1株未檢測到毒力基因。高玉斌等[13]對山東、西藏等7個省區(qū)的130株E.coli進(jìn)行7種毒力基因檢測，iroN毒力基因的檢出率最高，為69．23%(90 /130)；stx2檢出率最低，為1.54%(2 /130)；ompT、iss、fimC、hlyF、iutA的檢出率為50%～60%。本試驗結(jié)果表明，36株致病性E.coli中iutB毒力基因檢出率最高，為88.89%(32/36)；ompT、iroN、irp2、iucD、Iss、astA的檢出率在36.11%～66.67%之間；而Vat、colv毒力基因檢出率較低，分別為11.11%和16.67%。由此表明，不同地區(qū)雞源致病性E.coli的毒力基因流行趨勢存在一定的差異。

3.3 秦皇島地區(qū)雞源致病性E.coli的耐藥性檢測分析E.coli病在防治過程中耐藥菌株的增多，多重耐藥現(xiàn)象不斷呈上升趨勢，導(dǎo)致E.coli病的防治更加困難，使各國對E.coli病的防治都面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)。SOLA-GINES等[14]對西班牙分離到的22株APEC進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)22株APEC對環(huán)丙沙星、四環(huán)素等4種抗生素的耐藥率為78%～91%；對鏈霉素、磺胺甲惡唑等3種藥物的耐藥率為59%～69%；而對卡那霉素、慶大霉素等5種藥物的耐藥率較低，為6%～19%。王豪舉[15]研究結(jié)果表明，開州地區(qū)117株雞源E.coli對阿莫西林、氨芐西林、強力霉素的耐藥率為85.8%～97.6%；而對阿米卡星、諾氟沙星、頭孢他啶、頭孢噻肟、安普霉素的耐藥率低于 30%，具有很好的防治效果。本試驗對秦皇島地區(qū)的36株雞源E.coli進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果表明分離的菌株對磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶的耐藥率較高，均在86.11%以上；對多西環(huán)素、土霉素、氨芐西林等7種抗生素的耐藥率為38.89%～69.44%；而對林可霉素、卡那霉素、阿米卡星的耐藥率較低，均在27.78%以下。

綜上所述，本試驗對該地區(qū)雞源致病性E.coli的血清型、毒力基因和耐藥性的流行趨勢進(jìn)行研究，為該地區(qū)大腸桿菌病的防治提供了用藥指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。