于 茹 趙立嶺 李娥娥 陳明翠 趙 立 郭陳剛 于家峰* 曹贊霞*

（山東省生物物理重點實驗室，德州學(xué)院生物物理實驗室，德州 253023）

細(xì)菌中I型毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)一般是由兩個基因組成的單個操縱子。其中，毒素基因編碼穩(wěn)定的毒素蛋白，其過表達可抑制細(xì)菌生長或?qū)е录?xì)菌死亡；抗毒素基因編碼不穩(wěn)定的抗毒素分子小RNA（small RNA，sRNA），其一般通過配對與毒素蛋白的mRNA相互作用，抑制毒素蛋白mRNA的翻譯和/或誘導(dǎo)其降解［1］。I型TA系統(tǒng)在細(xì)菌基因組中廣泛存在，在人類微生物群系中也能發(fā)現(xiàn)部分I型毒素蛋白如TisB、Hok等，其生物功能和細(xì)菌的生物進化密切相關(guān)，包括促進耐藥菌形成、抑制細(xì)菌生長或引發(fā)細(xì)菌程序性死亡等［2］。I型TA系統(tǒng)中的毒素蛋白通常是小的疏水跨膜蛋白（一般<60個氨基酸），具有預(yù)測的α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，不同的毒素蛋白生物活性各不相同。當(dāng)細(xì)菌正常生長時，抗毒素分子的存在會阻止毒素蛋白的活性，TA系統(tǒng)不會對細(xì)菌產(chǎn)生任何威脅作用。但當(dāng)細(xì)菌受營養(yǎng)、壓力、毒性、低氧、高溫、抗生素等外界環(huán)境脅迫時，不穩(wěn)定的抗毒素分子轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)或者被快速降解，引起I型毒素蛋白在細(xì)菌中過量表達并累計。這時游離的毒素蛋白與其作用靶標(biāo)結(jié)合，抑制細(xì)菌中多個重要的細(xì)胞過程，減緩細(xì)菌的生長甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此I型TA系統(tǒng)能在細(xì)菌的生長、生存過程中發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括強的紅細(xì)胞毒性或抗菌功能、促進持留菌形成或抑制細(xì)菌生長及導(dǎo)致細(xì)菌休眠等。盡管對I型TA系統(tǒng)的研究已有數(shù)十年之久，但對其生物學(xué)功能和潛在分子機制的解析仍然滯后。當(dāng)前針對細(xì)菌研究的熱點是在細(xì)菌基因組中尋找新穎TA系統(tǒng)并對其結(jié)構(gòu)特征、功能及作用機制等進行研究，這些研究既為耐藥細(xì)菌的治療帶來機遇，又為新型抗菌藥物的研發(fā)帶來思路。

1 I型毒素-抗毒素系統(tǒng)的生物學(xué)功能

大多數(shù)I型毒素蛋白的作用被認(rèn)為類似于噬菌體孔蛋白，即誘導(dǎo)細(xì)胞膜成孔，這會影響ATP合成，進而影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。極少數(shù)I型毒素是核酸酶，如RNase SymE和DNase RalR［3-4］。目前關(guān)于I型TA系統(tǒng)的研究主要集中在腸道細(xì)菌和病原菌中，如革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）［5］、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）［6］、鼠 傷 寒 沙 門 氏 菌 （Salmonella typhimurium）［7］、梨 火 疫 病 原 菌 （Erwinia amylovora）［8］，及革蘭氏陽性菌：艱難梭狀芽胞桿菌（Clostridium difficile）［9］、金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）［10］、枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）［11］、糞 腸 球 菌（Enterococcus faecalis）［12］、鼠 李 糖 乳 桿 菌 （Lactobacillus rhamnosus）［13］等。對I型TA系統(tǒng)的研究主要包括3方面：a.通過生物信息學(xué)方法在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挖掘潛在的新穎I型TA系統(tǒng)；b.利用實驗方法分析I型TA系統(tǒng)中抗毒素分子sRNA抑制毒素蛋白功能發(fā)揮的機制；c.實驗方法分析I型TA系統(tǒng)中毒素蛋白可能的作用靶標(biāo)和生理功能。表1和表2中列出了部分常見革蘭氏陰性菌和陽性菌中定位于細(xì)胞膜的I型TA系統(tǒng)及其生物功能、作用機制，并利用TMPRED［14］預(yù)測了毒素蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。

Table 1 Target，biological function and mechanism of type I TA system in Gram-negative bacteria表1部分I型TA系統(tǒng)在革蘭氏陰性菌中的靶標(biāo)、生物功能及作用機制

續(xù)表1

Table 2 Target，biological function and mechanism of type I TA system in Gram-positive bacteria表2部分I型TA系統(tǒng)在革蘭氏陽性菌中的靶標(biāo)、生物功能及作用機制

續(xù)表2

續(xù)表2

1.1 革蘭氏陰性菌I型TA系統(tǒng)

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，是I型TA系統(tǒng)中研究最廣泛的細(xì)菌之一。在模式生物大腸桿菌中已證實有20種I型TA系統(tǒng)［5］，其中18種TA系統(tǒng)中的毒素蛋白作用靶標(biāo)為細(xì)胞膜（分別為DinQ、HokA、HokB、HokC、HokD、HokE、IsbA、IsbB、IsbC、IsbD、IsbE、LdrA、LdrB、LdrD、PndA、ShoB、TisB、ZorO），另兩種SymE和RalR毒素蛋白靶標(biāo)不同，是作為核酸酶來介導(dǎo)毒性的［3-4］。第一對被鑒定的I型TA基因是大腸桿菌中R1質(zhì)粒的hok/sok位點，其中Hok是毒素蛋白，sok是抗毒素sRNA［15］。hok mRNA的半衰期較長，而sok sRNA的半衰期較短。當(dāng)細(xì)胞分裂發(fā)生時，未繼承R1質(zhì)粒的子細(xì)胞將由于sok sRNA的快速降解和更穩(wěn)定的hok mRNA翻譯而死亡。Hok家族毒素蛋白通過破壞膜的完整性，從而殺死細(xì)菌［16］。研究發(fā)現(xiàn)，部分Hok蛋白可以通過調(diào)節(jié)膜去極化的水平，使細(xì)菌以可逆休眠的形式持續(xù)存在。Gerdes［17］提出一種穩(wěn)態(tài)調(diào)控機制調(diào)節(jié)HokB水平，使膜去極化不會導(dǎo)致細(xì)胞活力的不可逆損失，其過程為：由于抗毒素分子sokB的RNase E活性與膜締合相關(guān)，假設(shè)膜去極化可能會使RNase E失活，提高sokB的表達量，從而抑制HokB的翻譯，遵循這一原理的反饋機制將提供一種保護措施，將HokB的膜去極化作用限制在抑菌水平。與HokB類似，Ldr家族毒素蛋白和TisB毒素蛋白均是在內(nèi)膜上形成小孔，導(dǎo)致膜滲漏，降低質(zhì)子動力和ATP水平，從而抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終阻礙細(xì)菌的生長，促進持留菌的形成［18］?？苟舅胤肿觬dl調(diào)控Ldr轉(zhuǎn)錄后水平，而RNA istR-1則通過與翻譯起始區(qū)上游的待定核糖體競爭抑制TisB毒素的翻譯［19］。毒素蛋白DinQ不僅可以使細(xì)胞膜去極化致使細(xì)菌死亡，同時還可以促進DNA壓縮成為類似擬核的結(jié)構(gòu)或者高級的纖維狀結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞喪失活力［20］。Elizabeth團隊［21］獲得5個Ibs毒素蛋白，都具有抑制細(xì)菌生長的功能，其中抗毒素分子sibC可以防止ibsC的過量表達而導(dǎo)致的毒性作用［22］。與其作用機制類似的還有pndA/pndB、shoB/ohsC和zorO/orzoTA系統(tǒng)中的毒素蛋白［21，23-24］，且ZorO在發(fā)揮細(xì)胞毒性作用時沒有形成明顯的大孔隙［25］。此外，RNase III是一種雙鏈核糖核酸酶，對切割成對的毒素-抗毒素復(fù)合物（包 括hok/sok、tisB/istR、zorO/orzO）至 關(guān)重要［23，26-27］。

幽門螺桿菌可以通過多種獨特策略來調(diào)節(jié)其基因表達以適應(yīng)人體胃內(nèi)的生存環(huán)境。Vogel課題組［28］通過全基因組測序和生物信息學(xué)技術(shù)分析了幽門螺桿菌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)存在4個保守型I型TA系統(tǒng)家族（A、B、C、D）在其染色體上表達，其中由A類TA系統(tǒng)的5組同源表達模塊（aapA1/IsoA1、aapA3/IsoA3、aapA4/IsoA4、aapA5/IsoA5、aapA6/IsoA6）構(gòu)成了一個新的染色體編碼的I型TA系統(tǒng)家族。隨后，Darfeuille課題組［29］通過實驗方法首次描述了aapA1/IsoA1系統(tǒng)的作用特征及調(diào)控機制。aapA1基因的全轉(zhuǎn)錄本是翻譯失活的，其3'端加工處理后可翻譯獲得一條長度為30個氨基酸的疏水性毒性蛋白；同時IsoA1sRNA抗毒素直接靶向毒素基因的翻譯起始區(qū)，阻止其翻譯且加速其降解。AapA1毒素蛋白在幽門螺桿菌中的表達導(dǎo)致其由螺旋形細(xì)菌向圓球菌的快速形態(tài)轉(zhuǎn)化，且生長停滯并進入休眠狀態(tài)，這是一種有活力但不可培養(yǎng)狀態(tài)，是比持留狀態(tài)更深程度的休眠。AapA1毒素蛋白是第一個被鑒定的圓球菌形成效應(yīng)物，它以幽門螺桿菌的細(xì)胞內(nèi)膜為靶點但不破壞其內(nèi)膜。在沒有IsoA3抗毒素的情況下，AapA3毒素蛋白在染色體上的表達可以導(dǎo)致幽門螺桿菌死亡。IsoA3通過形成穩(wěn)定的RNA雙鏈，在翻譯水平上抑制aapA3的組成性表達；且研究表明單核苷酸替換就足以阻礙AapA3毒素翻譯，如A40T改變了aapA3 mRNA結(jié)構(gòu)，從而阻止其正常翻譯［30］。

沙門氏菌是一種食源性致病菌，迄今為止在其中發(fā)現(xiàn)8種大腸桿菌同源的I型TA系統(tǒng)（分別為Hok、IsbA、IsbB、LdrA、LdrB、TisB、SymE、TimP）。其中，SymE和IsbB均未檢測到抑制細(xì)菌生長的作用，而Hok、IsbA、LdrA、LdrB和TisB均表現(xiàn)出抑制細(xì)菌生長的現(xiàn)象［7］。TimP毒素蛋白作用在細(xì)胞膜上的機制與Hok和TisB等毒素不同，其N端為一個跨膜信號肽，通過其將多肽直接插入細(xì)胞膜，過表達timP會導(dǎo)致生長抑制和膜滲漏?？苟舅豻imR是一種反義sRNA，通過與timP 5'UTR結(jié)合來抑制其翻譯［31］。

梨火疫病菌是一種典型的引起蘋果和梨等植物毀滅性火疫病的植物致病菌。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的梨火疫病菌I型TA系統(tǒng)是hok/sok。該Hok毒素與大腸桿菌HokB序列同源性為48%，實驗表明其也可以通過破壞細(xì)胞膜的去極化從而殺死細(xì)菌。另外研究還表明，梨火疫病菌Hok在激活A(yù)TP生物合成和激發(fā)細(xì)菌細(xì)胞對細(xì)胞膜和抗生素?fù)p傷的耐受性方面發(fā)揮重要作用。Hok的低水平表達也激活了與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的多個基因，并觸發(fā)了噬菌體休克蛋白基因pspA的表達，從而起到保護梨火疫病菌細(xì)胞免受進一步膜應(yīng)激源傷害的作用［8］。該研究表明，應(yīng)激調(diào)控是TA系統(tǒng)在細(xì)菌中低水平表達條件下的重要選擇優(yōu)勢。

1.2 革蘭氏陽性菌I型TA系統(tǒng)

艱難梭狀芽胞桿菌是一種醫(yī)學(xué)上重要的人類腸道病原體，被認(rèn)為是導(dǎo)致成人抗生素相關(guān)性院內(nèi)腹瀉的主要病原菌。Olga研究組揭示了這類細(xì)菌上多 組I型TA系 統(tǒng)（CD0440.1/CD630_n00150、CD0904.1/RCd13、CD0956.2/RCd10、CD0956.3/RCd14、CD0977.1/RCd11、CD1233.1/SQ808、CD1418.2/CD630_n00500、 CD2299.1/SQ1641、CD2517.1/RCd8、CD2889/RCd12、CD2907.1/RCd9）的特征［8-9，32-33］。這類毒素蛋白都跟細(xì)胞膜相關(guān)，能抑制細(xì)菌生長并促進其休眠。這類毒素蛋白疏水的N端高度保守，帶正電荷的C端區(qū)域含有豐富的賴氨酸，且與其他細(xì)菌的I型毒素蛋白沒有序列同源性。

金黃色葡萄球菌是一種重要病原菌，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起的感染范圍從淺表感染到危及生命的炎癥和敗血癥。在金黃色葡萄球菌中已發(fā)現(xiàn)多種I型TA毒素蛋白，包括Fst、PepA1、PepA2、SprG1、SprG2、SprG3和SprG4及其抗毒素分子sRNA。Fst毒素蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成孔洞，破壞細(xì)胞壁，裂解活性強。SprG1毒素蛋白既不導(dǎo)致穿孔也不導(dǎo)致破裂，而是通過增加細(xì)胞壁的分隔影響細(xì)胞分裂［34］。SprG1 RNA編碼兩條長度不同的毒性小肽SprG131和SprG144，SprG144的N端存在更多的正電荷殘基使得其裂解紅細(xì)胞的能力要高于SprG131，而SprG131抗菌能力更強?？苟舅胤肿覵prF1 sRNA一方面可以跟毒素蛋白的mRNA相互結(jié)合，抑制其翻譯成毒素蛋白SprG1；另一方面跟核糖體相互作用，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致金黃色葡萄球菌持留菌的形成［10］。SprG的額外拷貝能編碼兩個較短的毒素蛋白（SprG2和SprG3），其過表達導(dǎo)致金黃色葡萄球菌生長停滯而不是死亡。這幾組同源TA系統(tǒng)之間存在交叉調(diào)控作用，例如當(dāng)SprF2或SprF3過度表達時，SprG2和SprG3在生長期間均無法檢測到；另外，SprF1、SprF2或SprF3的表達都可以抑制SprG1的毒性作用［35］。PepA1不僅對自身細(xì)胞具有毒害作用，而且可以作為毒素殺死其他細(xì)菌及溶解人類紅細(xì)胞。與PepA1不同，PepA2具有破壞真核生物細(xì)胞膜的巨大潛能，表現(xiàn)為很強的細(xì)胞毒性，對人紅細(xì)胞的作用大約是PepA1的10倍［36］，而對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的作用不是很強。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)孫寶林課題組［37］一直致力于研究金黃色葡萄球菌中的毒素-抗毒素系統(tǒng)，其報道了一個由毒素、抗毒素和轉(zhuǎn)錄因子3個基因組成的I型TA系統(tǒng)，其中的毒素蛋白具有選擇性地抑制細(xì)胞生長并阻礙細(xì)胞膜上多重耐藥外排泵norA的功能。

糞腸球菌是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一，是一種重要的醫(yī)院病原菌。FstpAD1是位于糞腸球菌質(zhì)粒上的I型毒素蛋白，體外實驗顯示，其既無細(xì)胞毒性和溶血特性，也不具有抗菌肽類似功能，但過表達后會導(dǎo)致類核凝聚、染色體分裂和細(xì)胞分裂缺陷，進而導(dǎo)致膜通透性增加［38］。FstEF0409是位于糞腸球菌染色質(zhì)上的I型毒素蛋白，表現(xiàn)有細(xì)胞毒性。FstEF0409的表達可降低sRNA抗毒素的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄水平，具體毒素機制尚不清楚，但可以確定其發(fā)揮功能方式與FstpAD1不同［12］。此外，變異鏈球菌中Fst-Sm/srSm I型TA系統(tǒng)的過量產(chǎn)生會降低持久性細(xì)胞對細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的耐受水平［39］。鼠李糖乳桿菌中Fst類似物L(fēng)pt與細(xì)胞膜的作用被認(rèn)為是通過一種類似洗滌劑的機制，通過膠束化去除雙分子層的小塊，破壞磷脂層的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制、類核凝聚和細(xì)胞膜完整性受損［13］。

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，因易在枯草浸汁中繁殖而得名。2005年在枯草芽孢桿菌染色體上首次鑒定出I型TA系統(tǒng)TxpA-ratA［40］。TxpA基因編碼一種含有59個氨基酸的毒素蛋白，該蛋白質(zhì)N端有一個預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，C端有帶電的氨基酸，可以直接影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解。BsrG/SR4是第一個發(fā)現(xiàn)的溫度敏感型I型TA系統(tǒng)。BsrG不影響膜的通透性，而是誘導(dǎo)膜的異常拓?fù)?，使膜連續(xù)內(nèi)陷，最終導(dǎo)致自溶［41］。BsrE RNA和BsrG RNA的二級結(jié)構(gòu)非常相似，然而與SR4不同，SR5是一種單功能抗毒素，它只能通過招募RNase III促進BsrE毒素mRNA的降解［42］，SR6則可以同時抑制毒素蛋白yonT和yonJ的表達［43］。雖然RNase III對大腸桿菌的生長不是必需的，但在枯草芽孢桿菌中，該基因的缺失是致命的。Durand等［44］研究表明，RNase III在枯草桿菌中的重要性在于它能裂解I型毒素TxpA、BsrE和yonT。有趣的是，枯草芽孢桿菌中BsrG/SR4的RNA被RNase III剪切，而毒素的抑制并不需要這種核糖核酸酶［42］。此外，BsrH/as-BsrH與TxpA/ratA位于同一基因間區(qū)域，但BsrH對RNase III不敏感［45］。因此，盡管RNase III在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的I型TA系統(tǒng)中發(fā)揮作用，但其抑制作用的重要性在不同的系統(tǒng)中可能是不同的。

絕大部分I型TA系統(tǒng)中的毒素蛋白（除SymE和RalR外）以細(xì)胞膜作為靶標(biāo)，但它們靶向細(xì)胞膜時所發(fā)揮的生物學(xué)功能是多樣而復(fù)雜的，對其作用機制的系統(tǒng)研究有利于理解其功能。

2 I型毒素蛋白的結(jié)構(gòu)特征

I型毒素蛋白作用機制的復(fù)雜性和生物功能的多樣性遠(yuǎn)超預(yù)期，揭示其作用機制的關(guān)鍵是解析其在細(xì)胞膜中的三維結(jié)構(gòu)［2］。但I型毒素蛋白在脂質(zhì)雙分子層中并不是形成單一穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而是存在多個亞穩(wěn)態(tài)，且這些不同構(gòu)象態(tài)之間處于動態(tài)平衡。此外，I型毒素蛋白在脂質(zhì)雙分子層中易聚集，存在多種不同的組裝機制，從而導(dǎo)致其可能在細(xì)胞膜中形成不同結(jié)構(gòu)進而影響其功能。這些I型毒素蛋白作用的特異性使得實驗方法解析其在細(xì)胞膜中的結(jié)構(gòu)特征存在很多困難。

2.1 I型毒素蛋白單體結(jié)構(gòu)

迄今為止，已有5種I型毒素蛋白單體的結(jié)構(gòu)被報導(dǎo)（圖1）：AapA1（PDB 6GIG［46］）、PepA1（PDB 4B19［47］）、FstpAD1（PDB 2KV5［12］）、LdrD（PDB 5LBJ［48］）和SprG131（PDB 7NS1［2］）。AapA1毒素蛋白在40%TFE溶液的分子結(jié)構(gòu)中，S9~L28傾向于形成α螺旋結(jié)構(gòu)，N端的8個氨基酸則處于完全無序的狀態(tài)。C端的兩個帶正電荷殘基K29、R30對小肽的毒性影響很大，V26A突變雖然不能改變小肽的結(jié)構(gòu)和帶電情況，但對其細(xì)胞毒性有很大影響。PepA1毒素蛋白含有30個氨基酸，作用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜上。當(dāng)PepA1以α螺旋跨膜形式插入細(xì)胞膜時，會由不連續(xù)螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)榭裳由斓倪B續(xù)螺旋結(jié)構(gòu)，并通過在膜上形成孔洞結(jié)構(gòu)以破壞細(xì)胞膜的完整性，最終引發(fā)細(xì)菌死亡或紅細(xì)胞裂解。PepA1的N端呈無序狀態(tài)，C端富含精氨酸。FstpAD1毒素蛋白含有33個氨基酸，以α螺旋形成跨膜結(jié)構(gòu)，而C端7個氨基酸殘基以無序狀態(tài)存在于細(xì)胞之內(nèi)。LdrD具有α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，并與磷酸膽堿膠束結(jié)合而不改變其大小。有趣的是，LdrD在其C端結(jié)構(gòu)域有兩個保守的陽離子氨基酸，這種情形與AapA1相同并對AapA1毒性有重要影響。SprG131肽采用單孔折疊構(gòu)象。在大多數(shù)情況下，膜相關(guān)的I型毒素蛋白通過去極化和/或與細(xì)胞內(nèi)ATP下降相關(guān)的滲透作用干擾膜的完整性，并顯示其毒性。只有兩種I型毒素HokB和TisB，已經(jīng)被實驗證實在細(xì)胞膜上形成孔洞。與TisB導(dǎo)致細(xì)菌死亡不同，HokB的孔隙形成直接與持留菌形成相關(guān)。如果它們不形成孔隙，這些I型毒素肽結(jié)合到膜的表面，會引發(fā)類似于抗菌肽的洗滌劑效應(yīng)。大多數(shù)I型毒素蛋白單體具有相似的序列特征及保守的α螺旋結(jié)構(gòu)，但以上關(guān)于I型毒素蛋白單體實驗結(jié)構(gòu)的研究，并不能解釋為何這些具有相似序列特征及保守α螺旋結(jié)構(gòu)的毒素蛋白在靶向細(xì)胞膜時卻具有不同的生物學(xué)功能。因此，將I型毒素蛋白-細(xì)胞膜作為一個整體研究對象，考慮蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-脂質(zhì)之間的相互作用并解析其動態(tài)結(jié)構(gòu)才能有助于對其作用機制的理解。

2.2 I型毒素蛋白組裝機制

大部分I型毒素蛋白序列短、疏水性強、溶解性差，在細(xì)胞膜中易聚集，且不同毒素蛋白的序列之間沒有同源性。因此，利用傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗方法解析這類蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜中的結(jié)構(gòu)存在很多困難。毒素蛋白/多肽破壞細(xì)胞膜的方式主要有以下兩類。第一類是跨膜孔模型，毒素蛋白/多肽在細(xì)胞膜上形成“桶-板”或“環(huán)孔”型孔洞破壞細(xì)胞膜；第二類是非孔模型，毒素蛋白/多肽在細(xì)胞膜表面形成“地毯”裂解脂質(zhì)雙分子層。目前，只有兩種I型毒素HokB和TisB，有相關(guān)實驗研究其組裝機制和可能的跨膜結(jié)構(gòu)。大腸桿菌毒素蛋白HokB是由49個氨基酸殘基組成的單跨膜蛋白，其中C端帶負(fù)電位于細(xì)胞周質(zhì)，N端帶正電位于胞質(zhì)。該蛋白質(zhì)中有3個半胱氨酸殘基（C9、C14和C46），現(xiàn)已證實C9和C14位于跨膜區(qū)，C46暴露。Michiels團隊［49］的系列研究揭示，氧化還原酶DsbA可以催化兩個單體的C46間形成的二硫鍵，從而穩(wěn)定HokB二聚體的結(jié)構(gòu)并使其多聚化形成孔洞結(jié)構(gòu)；這些孔洞導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化和ATP的泄漏，從而形成持留菌；細(xì)胞膜上的HokB蛋白越多，持留菌的休眠期越長。HokB孔洞的大小及活性對膜電位敏感，低膜電位傾向于形成中間孔類型，高膜電位傾向于形成成熟孔類型，但是現(xiàn)有實驗研究不能區(qū)分中間孔洞與成熟孔洞的區(qū)別［49］。脅迫條件消失后，細(xì)菌的復(fù)蘇過程是由HokB的單體化及降解和細(xì)胞膜的重新極化共同控制的：氧化還原酶DsbC還原多聚體中的二硫鍵使HokB單體化，從而破壞孔洞；孔洞被破壞后胞內(nèi)的電子傳遞鏈?zhǔn)辜?xì)胞膜重新極化并生成ATP，導(dǎo)致胞內(nèi)pH降低，從而激活蛋白酶DegQ降解單體化的HokB［49］。大腸桿菌毒素蛋白TisB是由29個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，其中帶大量正電荷殘基［48］。實驗及分子動力學(xué)模擬表明，插入細(xì)胞膜的TisB通過由4個鹽橋組成的電荷拉鏈組裝成反平行二聚體［50］，并通過反平行二聚體-二聚體形成四聚體束的形式垂直插入膜中［51］，形成直徑很小的陰離子選擇性孔洞結(jié)構(gòu)［48］；組成孔洞結(jié)構(gòu)的跨膜四聚體通過一種規(guī)則動態(tài)的鹽橋和氫鍵來穩(wěn)定［51］，四聚體中的兩親螺旋與細(xì)菌內(nèi)膜相互作用，從而破壞跨內(nèi)膜的pH梯度，進而破壞跨膜質(zhì)子動力勢并耗盡ATP，使細(xì)菌進入休眠并形成生物膜［51］。第二類作用機制中，毒素蛋白通過其所帶正電荷殘基與磷脂膜中帶負(fù)電荷的頭部基團發(fā)生相互作用，使得膜張力發(fā)生改變；當(dāng)毒素蛋白積累到一定濃度，膜張力使細(xì)胞膜變薄，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂。毒素蛋白/多肽破壞/影響細(xì)胞膜的作用機制非常復(fù)雜，揭示其作用機制的關(guān)鍵是解析其三維結(jié)構(gòu)。因此將多肽-細(xì)胞膜作為一個整體研究對象，考慮多肽-多肽或多肽-脂質(zhì)之間的相互作用并解析其動態(tài)結(jié)構(gòu)才能有助于對其作用機制的理解。

3 分子動力學(xué)模擬能研究I型毒素蛋白-細(xì)胞膜體系結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及作用機制

I型TA系統(tǒng)中，毒素蛋白序列結(jié)構(gòu)特征以及細(xì)胞膜組成是影響毒素蛋白作用機制及生物功能的兩個重要因素。例如，PepA1和PepA2毒素蛋白有50%的序列同源性，其N端都富含疏水氨基酸，C端富含帶正電荷氨基酸。但這兩個毒素蛋白的功能差異顯著，PepA2對人紅細(xì)胞的毒性作用大約是PepA1的10倍，PepA1不僅對自身細(xì)胞具有毒害作用，而且可以作為毒素殺死其他細(xì)菌。為何序列相似的兩個毒素蛋白其功能卻差異顯著？PepA1毒素蛋白以跨膜α螺旋形式在細(xì)胞膜上形成孔洞結(jié)構(gòu)而破壞膜的完整性，最終引發(fā)細(xì)菌死亡或紅細(xì)胞裂解，其孔洞的形成路徑及結(jié)構(gòu)特征仍不清楚。另外，AapA1毒素蛋白能在不破壞細(xì)胞膜的情況下，使幽門螺桿菌由螺旋形細(xì)菌向圓球菌轉(zhuǎn)化，且使其生長停滯并進入休眠狀態(tài)，是否細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變影響其轉(zhuǎn)運？I型毒素蛋白-細(xì)胞膜體系具有較大的作用特異性，這使得生物信息學(xué)預(yù)測軟件及常規(guī)實驗方法在研究其序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及作用機制方面存在很多困難。由于分子動力學(xué)模擬能夠觀察研究對象結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，有利于上述問題的研究，因而該方法被認(rèn)為是研究蛋白質(zhì)/多肽-細(xì)胞膜體系的動態(tài)結(jié)構(gòu)及其作用機制的重要工具。Steinbrecher等［50］基于常規(guī)的粗?；M，研究了TisB毒素蛋白在DMPC細(xì)胞膜表面或以跨膜形式存在時的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)TisB毒素蛋白單體會很快結(jié)合到細(xì)胞膜表面，其二聚體的跨膜結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定。Schneider等［51］將粗?；Ｐ团c全原子模擬結(jié)合，研究了TisB毒素蛋白二聚體及四聚體在POPC細(xì)胞膜里的孔道結(jié)構(gòu)、特征及關(guān)鍵相互作用，認(rèn)為TisB毒素蛋白會在反平行二聚體基礎(chǔ)上形成四聚體結(jié)構(gòu)（圖2）。Sayed等［47］基于常規(guī)的全原子模擬，研究了PepA1單體在DPPC膜里的跨膜結(jié)構(gòu)特征。Korkut等［46］利用模擬方法研究了AapA1單體以跨膜形式在POPC膜內(nèi)部和POPC/POPG膜表面的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)AapA1單體的跨膜結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定。這些模擬工作通常是將單個或多個毒素蛋白放在細(xì)胞膜表面或直接以跨膜螺旋的形式放在細(xì)胞膜內(nèi)部，以研究毒素蛋白-細(xì)胞膜體系的結(jié)構(gòu)特征，包括細(xì)胞膜性質(zhì)和多肽構(gòu)象的變化，多肽濃度、殘基突變及不同細(xì)胞膜對相互作用的影響，毒素蛋白所形成孔洞結(jié)構(gòu)的大小性質(zhì)，不同細(xì)胞膜成份如何影響孔洞結(jié)構(gòu)等。受采樣方法和采樣時間限制，這類模擬研究很難直接觀察到毒素蛋白在細(xì)胞膜中的多種自由能極小狀態(tài)及可能形成的不同大小的孔洞結(jié)構(gòu)。

4 總結(jié)與展望

I型毒素蛋白（除SymE和RalR毒素蛋白外）單體具有相似的序列特征（序列長度為20~65個氨基酸的疏水多肽）及保守的α螺旋結(jié)構(gòu)，但它們靶向細(xì)胞膜時所呈現(xiàn)的生物學(xué)功能是多樣而復(fù)雜的。實驗證實的生物功能主要分為以下3類：a.有細(xì)胞毒性或殺菌功能；b.促使持留菌形成或抑制細(xì)胞生長；c.致細(xì)菌形態(tài)變化但不破壞細(xì)胞膜完整性。I型TA系統(tǒng)通過多種復(fù)雜的作用機制發(fā)揮多樣生物學(xué)功能，對其作用機制的系統(tǒng)研究既能夠給耐藥細(xì)菌的治療帶來機遇，又為新型抗菌藥物的研發(fā)帶來思路。

對I型TA系統(tǒng)作用機制及生物功能的理解，能加強對耐藥菌形成機制及調(diào)控機制的認(rèn)識，為耐藥細(xì)菌的治療提供新的途徑。I型毒素蛋白作用機制復(fù)雜多樣，目前已知的一種作用機制是在細(xì)胞膜上形成孔洞結(jié)構(gòu)，造成膜電位的下降或細(xì)胞膜的破壞，從而抑制ATP的合成或?qū)е录?xì)菌死亡。這些孔洞結(jié)構(gòu)的大小、性質(zhì)及特征是影響其作用機制的關(guān)鍵因素。另一種可能的作用機制是毒素蛋白作用在細(xì)胞膜上，改變細(xì)胞的形狀，導(dǎo)致細(xì)胞進入休眠狀態(tài)。

細(xì)胞膜相關(guān)的I型毒素蛋白被認(rèn)為是設(shè)計新的抗菌藥物的先導(dǎo)化合物，對I型毒素結(jié)構(gòu)的解析有利于認(rèn)識其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，從而推進抗菌藥物和新型抗生素研發(fā)的進程。在體外培養(yǎng)基內(nèi)加入SprG131、SprG144和SprA1對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有殺菌作用［52-53］。SprA1毒素的特殊化學(xué)修飾能極大地提高其在人血清中的抗菌潛力和穩(wěn)定性，具有一定的耐藥性，同時大大降低了其對人細(xì)胞的毒性，證實了毒素可以轉(zhuǎn)化為強效抗生素［54］。ZorO毒素中ALLRL肽段對革蘭氏陽性菌，包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌，均有抗菌作用［55］。此外，作為抗菌劑研發(fā)的候選藥物DinQ，已證實對治療大腸桿菌感染具有療效［56］。

大部分I型毒素蛋白以細(xì)胞膜作為靶標(biāo)，在脂質(zhì)雙分子層中并不是形成單一穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而是存在多個亞穩(wěn)態(tài)，且這些不同構(gòu)象態(tài)之間處于動態(tài)平衡。并且，I型毒素蛋白在脂質(zhì)雙分子層中易聚集，存在多種不同的組裝機制，從而導(dǎo)致其可能在細(xì)胞膜中形成不同結(jié)構(gòu)進而影響其功能。但是，目前對I型毒素蛋白的作用機制及影響其作用機制的關(guān)鍵序列及結(jié)構(gòu)因素依然知之甚少。尋找新穎I型TA系統(tǒng)并對其結(jié)構(gòu)特征、功能及作用機制進行研究是當(dāng)前針對細(xì)菌的研究熱點，但實驗方法很難解析I型毒素蛋白在細(xì)胞膜中的結(jié)構(gòu)。因此，如何基于機器學(xué)習(xí)及分子動力學(xué)模擬發(fā)展一套適用于I型毒素蛋白-細(xì)胞膜體系的計算模擬方法，揭示I型毒素蛋白-細(xì)胞膜體系的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系是系統(tǒng)研究其作用機制的有效途徑。