長江鱘幼魚的聽覺閾值研究

項 杰 鄒巧林, 杜 浩, 王成友 , * 危起偉, *

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 上海 201306; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430072)

隨著人類活動在長江活動范圍規(guī)模的日益增加, 長江上星羅密布的船舶、不斷增加的橋梁及堤壩建設(shè)等帶來的水下噪聲污染也越來越多, 這些水下噪聲的存在對生活在長江中的魚類造成一定的不利影響[1], 影響長江中魚類的棲息、繁殖、遷徙、生長發(fā)育等。此外, 大部分魚類可通過聲音來完成定位、捕食、生殖和躲避天敵等一系列生命周期中的重要活動[2]。 研究表明[3], 人為噪聲會引起水生動物的聽覺和行為學(xué)變化, 改變它們的發(fā)聲、棲息和遷移等行為。

魚類無外耳和中耳道, 內(nèi)耳是主要的聽覺器官,主要由耳石、半規(guī)管、聽囊及聽囊內(nèi)感覺上皮的聽覺毛細胞組成。除了內(nèi)耳外, 魚類還有其他的輔助器官來提高聽覺敏感性, 如魚鰾將聲壓信號轉(zhuǎn)化成粒子運動, 從而使得魚類可以間接地感受水下聲音的聲壓分量。此外, 韋伯氏器將魚鰾與內(nèi)耳直接相連在一起, 可提高魚類對聲壓信號的可識別頻率上限[2]。

目前, 魚類聽覺研究較少, 尤其是聽覺閾值, 聽覺閾值是魚類最基本的聽覺特性, 是開展上述魚類聽覺應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。早期對于聽覺閾值的測定主要采用行為條件反射的方法(Behavior Condition,以下簡稱行為學(xué)方法), 通過在區(qū)域內(nèi)播放指定聲音, 當(dāng)魚靠近時, 給予相應(yīng)獎勵, 但這種方法需要對魚類進行馴化, 時間周期長, 難以準(zhǔn)確測定魚類感知到的聲音強度, 且對魚類養(yǎng)殖要求高, 適用范圍較窄。后續(xù)發(fā)展出了心電圖法(Electrocardiograph,以下簡稱ECG法)和聽覺腦干反應(yīng)或聽覺誘發(fā)電位法(Auditory brainstem response, 或Auditory Evoked Potential以下簡稱AEP法)[4]。ECG法需要對魚體進行傷害性的外科手術(shù), 將電極插入心臟附近記錄心電反應(yīng), 對魚體傷害較大; AEP法是根據(jù)腦電信號變化來判斷魚對聲音刺激的反應(yīng), 只需將電極接觸顱骨即可記錄腦電反應(yīng), 是一種微創(chuàng)的、無須復(fù)雜行為馴化、實驗魚可重復(fù)利用的高效技術(shù)手段, 是目前研究聽力閾值的主要研究方法, 被廣泛應(yīng)用于魚類的聽覺損傷研究、聲暴露試驗等研究[5]。

長江鱘(Acipenser dabryanusDumeril), 屬軟骨硬鱗魚類, 1988年列為國家一級重點保護動物,2010年被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)升級為極危級(CR)保護物種。長江鱘是典型的洄游型魚類, 主要分布在長江上游干流和部分重要支流[6]。近年來,隨著長江大保護戰(zhàn)略規(guī)劃的實施, 越來越多的長江鱘被放歸長江, 開展長江鱘的聽覺研究是評估長江水下噪聲尤其是船舶噪聲對長江鱘放流個體影響的基礎(chǔ)。本文利用聽覺誘發(fā)電位研究了長江鱘的聽覺閾值, 為長江鱘野外放歸和種群重建提供重要基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗魚取自長江水產(chǎn)研究所荊州太湖中華鱘繁殖基地, 為2018年繁殖的子三代長江鱘, 試驗前試驗魚暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃水槽中(150 cm×150 cm×100 cm)5d, 養(yǎng)殖用水為井水, 養(yǎng)殖水溫為(19±0.3)℃。在試驗魚養(yǎng)殖期間, 對養(yǎng)殖環(huán)境噪聲進行監(jiān)測, 暫養(yǎng)水槽中的環(huán)境噪聲約為(42±0.3) dB。采用AEP方法測定長江鱘的聽力閾值, 選取20尾活力充沛的試驗魚, 體長為(481±20.5) mm, 體重為(439.42±42.42) g。

1.2 實驗方法

實驗裝置AEP法的試驗裝置由隔音室、聲刺激系統(tǒng)及數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)組成(圖1)。聲刺激采用水槽底部的水下?lián)P聲器(UW-30, Electro-Voice 美國)播放聲音, 并置于魚頭部正下方15 cm處。聲音信號由軟件SigGenRZ (Tucker Davis Technologies TDT, 美國)產(chǎn)生, 并通過功率放大器(SANSUI, 山水電子, 中國)后輸入TDT系統(tǒng); 數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)由TDT系統(tǒng)處理器(RZ6, 美國)和TDT前置放大器(RA4LI,美國)組成, 數(shù)據(jù)由計算機記錄并進行數(shù)據(jù)分析, 同時采用B&K 8103型水聽器記錄隔音室中的背景噪聲和實際記錄到的噪聲, 通過BioSigRZ 軟件對獲得AEP波形進行記錄與數(shù)據(jù)分析。隔音室內(nèi)水體環(huán)境的背景噪聲為30 dB, 隔音室與外界接地, 以屏蔽儀器等產(chǎn)生的雜波造成的干擾。

圖1 實驗裝置圖Fig.1 Experimental device

AEP測定方法在進行聽覺閾值測定前, 首先對實驗魚進行麻醉, 采用(中國, 漁夫?qū)毠? MS-222麻醉劑對魚體進行麻醉, 用量為(3.7±0.2) μg/g體質(zhì)量, 待試驗魚只有鰓蓋輕微扇動后進行實驗。此時, 試驗魚除鰓蓋輕微扇動外, 無全身性的肌肉收縮, 排除了肌電干擾。

魚體麻醉后用紗網(wǎng)包裹后, 固定在“L”型支架上, 取(19±0.3)℃的井水, 以確保試驗過程中水溫和養(yǎng)殖水溫一致, 實驗過程中魚體耳部沒入水下, 僅頭部略高于水面。同時, 實驗過程中通過呼吸軟管將曝氣水注入實驗魚口中, 保證實驗魚的呼吸。

AEP電極為直徑為0.1 mm的金屬針電極(美國,WPI公司), 針長15 mm。記錄電極插入長江鱘后腦頭骨正上方, 參考電極插入試驗魚雙眼之間皮膚,接地電極直接放入水體中。所有的電極均通過前置放大器(RA4LI, 美國)與TDT系統(tǒng)相連。

采用短純音對試驗魚進行聽覺閾值測定, 設(shè)置兩個相位相反的刺激聲音, 如90和270度, 如果它們誘發(fā)的腦電位波形具有重合性, 即可視為正確的AEP反應(yīng), 典型AEP波形的響應(yīng)頻率約為刺激頻率的兩倍, 如100 Hz的刺激信號產(chǎn)生的AEP波形中存在2倍刺激頻率的信號, 即存在200 Hz的信號峰。設(shè)定的測定頻率為100、200、300、400和500 Hz,由低頻率向高頻率進行測定, 聲壓測定范圍為150—130 dB, 以5 dB的聲壓級進行遞減, 接近閾值時, 以2 dB進行遞減, 直至觀測到不可識別和不可重復(fù)的波形, 則為長江鱘聽覺的最小聲壓級即聽覺閾值。給予每尾長江鱘的刺激時間為30ms, 同一頻率同一聲壓級下的測定時間為30s, 重復(fù)測定2次, 各頻率聲壓級間測定間隔時間為5s。

此外, 設(shè)置死亡個體(因病)對照組, 因病死亡的個體無法記錄到AEP波形, 不僅不存在2倍關(guān)系, 而且是類似隨機信號的雜波。

1.3 數(shù)據(jù)處理

聽覺閾值確定的方法參照張旭光等[7]研究。所有數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 并使用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理, 并對記錄到的聽覺閾值數(shù)據(jù)進行Excel分析并繪制出聽覺閾值圖。

2 結(jié)果

2.1 AEP波形

本實驗所用的20尾長江鱘均測得AEP波形。典型的長江鱘AEP波形包括3—5個正向波峰, 長江鱘的AEP潛伏期較短, 隨著頻率的變化和刺激聲強度的變化而發(fā)生變化, 頻率不同時, 潛伏期從低頻率至高頻率, 不斷縮短, 從100 Hz的3.7ms到500 Hz的2.5ms。當(dāng)頻率相同時, 從低強度至高強度, 潛伏期也在逐漸縮短。長江鱘的AEP波形最大振幅也隨著頻率的增加而遞減(圖2)。

圖2 300 Hz AEP波形圖及死亡個體對照Fig.2 The 300 Hz AEP waveform and control of dead fish

2.2 長江鱘的聽力圖

試驗所用的20尾長江鱘在100—500 Hz的頻率范圍內(nèi)均記錄到了AEP波形, 將每一頻率記錄的閾值進行平均, 不同頻率間的閾值數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P＜0.05)。

將每一頻率的閾值平均, 做出長江鱘的聽力曲線圖(圖3)。由圖可知其聽力曲線呈現(xiàn)一個V形, 不同頻率閾值均高于130 dB。其中200—300 Hz為敏感頻率, 其中最敏感頻率是300 Hz, 其閾值約為(133±0.5) dB。

圖3 長江鱘的聽覺閾值圖Fig.3 The auditory threshold of the Yangtze sturgeon

3 討論

3.1 長江鱘的聽覺能力與其他魚類的比較

與其他魚類如湖鱘(Acipenser fulvescens)和匙吻鱘(Aspiolucius merzbacheri)等類似, 長江鱘的AEP波形也具有潛伏期, 一般由3—5個波峰組成,波形較為明顯, 在高于閾值10—20 dB時即可得到清晰的反應(yīng)波形, 且其聽覺閾值隨著刺激聲音頻率變化而不同, 這反映了長江鱘對不同頻率的選擇性。

在實驗中, 長江鱘聽覺的測試頻率只控制在500 Hz以下, 主要考慮長江鱘對500 Hz以上的聲音敏感性差, 在150 dB仍不能產(chǎn)生正常的AEP波形。Keyon等[8]于1998年測定了金魚(Carassius auratusLinnaeus)的聽覺閾值, 發(fā)現(xiàn)金魚可以聽到100—5000 Hz的聲音, 最低聽閾為64.0 dB。而Lovell等[9]在2006年測定了鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)的聽覺閾值, 結(jié)果表明, 鰱和鳙可以聽到100—3000 Hz的聲音, 鰱的最低聽閾為104.2 dB, 鳙的最低聽閾為105.7 dB。與上述魚類相比(圖4), 長江鱘的聽覺頻率較窄, 聽覺閾值較高,聽覺曲線呈“V”型, 而非“U”型, 其聽力閾值不存在一個明顯的頻率區(qū)間, 這可能與本實驗刺激頻率區(qū)間較窄有關(guān); 另外, 可能與長江鱘的聲壓感受較弱有關(guān)。而鯉形目和鲇形目魚類具有韋伯氏器等聽覺輔助器官, 對聲壓較為敏感, 因此它們的聽覺能力具有較寬的頻譜和較低的閾值。長江鱘為典型的底棲魚類, 沒有聽覺輔助器官, 因此對低頻聲壓和振動信號更為敏感[10]。此外, 長江鱘的耳石是較為松散的耳砂, 也可能影響其聽覺能力[11]。

圖4 長江鱘與其他魚類聽覺閾值的比較(引自Keyon T, Lovell J M, Halvorsen M B)Fig.4 Comparison of auditory threshold between Yangtze River sturgeon and other fish (Quoted from Keyon T, Lovell J M,Halvorsen M B)

目前, 鱘類的聽力閾值的研究僅有湖鱘(Acipenser fulvescens)和匙吻鱘(Aspiolucius merzbacheri)的相關(guān)報道[11]。湖鱘的聽覺閾值為200 Hz 130.5 dB, 匙吻鱘的聽覺閾值為300 Hz 133 dB。本研究中長江鱘的聽力閾值為300 Hz (133±0.5) dB, 與湖鱘和匙吻鱘的結(jié)果較為接近。

有研究表明[12], 部分鱘在繁殖季節(jié)是通過聲音進行交流的。在繁殖季節(jié), 不同的鱘屬發(fā)出的聲音是不同的, 可分為“尖叫”“啾啾”“敲”和“呻吟”四種類型的聲音, 且研究發(fā)現(xiàn)表明, 如密蘇里鏟鱘和密西西比鏟鱘在其繁殖期間產(chǎn)生的“敲”和“呻吟”聲的頻率分別為160和370 Hz, 這恰好處于鱘可聽見的頻率范圍內(nèi)[12]。因此在繁殖季節(jié)嘗試觀察記錄長江鱘是否會發(fā)聲, 以及通過聲音誘導(dǎo)其繁殖行為是一種值得探索的途徑。

3.2 長江水下噪聲對長江鱘產(chǎn)生的影響分析

近年來, 隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展, 長江大壩建設(shè)、港口、橋梁修建、航道整治、采砂及船舶通航都會產(chǎn)生水下噪聲[13], 噪聲的存在不僅會破壞長江魚類的聽覺, 也會引起行為學(xué)的變化, 如無法準(zhǔn)確對獵物進行定位、無法及時躲避天敵等, 甚至?xí)?dǎo)致魚類逃離產(chǎn)卵場從而影響自然繁殖。

Celi等[14]的研究則指出人為噪音對魚的多項生化指標(biāo)有消極影響: 試驗以大西洋鯛(Sparus aurata)為研究對象, 測定船只噪音對試驗魚促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇、血糖、乳酸、血細胞比容和熱休克70 kD 蛋白等10個血液指標(biāo)的影響。10d的噪音暴露試驗結(jié)果顯示, 噪音幾乎對所有評估的血液指標(biāo)都有巨大的影響, 各指標(biāo)出現(xiàn)顯著升高。Voellmy等[15]研究發(fā)現(xiàn), 暴露于船只噪音之下的三刺魚(Gasterosteus aculeatus)和米諾魚(Phoxinusphoxinus)攝食大水蚤(Daphnia magna)的數(shù)量明顯減少, 并表現(xiàn)出更多的驚嚇反應(yīng), 其中三刺魚的捕食失誤率明顯增加, 而米諾魚的靜止時間增加,攝食積極性下降。而橋梁建設(shè)過程中的打樁噪聲及水下爆破等甚至?xí)苯訉?dǎo)致魚類的器官及組織受損, 進而導(dǎo)致死亡[16]。Codarin等[17]研究發(fā)現(xiàn), 保護區(qū)內(nèi)游艇發(fā)出的噪音對于當(dāng)?shù)? 種主要魚類的聽覺閾值有極大的影響, 尤其對于魚類用于交流的聽力頻段影響尤為顯著。魚類的很多行為都與聲音有關(guān), 例如交配、獵食和定位等等。噪音會掩蔽魚類重要的聽覺信號, 干擾魚類對正確信息的接收,做出錯誤的抉擇, 導(dǎo)致獵食活動失敗[17]。長此以往魚類會因攝食不足而影響健康狀況。因此, 噪聲的存在對于魚類的影響是多方面存在的。

作者曾在2019年12月對長江宜昌江段上的船舶通行和背景噪聲進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn), 在該時間段內(nèi)的江段中, 監(jiān)測到的噪聲聲壓級均在135 dB左右, 均大于長江鱘的聽覺閾值, 部分水域達到了163.58 dB,遠大于長江鱘的聽覺閾值。長江鱘的鰾屬于管鰾型, 通過氣動管連接到腸道, 從而使魚從水中獲取大量氣體或驅(qū)逐空氣快速調(diào)整魚鰾內(nèi)空氣的體積[16],在遭遇到脈沖刺激時, 可以快速地通過減少魚鰾內(nèi)的氣體體積來達到避免傷害的目的[18]。船舶噪聲的來源是多方面的, 不僅包括船舶行駛過程中產(chǎn)生的噪聲, 也包括發(fā)動機, 船體振動等均會產(chǎn)生噪聲[19,20], 這些噪聲的存在勢必會對長江鱘的聽覺產(chǎn)生影響。

在對湖鱘和匙吻鱘的研究中[11], 其采用大規(guī)模的聲場去產(chǎn)生大規(guī)模的粒子運動使得測試鱘魚能“聽”見聲音, 而打樁就是一個典型的產(chǎn)生振動的過程, 其產(chǎn)生的振動能被鱘魚清晰感知, 并通過鰾內(nèi)氣體的交換來規(guī)避傷害。因此, 對于振動在水下產(chǎn)生的大規(guī)模粒子運動可能會更易被長江鱘識別感知, 在后續(xù)的研究中, 還需探尋長江鱘對于粒子運動的感知情況, 可以采用更多的水下?lián)P聲器去形成更大的粒子運動場來觀察長江鱘對于粒子運動的敏感性, 也可以采用振動的方式去觀測長江鱘對于振動的敏感性, 從而判斷振動噪聲對于長江鱘的影響。

長江鱘是長江水生生態(tài)系統(tǒng)健康狀況的重要指示生物, 是長江水生生物多樣性保護的旗艦物種和保護物種。本研究將對長江鱘的野外放歸和種群重建提供重要基礎(chǔ)資料, 填補了我國鱘魚類聽力研究的數(shù)據(jù), 同時可以對涉漁工程建設(shè)運行對長江鱘類影響評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。