鄭秀炆，文 歡，張俊清，黃玉芳，張鈺昕，劉愛霞，李湘怡，高亞男，張旭光

（教育部熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，?？谑欣枳遽t(yī)藥重點實驗室，海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199）

近年來隨著社會的發(fā)展，人們的飲食和生活方式發(fā)生巨大轉(zhuǎn)變，長期高糖高脂飲食的攝入和機體活動的減少，使糖尿病成為影響世界公共衛(wèi)生的一大全球性疾病。在我國，2015～2017 年糖尿病的患病率高達(dá)11.2%，預(yù)計到2040 年糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到1.597 億。2 型糖尿?。═2DM）作為糖尿病主要的發(fā)病類型，占該疾病的90%以上［1］。大量研究表明，胰島素抵抗（IR）是T2DM 發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，伴隨著T2DM 發(fā)病的整個歷程［2-4］。IR 的發(fā)生使外周組織（包括骨骼肌、肝臟和脂肪組織等）對胰島素的敏感性與反應(yīng)能力降低，導(dǎo)致胰島素在正常生理劑量下促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖攝取和利用效率降低，無法正常發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖平衡的生理功能［5-7］。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）的含量過低被認(rèn)為是 導(dǎo)致IR 的關(guān)鍵因素［8］，研究 表明GLUT4 通過跨膜轉(zhuǎn)運的方式促進(jìn)葡萄糖攝取及胰島素利用，維持機體血糖穩(wěn)態(tài)而改善IR［9-11］。目前，藥物治療是改善IR 的有效手段，但能夠直接改善IR 的藥物僅有二甲雙胍和噻唑烷二酮類，長時間使用會產(chǎn)生明顯的副作用，如耐藥性或心力衰竭等［12，13］。因此，安全、有效且無毒副作用的新型降糖藥物的發(fā)現(xiàn)十分必要。

高良姜是姜科山姜屬植物高良姜（Alpinia officinarumHance）的干燥根莖，功能主治為溫胃止嘔，散寒止痛，用于脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等癥［14］。高良姜是海南黎族地區(qū)常用藥材，并作為黎藥收錄于《黎族藥志》《黎藥學(xué)》［15，16］；有研究表明高良姜提取物能降低T2DM 小鼠血糖水平，尚未見對高良姜中主要化學(xué)成分的相關(guān)研究。高良姜素是高良姜的主要化學(xué)成分，有報道高良姜素可通過Akt/mTOR 信號通路改善IR，作用機制需進(jìn)一步深入研究［17，18］。綜上，本研究針對高良姜和主要化學(xué)成分高良姜素探究其改善IR 的作用，為進(jìn)一步將藥食同源特色黎藥高良姜應(yīng)用于糖尿病的輔助治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

Spectra Max19 全波長酶標(biāo)儀（美國）；Novo-Cyte3130 流式細(xì)胞儀（美國）；CRYSTAL191L 氣套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國）；Thermo Micro 21R 冷凍高速離心機（美國）；電泳儀（美國Bio-Rad）；Chemidoc xrs+高敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.2 材料及試劑

高良姜藥材（產(chǎn)自海南省海口市）；柱層析硅膠（200 目～300 目，青島海洋化工廠生產(chǎn)）；80%乙醇、石油醚（沸程60～90）、乙酸乙酯（天津大茂化學(xué)試劑廠）；HepG2 細(xì)胞（上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（依科賽，F(xiàn)SP500）；Cell Counting Kit-8（CCK8，APExBIO，K1018）；青 霉 素-鏈 霉 素（新賽美，C125C5）；2-NBDG（熒光葡萄糖類似物，APExBIO，B6035）；葡萄糖測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；羅格列酮（上海源葉生物科技有限公司，Y05F9C54480）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，C11995500BT）；PBS pH7.4（Gibco，C10010500 BT）；0.25%胰蛋白酶消化液（新賽美，C125C1）；RIPA 裂解液（碧云天，P0013C）；GLUT4 抗體（Proteintech，668461-1-lg）。

1.3 實驗方法

1.3.1高良姜提取物和高良姜素的制備 取干燥粉碎后的高良姜根莖（1.5 kg）用80%乙醇加熱回流提取3 次，每次1 h，濾過合并濾液，濃縮放冷至室溫得浸膏（200 g），即為高良姜提取物（AOE）。

將AOE 以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)（1∶0→0∶1）梯度洗脫，得到3 個組分即Fr.1（14 g）、Fr.2（14 g）、Fr.3（56 g）。Fr.3 經(jīng)反復(fù)分離富集，重結(jié)晶純化得到高良姜素（15 mg）。利用化合物的理化性質(zhì)和薄層色譜確定了高良姜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。針形的黃色結(jié)晶，可在甲醇中溶解，在氯仿中微溶，通過三氯化鐵薄層顯色，在紫外光下觀察到黃色熒光。配制3 種不同配比的展開劑分別與標(biāo)準(zhǔn)品高良姜素進(jìn)行薄層色譜對比分析，結(jié)果化合物與標(biāo)準(zhǔn)品斑點的比移值及斑點顯色相同，因此，該化合物確定為高良姜素，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 高良姜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 The chemical structure of galangin

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清和1% 的青霉素-鏈霉素）在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)目達(dá)到90%左右，棄去培養(yǎng)液，加入1 mL 的PBS溶液洗滌2 次，再加入0.25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，1～2 min 后用完全培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代，取處在對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3 CCK8 檢測細(xì)胞活力 將HepG2 細(xì)胞吹打混勻制成細(xì)胞懸液加入96 孔板中，每孔約1×104個細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞長滿至70%以上時，每孔換成含100 μL 不同濃度的高良姜提取物培養(yǎng)基（50、100、200 μg/mL）和不同濃度的高良姜素培養(yǎng)基（1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L）孵育48 h，同時設(shè)立對照組（零孔）和空白組，每組設(shè)6 個復(fù)孔。孵育結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK8 試劑，在培養(yǎng)箱中避光孵育1.5 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測OD 值，并計算各組細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=［（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）］× 100%

1.3.4 葡萄糖攝取實驗 將HepG2 細(xì)胞分為6 組，分別為空白組（CON）、模型組（MOD）、陽性對照組（羅格列酮，ROSI；25 μmol/L）、高良姜提取物組（AOE；50 μg/mL）、不同劑量的高良姜素組（10、20 μmol/L），每組設(shè)3 個重復(fù)。除空白組采用5.5 mmol/L 低糖培養(yǎng)基外，其余各組均采用50 mmol/L高糖培養(yǎng)基孵育HepG2 細(xì)胞，建立IR 細(xì)胞模型。按照細(xì)胞分組給予相應(yīng)藥物孵育48 h。然后棄去含藥培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，加入25 μmol/L 的2-NBDG 溶液，37 ℃避光孵育20 min，利用流式細(xì)胞儀檢測HepG2 細(xì)胞內(nèi)的流式熒光強度，即得葡萄糖攝取量。

1.3.5 葡萄糖消耗實驗 實驗分組同實驗1.3.4，共分為6 組，每組設(shè)6 個復(fù)孔，各給藥組細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。孵育結(jié)束后，利用葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶法）在酶標(biāo)儀中以505 nm 波長測定各組細(xì)胞培養(yǎng)基的吸光度（OD）值。同時，通過CCK8 實驗測定每孔中的OD 值，進(jìn)行歸一化，校正細(xì)胞數(shù)量引起的誤差。結(jié)果用葡萄糖消耗量/CCK8（GC/CCK8）表示。

1.3.6 Western blot 檢測細(xì)胞GLUT4 蛋白的表達(dá) 依據(jù)實驗1.3.4 對細(xì)胞進(jìn)行分組，并進(jìn)行藥物孵育48 h 后，棄去含藥培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min 離心5 min，棄上清；再加入RIPA 裂解液于冰上放置30 min 進(jìn)行蛋白裂解，然后于4 ℃、14 000 r/min 離心15 min 后取上清，變性后備用。用8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白樣品，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，并用脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉，孵育一抗GLUT4（1∶2 000稀釋）過夜；次日，孵育二抗，顯影成像，Image Lab軟件分析GLUT4 蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AOE 和高良姜素對HepG2 細(xì)胞活力的影響

孵育0～200 μg/mL AOE 和0～50 μmol/L 高良姜素的HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞活力均無顯著變化，而高良姜素在100 μmol/L 濃度時，明顯降低了細(xì)胞的存活率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。因此，本研究確定AOE 和高良姜素的給藥濃度分別為50 μg/mL和10、20 μmol/L。見表1。

表1 AOE（0～200 μg/mL）和高良姜素（0～100 μmol/L）對HepG2 細(xì)胞活力測定Tab 1 AOE（0～200 μg/mL）and galangin（0～100 μmol/L）to determine the viability of HepG2 cells

2.2 AOE 和高良姜素對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

MOD 組 細(xì) 胞 與CON 組 相 比，MOD 組 細(xì) 胞 的葡萄糖攝取明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），胰島素敏感性降低，顯示發(fā)生了胰島素抵抗，表明造模成功。而AOE 組、不同劑量的高良姜素給藥組和ROSI 組均增加了IR-HepG2 細(xì)胞的葡萄糖攝取，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且以20 μmol/L 高良姜素劑量的藥效最好，優(yōu)于陽性藥ROSI，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 AOE 和不同劑量高良姜素對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖攝取的影響Tab 2 Effects of AOE and different doses of galangin on glucose uptake of IR-HepG2 cells

2.3 AOE 和高良姜素對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

MOD 組細(xì)胞與CON 組細(xì)胞相比，其葡萄糖消耗量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而經(jīng)AOE 和不同劑量高良姜素處理后，IR-HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量得到改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 AOE 和不同劑量高良姜素對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響Tab 3 Effects of AOE and different doses of galangin on glucose consumption of IR-HepG2 cells

2.4 AOE 和高良姜素對IR-HepG2 細(xì)胞GLUT4 蛋白表達(dá)的影響

MOD 組細(xì)胞的GLUT4 蛋白的表達(dá)量較CON組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明IR-HepG2 細(xì)胞的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損。與MOD 組比較，AOE 組和不同劑量的高良姜素給藥組的GLUT4 蛋白的表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明AOE 和高良姜素促進(jìn)了IR-HepG2 細(xì)胞GLUT4 蛋白的表達(dá)，對胰島素具有增敏作用。見表4、圖2。

表4 AOE 和不同劑量高良姜素對GLUT4 蛋白表達(dá)的影響Tab 4 Effects of AOE and different doses of galangin on the expression of GLUT4 protein

圖2 AOE 和不同劑量高良姜素對GLUT4 蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effects of AOE and different doses of galangin on the expression of GLUT4 protein

3 討論

糖尿病是一種以血糖升高為主要特征的慢性代謝性疾病，國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的第9 版全球糖尿病地圖顯示2019 年全球成人糖尿病患者人數(shù)約4.63 億，且患病人數(shù)正在逐年上升［19］。IR 是糖尿病的關(guān)鍵致病因素，以IR 引發(fā)的糖尿病占據(jù)主導(dǎo)地位，同時許多代謝性疾病的發(fā)生均與IR 相關(guān)［20-22］。中醫(yī)上對IR 的認(rèn)識提到，IR 即是脾發(fā)生了病變，致使脾的運化功能異常，久而久之損傷心腎［23］。由于我國中藥及天然藥物資源極其豐富，因此可利用中藥價格低廉、易得、作用溫和、毒副作用小、可長期使用等獨特優(yōu)勢，將其開發(fā)為藥食同源產(chǎn)品。姜科植物高良姜主要分布在我國的南方地區(qū)，為海南特色黎藥，也是我國中醫(yī)寶庫的瑰寶。當(dāng)前已有研究發(fā)現(xiàn)，特色黎藥高良姜80%乙醇提取物對T2DM 小鼠的血糖水平具有顯著的降低作用，經(jīng)對該有效部位進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明該部位主要由高良姜素等5 種成分組成，其中高良姜素的含量最高［24］，但目前對于高良姜發(fā)揮降血糖作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不十分清楚。

綜上，本研究從高良姜干燥莖根中制備AOE，進(jìn)一步分離純化后得到高良姜素，通過構(gòu)建IR-HepG2 細(xì)胞模型，探究AOE 和高良姜素改善IR和糖代謝的作用。結(jié)果表明IR-HepG2 細(xì)胞孵育AOE 和不同濃度的高良姜素后，其葡萄糖的攝取量和消耗量均得到顯著地提高，維持細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖的平衡，證實了特色黎藥高良姜可能通過改善IR 作用發(fā)揮降低血糖的功效。此外，GLUT4 是胰島素信號級聯(lián)通路的下游分子，也是肝臟葡萄糖利用的限速分子，與IR 密切相關(guān)［9］。研究表明GLUT4 缺失的小鼠機體內(nèi)會發(fā)生糖原分解，從而引起IR［25，26］。本研究通過Western blot 技術(shù)對GLUT4 蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)AOE 和高良姜素能夠顯著增加GLUT4 蛋白的表達(dá)，提示高良姜可能通過調(diào)控GLUT4 相關(guān)信號通路改善IR。

為了更好地預(yù)防和治療T2DM，仍需進(jìn)一步地探究高良姜降血糖的作用機制。糖尿病的發(fā)病過程與IR、氧化應(yīng)激和炎癥因子等均密切相關(guān)，而高良姜的藥理作用包括抗炎和抗氧化等作用，因此有必要對高良姜治療糖尿病的作用機制進(jìn)行更為深入的研究，闡明高良姜治療T2DM 的確切作用機制。

作者貢獻(xiàn)度說明：

鄭秀炆、文歡：進(jìn)行實驗操作、分析數(shù)據(jù)、論文起草；張俊清：設(shè)計實驗方案、對論文進(jìn)行修改指正；黃玉芳：參與細(xì)胞培養(yǎng)和CCK8 測定細(xì)胞毒性實驗；張鈺昕：參與葡萄糖攝取實驗；劉愛霞：參與葡萄糖消耗實驗；李湘怡：參與Western blot 實驗；高亞男、張旭光：提供技術(shù)支持和指導(dǎo)、對論文進(jìn)行修改指正。

本文無利益沖突。