王 茜 ，鄧益琴，孫承文，林梓陽，蘇雯曉，劉夢瑤，程長洪，郭志勛，馮 娟

1. 天津農學院，天津 300392

2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/農業(yè)農村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380

維氏氣單胞菌 (Aeromonas veronii)，隸屬于氣單胞菌屬[1]，是一種革蘭氏陰性短桿菌[2]，普遍存在于水環(huán)境中[3-4]，可引起草魚 (Ctenopharyngodon idella)、羅非魚 (Tilapia mossambica) 等多種淡水魚類患病[5-6]，常表現(xiàn)出體表潰爛、腹腔充血和臟器不同程度出血等癥狀，嚴重時可導致其死亡[7]；同時，維氏氣單胞菌引發(fā)的魚病具有傳染性強、死亡快的特點[8-9]，可造成巨大經(jīng)濟損失。除了會危害多種魚類外，維氏氣單胞菌還可導致青蝦 (Macrobrachium nipponense) 和中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis) 等甲殼類動物出現(xiàn)“軟殼病”[10]；造成林蛙 (Rana amurensis) 的“紅腿病”等；還會引起人類的腹瀉、胃腸炎、腦膜炎等[11-12]，是一種人、獸以及水生動物共患的條件致病菌[13]。

維氏氣單胞菌具有多種與其致病性相關的因子[14-15]，如鞭毛蛋白、密度感應系統(tǒng) (Quorum sensing, QS) 和Ⅲ型分泌系統(tǒng) (Type Ⅲ secretion system, T3SS) 等，在細菌的致病過程中起到重要作用[16]。T3SS是一個由內外膜環(huán)、尖針和轉位子組成的納米注射器樣系統(tǒng)[17-18]，可以將毒性蛋白直接注射到宿主細胞的細胞質中，進而負責毒力因子的轉運[19]，是維氏氣單胞菌目前研究最多的分泌系統(tǒng)。Sha等[20]通過構建缺失突變體，其毒性和致病性降低，證明了它作為毒力因子的作用。ascF基因調控的蛋白是T3SS系統(tǒng)的重要組成部分，與其致病性密切相關，溫度、鹽度及pH等不同環(huán)境因子會影響T3SS基因的表達，進而影響其致病能力[21]。鞭毛蛋白是氣單胞菌重要的毒力因子之一，是TOLL樣受體5 (TLR5) 的重要配體，從而介導細菌的黏附和入侵[22]。Tian等[23]剖析了鞭毛結構，表明鞭毛蛋白可以黏附在宿主表面形成生物膜，有助于效應蛋白穿透宿主細胞結構，揭示了鞭毛參與細菌運動和致病機制等。fliE基因編碼形成的蛋白位于鞭毛蛋白的桿狀結構，可以和FlgB蛋白相互作用，起到穩(wěn)定和激活作用[24-25]，對于鞭毛蛋白分泌、鞭毛裝配和TLR5誘導的促炎反應至關重要[26]。QS 是細菌細胞間常見的一種通訊機制[27]，能夠通過分泌一些小分子自誘導物 (Autoinducer, AI) 相互感知[28]，造成細菌致病性的改變[29]。luxR基因編碼的家族調控蛋白在細菌群體感應信號系統(tǒng)中起到樞紐作用，可以參與到細菌發(fā)光、QS調控、致病性及生物膜形成等多個生物學過程中[30]。

對嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila) 的研究表明，環(huán)境因子可能與細菌的致病機制相互作用，導致細菌毒力和抗性增加，其毒性的表達受溫度、pH及營養(yǎng)物質等外界環(huán)境因子影響[31]。然而，目前關于不同環(huán)境條件對維氏氣單胞菌的重要致病因子表達及其致病性影響的研究較少。本文通過實時熒光定量PCR技術檢測2株維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR基因對溫度、pH、培養(yǎng)轉速、無機鹽離子等環(huán)境條件的響應，探究環(huán)境因子對毒力因子致病機制的影響，為進一步探究外界環(huán)境條件對維氏氣單胞菌致病性的影響，分析其致病機制，并建立維氏氣單胞菌病的預警模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

維氏氣單胞菌菌株分離自廣東省珠海市某花鱸養(yǎng)殖場，對分離到的菌株進行革蘭氏染色，通過16S rDNA通用引物和gyrB基因引物進行分子鑒定，進一步對斑馬魚 (Danio rerio) 進行攻毒感染實驗。經(jīng)過分子鑒定分析得到2株不同分子分型的強毒株18BJ181 (菌A)、18BW235 (菌B)，通過攻毒感染實驗表明兩者對斑馬魚的毒力具有一定差異，故選為實驗菌株進行后續(xù)實驗。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

本實驗所用的主要試劑有逆轉錄試劑盒 (Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ，艾科瑞生物)，熒光定量反應試劑盒 (SYBR Green ProTaqHS預混型qPCR試劑盒，艾科瑞生物)，Trizol (TRNzol Universal總RNA提取，天根科技公司)，RNAlater固定保存液 (賽默飛科技有限公司)，硫酸銅 (CuSO4)、硫酸亞鐵 (FeSO4)、硫酸鋅 (ZnSO4)、硫酸鎂(MgSO4) (廣州化學試劑公司)；胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth, TSB) 培養(yǎng)基 (廣東環(huán)凱生物科技有限公司)。

1.3 菌株活化與培養(yǎng)

將實驗室凍存的維氏氣單胞菌液于TSA培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)24 h，再挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)過夜，測定菌液的OD600，同時用平板計數(shù)法測定活菌濃度。

1.4 菌株毒力因子對環(huán)境因素的響應

1.4.1 對溫度的響應

將過夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，分別在25、28和31 ℃下，180 r·min-1、不添加無機鹽離子的條件下培養(yǎng)，每組設置3個平行。培養(yǎng)14 h后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.4.2 對 pH 的響應

將過夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，每個pH設置3組平行。28 ℃、180 r·min-1、不添加無機鹽離子的條件下培養(yǎng)14 h。然后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.4.3 對無機鹽離子的響應

將過夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于添加5 g·L-1的無機鹽離子 [亞鐵離子 (Fe2+)、銅離子 (Cu2+)、鎂離子 (Mg2+)、鋅離子 (Zn2+)] 的含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r·min-1的條件下培養(yǎng)，每組設置3個平行。培養(yǎng)14 h后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.4.4 對培養(yǎng)轉速的響應

將過夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，分別在不同轉速150、180、210、240 r·min-1下，28 ℃、不添加無機鹽離子下培養(yǎng)，每組設置3個平行。培養(yǎng)14 h后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.5 RNA的提取及cDNA合成

將上述樣品取出后，按照Trizol法提取菌液的RNA。依照Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ說明書合成cDNA，作為熒光定量PCR模板。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)各毒力因子的DNA序列設計qPCR特異性引物 (表1)，內參基因為16S rDNA。根據(jù)SYBR Green ProTaqHS預混型qPCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)分析

以16S rDNA為內參，根據(jù)2-ΔΔCT法計算各毒力因子的相對表達量，結果用Excel 2016軟件做柱狀圖，同時用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 毒力因子對溫度的響應

溫度是影響維氏氣單胞菌生長的重要因素，本實驗設定的25～31 ℃對維氏氣單胞菌的生長無顯著影響，培養(yǎng)14 h后其菌量均可達到 (2～3) ×109CFU·mL-1。由于在適宜的溫度范圍內，菌A的asc-F和fliE基因總體沒有較大差異 (圖1)，fliE基因對溫度呈現(xiàn)“凸”型響應模式，在28 ℃時響應最高，而在25和31 ℃下表達量較低；luxR基因對溫度的響應較為明顯，在28 ℃時表現(xiàn)出較高的表達量。菌B的ascF和fliE基因對較低溫度 (25 ℃)響應比較明顯，表達量顯著高于28和31 ℃；fliE基因對溫度的變化呈現(xiàn)“凹”型模式。這與菌A的表達模式不同，而luxR對溫度的響應則同菌A一致。

圖1 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因對溫度的響應注：*. 與對照組相比，具有顯著差異 (P＜0.05)；**. 與對照組相比，具有極顯著差異 (P＜0.01)。后圖同此。Fig. 1 Responses of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to temperatureNote: *. Significant difference compared with the control group (P＜0.05); **. Very significant difference compared with the control group (P＜0.01). The same case in the following figures.

2.2 毒力因子對pH的響應

2株菌的ascF、fliE和luxR基因對pH的響應見圖2。ascF、fliE和luxR基因在pH為6.5偏酸性條件時的表達量較高，當pH升高至8.0偏堿性條件時，表達量有所降低，同細菌生長的最適pH介于7.0～7.5并不一致，說明在較高的菌濃度中，毒力因子對pH的響應同細菌本身的生長無關。有意思的是，2株菌的ascF基因的表達模式相同，而fliE和luxR基因的響應模式有較大差異，其中菌B對pH響應較強，而菌A響應較弱。

圖2 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因對pH的響應Fig. 2 Response of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to pH

2.3 毒力因子對無機鹽離子的響應

圖3為2株菌的ascF、fliE和luxR基因對無機鹽離子種類的響應。與不添加無機鹽離子的對照組相比，分別添加 5 g·L-1Fe2+、Cu2+、Zn2+和 Mg2+的實驗組對維氏氣單胞菌的生長具有顯著的抑制作用，培養(yǎng)14 h后其菌量僅有108CFU·mL-1。ascF、fliE和luxR基因在添加Zn2+和Mg2+時的表達量較高，對于Fe2+則呈現(xiàn)負響應模式；菌A和菌B對Zn2+的響應模式不同，菌A響應較強，菌B則較弱；與Zn2+不同的是，2株菌的ascF、fliE和luxR基因對Cu2+響應模式的差異在于菌B有較強的響應，而菌A響應較弱。

圖3 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因對無機鹽離子的響應Fig. 3 Response of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to ions

2.4 毒力因子對轉速的響應

轉速主要與培養(yǎng)基中的溶解氧相關，同時也代表一定情況下細菌接觸和利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質的不同生長情況。2株菌的生長對轉速的響應表現(xiàn)不太一致，菌A在低轉速情況下其生物量顯著低于高轉速，而菌B對轉速的響應則無顯著差異。同時，2株菌的3個基因在對培養(yǎng)轉速的響應上表現(xiàn)出很大差異 (圖4)。整體而言，ascF基因的表達量普遍偏低，其差異并不顯著；菌A的fliE基因的表達量較低，而菌B則表現(xiàn)出對于高轉速的負響應；luxR基因對于轉速有最優(yōu)響應范圍，菌A為210 r·min-1，菌 B為 150 r·min-1。

圖4 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因對轉速的響應Fig. 4 Response of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to rotating speed

3 討論

本實驗以2株維氏氣單胞菌的ascF、fliE和luxR致病因子為研究對象，通過實時熒光定量PCR技術從轉錄水平上研究了3個基因對溫度、pH、轉速和無機鹽離子等環(huán)境因子的響應，并探究了維氏氣單胞菌的致病性和環(huán)境條件間的關系。結果顯示：維氏氣單胞菌的ascF、fliE和luxR毒力因子的表達受環(huán)境因子調控，在偏酸性 (pH 6.5～7.0)、中低轉速 (150～210 r·min-1) 及 Zn2+、Mg2+環(huán)境下，3種基因對環(huán)境條件的變化為正響應模式，相對表達量上調；而在偏堿性 (7.5～8.0)、高轉速 (240 r·min-1) 和 Fe2+、Cu2+環(huán)境下，3種基因的表達受抑制，呈現(xiàn)負響應模式。

外界環(huán)境的pH變化可能會影響細菌生物膜的功能，如T3SS的跨膜轉運功能，進而對毒力基因表達量產(chǎn)生影響[32]。2株維氏氣單胞菌的ascF和fliE毒力基因在pH為8.0偏堿性條件下的表達量比pH為6.5和7.0的要低，表明其對低pH為正響應，即在偏酸環(huán)境中，菌株更具有侵襲性，其致病性更強。在對嗜水氣單胞菌的毒力基因表達研究中也發(fā)現(xiàn)，菌株的4種毒力基因在中性或偏酸性條件下均得以表達，在堿性條件下只有1種毒力因子得以表達[33]，這與本文結果相似；Roy等[32]通過研究在不同溫度和pH下沙門氏菌 (Salmonella) 生物膜的形成表明，偏堿性環(huán)境下 (pH 7.0～8.0) 其生物膜更容易形成，且毒力基因的表達也有明顯提高，此結論與本文研究結果恰恰相反，表明不同菌種的致病機制可能有所差異。

環(huán)境溫度影響是細菌生長繁殖及毒力因子表達最重要的因素之一，其變化會影響細菌體內多種重要蛋白的分泌及轉運，導致細菌毒力因子表達的變化。本實驗中，2株菌的3個基因對溫度的響應有明顯差異，luxR基因在28 ℃時表達量較高，菌A的ascF基因在31 ℃表達量最高，fliE毒力基因在28 ℃時表達量最高；而菌B的ascF和fliE毒力因子在25 ℃時表達量最高，菌B對溫度變化的響應偏低。也有研究表明，溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) T3SSvscO基因的表達對溫度存在顯著的響應[34]，銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) T3SS基因的表達受環(huán)境因子調控，環(huán)境因子通過影響cAMP (環(huán)磷酸腺苷) 在細胞內的表達水平從而調節(jié)其功能[35]。本實驗的維氏氣單胞菌ascF基因的表達則呈現(xiàn)典型的個體差異，說明了T3SS對溫度響應的多樣性。

本實驗中，當轉速調節(jié)至240 r·min-1時，培養(yǎng)基中的溶解氧增高，細菌接觸培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質的表面積增加，致使細菌擴增速度增加，細菌生物量增多，進而導致細菌間密度增大，這可能降低了LuxR蛋白的C端與目的基因轉錄起始區(qū)域的特異性結合及轉錄功能，促進了QS的抑制作用，進而導致維氏氣單胞菌的luxR基因表達量降低。對海參中的一種腐敗菌蜂房哈夫尼菌 (Hafnia alvei)的研究表明，當改變外界環(huán)境因素時，其分泌的AI含量及活性均有不同程度的改變，證實了QS具有密度依賴性，與環(huán)境條件改變相關并呈現(xiàn)規(guī)律性變化[36]。本實驗中，在pH為8.0的偏堿性及31 ℃環(huán)境下，維氏氣單胞菌的luxR毒力基因的表達量均比pH為7.5和28 ℃時的表達量低，表明在偏堿性及31 ℃的環(huán)境下，維氏氣單胞菌的QS可能受到了影響，導致其生物膜形成、毒力的轉運及表達功能受到抑制，從而使luxR基因的表達量下降[37]。

本研究通過探究維氏氣單胞菌的ascF、fliE和luxR 3種致病因子在不同環(huán)境條件下基因表達量的變化表明，3種致病因子的表達受環(huán)境因素的調控，并呈現(xiàn)規(guī)律性變化，當外界環(huán)境改變時，細菌可通過自身系統(tǒng)的改變調節(jié)相關基因的表達，進而避免不利環(huán)境的影響。通過探究致病因子對不同環(huán)境條件的響應，可為進一步探究外界環(huán)境對維氏氣單胞菌致病性的影響，分析其發(fā)病機制提供一定的理論依據(jù)，為建立維氏氣單胞菌病的預警模式開拓新的思路。