何昌芬，楊曉琳，孫好強(qiáng)，馬 玲，盧新義，康杰芳*

(1. 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，西安 710119；2. 陜西步長制藥有限公司，西安 710075)

紅花（Carthami Flos）是菊科植物紅花(Carthamus tinctoriusL.) 的干燥管狀花，是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛的功效，臨床上主要用于治療經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕結(jié)塊、跌打損傷等[1]。紅花主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、亞精胺類、酚酸類等化學(xué)物質(zhì)[2-3]。新疆、云南和甘肅是我國紅花的三大產(chǎn)區(qū)，其中新疆是紅花的最大栽培種植區(qū)，出產(chǎn)的紅花質(zhì)量好、療效高且品質(zhì)優(yōu)良[4-5]。

無機(jī)元素是中藥單方制劑和復(fù)方制劑的質(zhì)量特征參數(shù)，是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分，是區(qū)分產(chǎn)地和藥用部分的重要標(biāo)志。近年來，無機(jī)元素已作為中藥材、香料和食品的質(zhì)量評(píng)估和安全性評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一[6-7]。研究報(bào)道，紅花功效與無機(jī)元素的含量具有一定的相關(guān)性，無機(jī)元素也可作為衡量紅花質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[8-11]，同時(shí)，鎘、銅等無機(jī)元素含量的測定，對(duì)于評(píng)價(jià)紅花的藥用安全性有著重要意義[12]。

中藥材中無機(jī)元素含量的測定常用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和原子熒光光譜法等[13]，相比之下，電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定分析具有靈敏度高、檢出限低、多元素同時(shí)測量分析的優(yōu)點(diǎn)[14-17]。藥材前處理的方法有微波消解法、石墨消解法等，微波消解作為一種經(jīng)典的樣品預(yù)處理方法，具有安全高效、簡便快捷、環(huán)保節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[18-20]。本研究采用微波消解技術(shù)對(duì)紅花樣品進(jìn)行前處理，以硅（28Si）、鈧（45Sc）、鍺（72Ge）和銦（115In）為內(nèi)標(biāo)元素，以ICP-MS 法測定9 種無機(jī)元素含量，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)無機(jī)元素含量進(jìn)行聚類分析，為評(píng)價(jià)紅花質(zhì)量、區(qū)分紅花的道地產(chǎn)區(qū)及揭示紅花在臨床應(yīng)用中的作用機(jī)理提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 SB25-12DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LC-2030高效液相色譜儀（島津株式會(huì)社）；AL204 型分析天平（Mettler-Toledo 公司）；馬弗爐（株洲雙菱科技公司）；HH-6B 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇常州國華電器有限公司）；MARS 6 CLASSIC 微波消解儀（MATTHEWS NC 公司）；Agilent 7700 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（安捷倫公司）；聚四氟乙烯微波消解管（西安莫吉娜儀器制造有限公司）；石墨消解儀（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；超純水儀（美國Milipore 公司）。

1.1.2 試劑 高純氦氣（陜西沁藍(lán)化工科技有限公司）；ICP-MS 調(diào)諧溶液（美國PerkinElmer 公司）；鎂（Mg）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、錳（Mn）、銅（Cu）、鉻（Cr）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、鈷（Co）標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；乙腈、硝酸（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；甲醇、鹽酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有 限公司）。

1.1. 3 供試樣品 紅花樣品于2017 年8 月采自于新疆、山東、河南、甘肅、青海和云南6 個(gè)不同產(chǎn)地，共32 批樣品。經(jīng)陜西師范大學(xué)西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室鑒定為菊科植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥花，樣品信息見表1。

表1 紅花樣品信息Table 1 Carthami Flos and its origins

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 將紅花藥材粉碎，過3 號(hào)篩，置干燥箱中干燥至恒重，留樣備用。

1.2.2 供試品溶液的配制 聚四氟乙烯微波消解管和實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器使用30% HNO3溶液浸泡24 h后取出洗凈，烘干備用。準(zhǔn)確稱取紅花粉末0.20 g放于耐高溫的微波消解管中，隨后精確加入8 mL濃硝酸，靜置過夜，預(yù)消解后按照表2 的微波消解程序在微波消解儀中進(jìn)行消解，待消解液冷卻后取出消解管，加熱趕酸后將管內(nèi)的消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用純凈水清洗消解管并將洗液并入容量瓶中，定容后即得供試品溶液。

表2 紅花微波消解程序Table 2 Microwave digestion of Carthami Flos

用2% HNO3溶液作為空白對(duì)照溶液，供試品溶液和空白對(duì)照溶液均1 式3 份。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密量取鎂（Mg）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、錳（Mn）、銅（Cu）、鉻（Cr）、鋅（Zn）、鎘（Cd）和鈷（Co）元素的標(biāo)準(zhǔn)液適量，用2% HNO3稀釋定容成濃度梯度為2、5、10、25、50 和100 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用2% HNO3稀釋定容成含Si、Sc、Ge 和In 元素、濃度為10 μg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.4 ICP-MS 工作條件 ICP-MS 測定分析主要受到質(zhì)譜干擾和非質(zhì)譜干擾，為規(guī)避質(zhì)譜干擾，本研究采用He 碰撞池反應(yīng)模式；為規(guī)避非質(zhì)譜干擾，本研究選擇硅（28Si）、鈧（45Sc）、鍺（72Ge）和銦（115In）為內(nèi)標(biāo)元素，校正一般的基體效應(yīng)。

ICP-MS 測定條件：射頻功率（RF）功率為1 550 W，載氣流量（Ar）為1.02 min·L-1，輔助氣流量（Ar）為0.35 min·L-1，碰撞氣流量（He）為5 min·L-1，蠕動(dòng)泵為0.1r·s-1，采樣深度為8 mm，數(shù)據(jù)重復(fù)采集次數(shù)為3 次，霧化室溫度為2 ℃，調(diào)諧模式為He氣模式，穩(wěn)定時(shí)間為25 s。

1.2.5 無機(jī)元素含量測定 在1.2.4 項(xiàng)儀器參數(shù)條件下對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液進(jìn)行測定，由ICP-MS 工作站記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)考察 在1.2.4 項(xiàng)儀器條件下，依次將各濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸入ICP-MS 儀器進(jìn)行分析，以待測元素的含量為橫坐標(biāo)，待測元素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)元素的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，其中24Mg 選用28Si 做內(nèi)標(biāo)元素；56Fe、43Ca、52Cr 和55Mn 選用45Sc 做內(nèi)標(biāo)元素；59Co、63Cu 和66Zn 選用72Ge 做內(nèi)標(biāo)元素；111Cd 選用115In 做內(nèi)標(biāo)元素；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程；各元素的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)結(jié)果（表3）顯示，各元素的相關(guān)系數(shù)R＞ 0.999，表明線性關(guān)系良好。在選定儀器工作條件下，取11 次平行測定的空白溶液（2%HNO3溶液）的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的元素的濃度值為檢出限。

表3 測定元素的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear regression equations and correlation coefficients of standard solution elements

2.1.2 精密度考察 取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2.4項(xiàng)ICP-MS 儀器工作條件下平行測定6 次，進(jìn)行精密度分析，結(jié)果顯示各元素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.34% ～ 3.02%范圍之間，表明儀器精密度良好。

2.1.3 加標(biāo)回收率考察 精確稱量紅花樣品，經(jīng)前處理以及微波消解后，加入混標(biāo)溶液，在1.2.4 項(xiàng)ICP-MS 儀器工作條件下進(jìn)行分析測定，計(jì)算各元素的加標(biāo)回收率。結(jié)果（表4）顯示各元素的回收率在96.2% ～ 109.5%之間，表明本方法準(zhǔn)確度及精確度良好。

表4 9 種無機(jī)元素加標(biāo)回收率（n = 3）Table 4 Standard recoveries of nine inorganic elements (n = 3)

2.1.4 重復(fù)性考察 取紅花樣品6 份，經(jīng)樣品前處理后，按1.2.2項(xiàng)制備供試品溶液，在1.2.4項(xiàng)ICP-MS儀器工作條件下進(jìn)行重復(fù)性分析，結(jié)果顯示各元素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.01% ～ 3.18%范圍之間，表明該試驗(yàn)條件方法的重復(fù)性良好。

2.2 無機(jī)元素含量測定

32 批不同產(chǎn)地的紅花按1.2.2 項(xiàng)的程序條件下進(jìn)行微波消解，按1.2.4 項(xiàng)儀器參數(shù)條件進(jìn)行分析測定。結(jié)果（表5）顯示，紅花中含有豐富的無機(jī)元素，一個(gè)產(chǎn)區(qū)紅花中9 種無機(jī)元素含量趨勢基本服從Ca ＞ Mg ＞ Fe ＞ Mn ＞ Cu ＞ Zn ＞ Cr ＞ Cd ＞ Co，其中Mg、Ca 含量最為豐富，F(xiàn)e、Mn、Cu 含量次之，Cr、Co、Zn 和Cd 含量較少。從不同產(chǎn)區(qū)來看，河南紅花的無機(jī)元素含量整體更高，新疆各產(chǎn)區(qū)紅花的無機(jī)元素含量基本保持在較高水平。

表5 不同產(chǎn)地紅花無機(jī)元素含量測定Table 5 Inorganic elements measurement of Carthami Flos from different places (μg·g-1)

2.3 無機(jī)元素含量聚類分析

用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以無機(jī)元素含量為變量，對(duì)32 個(gè)紅花樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果（圖1）表明，各個(gè)產(chǎn)區(qū)紅花樣品的無機(jī)元素含量在遺傳距離大于20 時(shí)，新疆和青海的紅花聚為一類，河南、山東、云南和甘肅的紅花聚為一類。

圖1 不同紅花樣品中無機(jī)元素含量聚類分析Figure 1 Cluster analysis of inorganic element contents in different Carthami Flos samples

3 討論與結(jié)論

紅花具有活血通經(jīng)，散瘀止痛等作用?，F(xiàn)代藥理研究學(xué)表明，紅花以及相關(guān)的提取物、口服液、注射劑、膠囊、復(fù)方制劑等有治療心、腦血管疾病，跌打損傷，冠心病，脈管炎，瘡瘍腫痛，經(jīng)閉痛經(jīng)以及糖尿病并發(fā)癥等療效[4,21-22]，這與紅花中豐富的無機(jī)元素含量緊密相連。Ca 元素參與調(diào)節(jié)神經(jīng)和肌肉相關(guān)活動(dòng)，維持機(jī)體組織應(yīng)激性和體內(nèi)酸堿平衡，維持毛細(xì)血管以及細(xì)胞膜的正常生理功能，調(diào)節(jié)心律和保護(hù)心臟等[23]。Mg 元素能降低血壓，擴(kuò)張血管，增強(qiáng)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，促進(jìn)心肌代謝，維持心律正常等。Ca、Mg 協(xié)同作用，能保護(hù)神經(jīng)、肌肉和骨骼相關(guān)生理功能，降低血液中的膽固醇，防治冠心病等，這與紅花具有治療心、腦血管疾病及冠心病的藥理活性一致。Fe 元素是人體所需的造血無機(jī)元素，參與人體內(nèi)氧氣的運(yùn)輸、酶的形成以及一系列新陳代謝等[24]。 Cu 元素能保護(hù)血管壁內(nèi)膜完整性，防止動(dòng)脈粥樣化和心肌細(xì)胞代謝紊亂，是血紅蛋白的活化劑和機(jī)體多種酶的主成分，影響Fe 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)從而影響機(jī)體的造血過程，這與紅花活血通經(jīng)、治療瘡瘍腫痛及經(jīng)閉痛經(jīng)的藥理活性一致。Zn 元素能維持腎氣的興衰，維持心肌細(xì)胞的正常功能，延緩機(jī)體衰老，加速人體生長發(fā)育和創(chuàng)傷組織愈合，參與能量代謝等[25]。Mn 元素能促進(jìn)骨骼生長，保護(hù)機(jī)體免疫系統(tǒng)，修復(fù)機(jī)體造血功能，促進(jìn)多種營養(yǎng)物質(zhì)合成和代謝氧化，參與傳遞生物遺傳信息等。Zn、Mn 元素被認(rèn)為是中醫(yī)中“歸腎經(jīng)”的物質(zhì)基礎(chǔ)。Co 元素參與維持人體生命健康和疾病預(yù)防等。Cr 元素參與維持胰島素受體生理功能，機(jī)體缺Cr 影響機(jī)體糖脂代謝，誘發(fā)動(dòng)脈硬化等，鎘、銅既是無機(jī)元素又是重金屬元素，重金屬在人體內(nèi)不易降解易積聚，從而使蛋白變性、酶失去活性，因此重金屬元素的超標(biāo)會(huì)危害人體健康[26]。根據(jù)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的限量標(biāo)準(zhǔn)》：鎘（Cd）≤ 0.3 mg·kg-1，銅（Cu）≤20.0 mg·kg-1。表5 顯示，32 批不同產(chǎn)地紅花中所含的Cr、Cu 均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

本研究采用 ICP-MS 法測定分析新疆、山東、河南、甘肅、青海和云南6 個(gè)產(chǎn)區(qū)32 批不同紅花樣品中9 種無機(jī)元素。經(jīng)方法學(xué)考察，該方法具有物理干擾少、測定速度快、方法重復(fù)性好、回歸方程線性相關(guān)性好、準(zhǔn)確度及精確度好等優(yōu)點(diǎn)。元素含量測定結(jié)果顯示，新疆、河南、甘肅及云南幾個(gè)產(chǎn)區(qū)的紅花中均含有豐富的Ca、Mg、Fe、Mn 和Zn元素，其中尤以Ca、Mg 和Fe 含量最為豐富；甘肅產(chǎn)區(qū)的紅花含有較高的Zn、Cr 元素，河南產(chǎn)區(qū)的紅花含有較高的Ca、Mg 、Fe 和Mn 元素，其中Ca、Mg 含量最高的是河南新鄉(xiāng)產(chǎn)區(qū)。無機(jī)元素含量聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離大于20 時(shí)，新疆和青海產(chǎn)區(qū)紅花的聚為一類，其他幾個(gè)產(chǎn)區(qū)的紅花聚為一類，揭示了無機(jī)元素具有地域性差異。