冷應(yīng)激對黑鯛組織損傷及細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響

衛(wèi)明亮 ，張志偉 ，張志勇，林志杰 ，祝 斐，賈超峰，孟 乾，徐大鳳，張曹進(jìn)

1. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306

2. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007

水溫作為環(huán)境中的應(yīng)激源之一，會(huì)直接或間接影響魚類的生理和行為[1]。水溫降低時(shí)，魚類為適應(yīng)低溫會(huì)通過多種調(diào)節(jié)方式使機(jī)體內(nèi)環(huán)境再次平衡[2]。一旦魚類的調(diào)節(jié)系統(tǒng)無法滿足其基本需求時(shí)，低溫將造成魚類致死性損傷[3]。研究表明，冷應(yīng)激可能會(huì)對魚類產(chǎn)生組織學(xué)損傷并影響其正常的生理功能，這種組織學(xué)損傷是機(jī)體對外部應(yīng)激源的重要反應(yīng)[4-6]。為了抵御低溫，魚類肝臟中富含的谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、甘油三酯(TG) 及總膽固醇 (T-CHO) 等物質(zhì)維持了生物體穩(wěn)態(tài)平衡[7-12]。因此，通過檢測這些生理生化指標(biāo)，可指示魚類肝臟在急性低溫脅迫下是否產(chǎn)生損傷[13-14]。同時(shí)，冷應(yīng)激也會(huì)引起多細(xì)胞生物體產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，將不需要的或受損的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控移除，這種現(xiàn)象是由生物體為適應(yīng)環(huán)境而自主進(jìn)行的調(diào)控[15]。目前，細(xì)胞凋亡途徑中內(nèi)在的線粒體途徑是國內(nèi)外一條較為精確的研究途徑，此途徑由線粒體中細(xì)胞色素c (Cyto-c) 的釋放引發(fā)。在此途徑中，apoptotic protease activating factor-1基因(apaf-1基因) 是凋亡酶激活因子，可以激活細(xì)胞凋亡相關(guān)酶；促凋亡bcl-associated x基因 (bax基因)與抗凋亡b-cell lymphoma-2基因 (bcl-2基因) 可以調(diào)控線粒體中Cyto-c等凋亡因子的釋放參與凋亡途徑[16-21]。Smac/Diablo蛋白定位于線粒體，與連鎖凋亡抑制蛋白家族結(jié)合后，抑制抗凋亡活性從而實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)凋亡；cysteinyl aspartate specific proteinase-3基因 (caspase-3基因) 是在線粒體凋亡途徑中執(zhí)行最后步驟的凋亡基因[22-23]。cysteinyl aspartate specific proteinase-1基因 (caspase-1基因) 是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要基因，通過招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白與caspase-1前體蛋白結(jié)合，形成炎性體復(fù)合物進(jìn)而激活細(xì)胞炎癥反應(yīng)[15]。這些基因均是參與細(xì)胞凋亡途徑的重要基因，其表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化可以說明機(jī)體是否發(fā)生細(xì)胞凋亡。

黑鯛 (Acanthopagrus schlegelii) 隸屬鱸形目、鯛科、棘鯛屬，因其具有廣溫、廣鹽等特性，在我國沿海地區(qū)均有分布，是我國沿海重要的經(jīng)濟(jì)魚類[24-25]。黑鯛適宜的生長水溫為15～25 ℃，當(dāng)水溫低于5 ℃則無法長期生存[26]。因此在江蘇地區(qū)養(yǎng)殖黑鯛無法進(jìn)行室外自然越冬。為解決這一問題，通常采取室內(nèi)越冬或者鍋爐升溫等方式，但這些方法會(huì)增加養(yǎng)殖成本，并限制黑鯛相關(guān)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此選育耐低溫品種已逐漸成為黑鯛養(yǎng)殖業(yè)的重點(diǎn)研究方向，而黑鯛低溫適應(yīng)相關(guān)機(jī)制研究是重中之重[27-28]。本研究評(píng)估了冷應(yīng)激下黑鯛不同組織(肝臟、腮、肌肉) 的結(jié)構(gòu)變化，肝臟的生理生化指標(biāo) (AST、ALT、TG、T-CHO) 變化以及肝臟中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 (apaf-1、bax、bcl-2、caspase-1、caspase-3、diablo) 的表達(dá)水平變化，以為解析黑鯛低溫適應(yīng)機(jī)制提供理論支持，并為海洋魚類耐低溫性狀選育提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以提高選育精確性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取300尾規(guī)格相近、健康無傷的黑鯛幼魚，體長為 (11.3±1.7) cm、體質(zhì)量為 (39.6±5.3) g，實(shí)驗(yàn)用魚均取自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所繁育的苗種。幼魚暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)用的長條水泥池中，水溫為15 ℃，溶解氧質(zhì)量濃度≥6 mg·L-1，24 h連續(xù)充氧，定期換水，每日固定時(shí)間投喂1次。暫養(yǎng)2周后，隨機(jī)挑選健康黑鯛幼魚270尾，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；正式實(shí)驗(yàn)開始前禁食1 d。

1.2 降溫處理

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將水溫從15 ℃快速降至4 ℃時(shí)，短時(shí)間內(nèi)黑鯛幼魚出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，挑選3個(gè)長3.9 m×寬2.6 m×高0.9 m的長條水泥池，分別設(shè)置為15 ℃對照組、10 ℃處理組、5 ℃處理組。每個(gè)水泥池中各放入3個(gè)同等規(guī)格的網(wǎng)箱，即每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)平行組，每個(gè)網(wǎng)箱中放入30尾黑鯛。利用冷循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行降溫，10與5 ℃處理組采用逐級(jí)降溫的方式。從15 ℃開始降溫(2 ℃·h-1)，降至 11 ℃ 后，以 1 ℃·h-1的速度降至各處理組預(yù)設(shè)溫度。在15、10和5 ℃各個(gè)溫度點(diǎn)保持24 h后進(jìn)行取樣。取樣前先用MS-222將黑鯛快速麻醉后解剖，每個(gè)溫度點(diǎn)取3尾魚的腮、肌肉、肝臟固定于4%多聚甲醛中，另取6尾魚的肝臟置于1.5 mL離心管中，液氮快速冷凍后于-85 ℃保存。實(shí)驗(yàn)期間，水溫的溫差維持在 ±0.5 ℃，24 h連續(xù)充氧。

1.3 石蠟組織切片觀察

流水沖洗多聚甲醛固定的肝臟、肌肉和鰓，用70%～95%的乙醇依次進(jìn)行脫水處理。經(jīng)二甲苯透明，石蠟包埋、脫蠟處理等步驟后，用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行染色以及切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為5～6 μm，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4 肝臟生理生化指標(biāo)的測定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒對黑鯛肝臟中的AST、ALT、T-CHO及TG進(jìn)行檢測。

1.5 肝臟組織RNA的提取與cDNA的合成

肝臟組織RNA的提取采用柱式動(dòng)物組織總RNA抽提試劑盒 (上海生物工程有限公司，B518651)，將提取的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量 (電壓180 V，時(shí)間25 min)，用Nanodrop儀器檢測純度 (OD260/280) 和濃度。根據(jù)MightyScript第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生物工程有限公司，B639251)的說明書進(jìn)行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.6 熒光定量PCR

利用本實(shí)驗(yàn)室前期測序獲得的黑鯛全基因組數(shù)據(jù)[29]，獲取黑鯛的apaf-1、bax、bcl-2、caspase-1、caspase-3、diablo基因CDS序列，用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR檢測的上、下游引物，并由上海生物工程有限公司合成。以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。熒光定量試劑采用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 試劑盒 (TIANGEN公司)，用ABI 7300 plus熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)體系：1 μL cDNA 模板 (5 ng·μL-1)，0.6 μL上、下游引物 (10 μmol·L-1)，17.8 μL SuperReal Pre-Mix Plus (SYBR Green) 試劑盒。三步法反應(yīng)程序：預(yù)變性1個(gè)循環(huán)的條件為95 ℃，15 min；PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)的條件為變性95 ℃，10 s；退火50～60 ℃，20 s；延伸72 ℃，31 s，且在此階段進(jìn)行熒光信號(hào)采集。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用2-△△Ct法計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析后目的基因的相對表達(dá)量。各個(gè)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示，利用單因素方差分析 (One-way ANOVA)對同一時(shí)間不同溫度組間進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和檢驗(yàn)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Origin 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及繪圖。

2 結(jié)果

2.1 冷應(yīng)激對黑鯛肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

15 ℃對照組的肝細(xì)胞形狀類似卵圓形或四邊形，細(xì)胞間連接的方式清晰可見，體積較大，細(xì)胞核呈圓球形且位于中央或邊緣 (圖1-a)。10 ℃時(shí)細(xì)胞為不規(guī)則的幾何形狀，細(xì)胞緊密連接方式可見，部分區(qū)域的肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核位于細(xì)胞內(nèi)一側(cè)并出現(xiàn)固縮現(xiàn)象；肝細(xì)胞整體染色變淺 (圖1-b)。5 ℃時(shí)肝細(xì)胞為不規(guī)則的幾何形狀，部分細(xì)胞核消失不見或呈現(xiàn)收縮狀，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，空泡化現(xiàn)象加重 (圖 1-c)。

2.2 冷應(yīng)激對黑鯛鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

15 ℃對照組中鰓絲的中間血管清晰可見，鰓小片分布在鰓絲兩側(cè) (圖1-d)。鰓小片中間分布著微血管即為鰓血竇，線粒體豐富細(xì)胞主要分布在鰓小片基部，扁平上皮細(xì)胞在鰓小片表面清晰可見。與15 ℃對照組相比，10 ℃處理組的線粒體豐富細(xì)胞的數(shù)量增多，鰓小片收縮變細(xì)，毛細(xì)血管出現(xiàn)充血現(xiàn)象 (圖1-e)。5 ℃處理組的血竇間隙增大，部分扁平上皮細(xì)胞脫落，線粒體豐富細(xì)胞減少，鰓小片斷裂、萎縮嚴(yán)重，毛細(xì)血管充血現(xiàn)象嚴(yán)重 (圖1-f)。

2.3 冷應(yīng)激對黑鯛肌肉組織結(jié)構(gòu)的影響

15 ℃對照組的肌纖維呈長柱型 (圖1-g)。與對照組相比，10 ℃處理組的肌纖維間隙增大，肌原纖維之間產(chǎn)生空隙 (圖1-h)。5 ℃處理組大部分肌纖維斷裂，并出現(xiàn)縱向開裂、肌原纖維散亂現(xiàn)象，部分肌纖維溶解并暴露出細(xì)胞核 (圖1-i)。

圖1 冷應(yīng)激對黑鯛肝臟、腮、肌肉組織結(jié)構(gòu)的影響 (10×40 倍)注：a. 肝臟，15 ℃ 對照組；b. 肝臟，10 ℃ 處理組；c. 肝臟，5 ℃ 處理組；d. 腮，15 ℃ 對照組；e. 腮，10 ℃ 處理組；f. 腮，5 ℃ 處理組；g. 肌肉，15 ℃ 對照組；h. 肌肉，10 ℃ 處理組；i. 肌肉，5 ℃ 處理組。Fig. 1 Effects of cold stress on tissue structure of liver, gill and muscle of A. schlegelii (10×40 times)Note: a. Liver, 15 ℃ control group; b. Liver, 10 ℃ treatment group; c. Liver, 5 ℃ treatment group; d. Gill, 15 ℃ control group; e. Gill, 10 ℃ treatment group; f. Gill, 10 ℃ treatment group; g. Muscle, 15 ℃ control group; h. Muscle, 10 ℃ treatment group; i. Muscle, 5 ℃ treatment group.

2.4 低溫脅迫對黑鯛肝臟中AST、ALT、TG、TCHO的影響

在不同的低溫環(huán)境下，黑鯛的AST、ALT、TG、T-CHO隨著溫度的降低變化趨勢各不相同。AST活性在10、5 ℃時(shí)均顯著升高 (P＜0.05)，在10 ℃時(shí)達(dá)到最大值 (P＜0.05，圖2-a)。ALT活性在10 ℃時(shí)無顯著變化 (P＞0.05)，但5 ℃時(shí)顯著升高 (P＜0.05，圖2-b)。10、5 ℃組肝臟中TG濃度顯著降低 (P＜0.05)；肝臟中T-CHO濃度在10 ℃時(shí)無顯著變化 (P＞0.05)，5 ℃時(shí)顯著升高 (P＜0.05，圖 2-c、圖 2-d)。

圖2 冷應(yīng)激對黑鯛肝臟組織的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯和總膽固醇的影響注：方柱上相同字母表示組間差異不顯著 ( P＞0.05)，不同字母表示組間差異顯著 (P＜0.05)；圖3同此。Fig. 2 Effects of cold stress on AST, ALT, TG and T-CHO in liver tissue of A. schlegeliiNote: The same letters above the column indicate no significant difference between groups (P＞0.05), while different letters indicate significant difference between groups (P＜0.05). The same case in Fig. 3.

2.5 冷應(yīng)激對黑鯛肝臟組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定不同溫度下黑鯛肝臟中apaf-1、bax、bcl-2、caspase-1、caspase-3及diablo的mRNA表達(dá)量，與對照組相比，apaf-1基因的mRNA相對表達(dá)量隨著溫度的降低呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，10 ℃時(shí)最低 (P＜0.05)，5 ℃時(shí)最高 (P＜0.05，圖3)。bax、caspase-1基因表達(dá)量在降溫過程中顯著降低 (P＜0.05)。bcl-2基因表達(dá)量在5 ℃時(shí)顯著升高 (P＜0.05)。caspase-3基因表達(dá)量在10 ℃時(shí)最高 (P＜0.05)，5 ℃時(shí)降至最低(P＜0.05)。diablo基因表達(dá)量在10與5 ℃均顯著升高 (P＜0.05)，在 10 ℃ 時(shí)達(dá)到最大值 (P＜0.05)。

圖3 冷應(yīng)激下黑鯛肝臟中apaf-1、bax、bcl-2、caspase-1、caspase-3和diablo基因的 mRNA 相對表達(dá)量Fig. 3 mRNA relative expression changes of apaf-1, bax, bcl-2,caspase-1, caspase-3 and diablo genes in liver of A. schlegelii under cold stress

3 討論

魚類作為變溫動(dòng)物，水溫時(shí)刻影響其呼吸與循環(huán)系統(tǒng)并與其生理生化指標(biāo)產(chǎn)生相關(guān)性[30]。因此，病理學(xué)研究和生理生化指標(biāo)常被用于評(píng)估魚類在低溫環(huán)境下的適應(yīng)能力[31]。

3.1 冷應(yīng)激對黑鯛組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟是魚類機(jī)體中參與多種物質(zhì)合成、貯存、代謝、轉(zhuǎn)化和分解的重要器官[32]。本研究結(jié)果顯示，黑鯛幼魚的肝臟細(xì)胞在低溫下發(fā)生顯著變化，5 ℃處理組出現(xiàn)肝細(xì)胞排列無序、細(xì)胞核固縮或碎裂、組織空泡化等現(xiàn)象。結(jié)合區(qū)又君等[33]對低溫脅迫下四指馬鲅 (Eleutheronema tetradactylum) 的肝臟結(jié)構(gòu)變化分析，推測冷應(yīng)激下黑鯛為維持機(jī)體基本生命活動(dòng)需大量能量，肝糖原或脂肪被大量氧化分解，肝臟失去自我調(diào)節(jié)能力，從而造成肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核萎縮或破碎，最后導(dǎo)致肝臟損傷。

鰓是魚類的主要呼吸器官，同時(shí)也具有排泄代謝廢物、調(diào)節(jié)滲透壓等功能[34-35]。對赤鯛 (Pagrus pagrus) 的研究表明腮損傷會(huì)隨著水溫的降低而逐漸加重，并伴隨著滲透壓調(diào)節(jié)失衡現(xiàn)象[36]。與對照組相比，5 ℃下黑鯛的鰓小片同樣出現(xiàn)了斷裂與水腫的趨勢，扁平上皮細(xì)胞逐漸脫落，損傷程度加深，無法進(jìn)行正常呼吸。這種現(xiàn)象與青鳉 (Oryzias latipes)、尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus) 的鰓部組織結(jié)構(gòu)在低溫下的變化相似[37-38]。推測當(dāng)水溫低于黑鯛的耐受閾值時(shí)，其鰓出現(xiàn)小片充血或斷裂、滲透壓調(diào)節(jié)功能失常以及呼吸功能紊亂的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致機(jī)體缺氧或死亡。

肌肉不僅是魚類的蛋白源，還是魚類在水中游動(dòng)的主要參與者[33]。黑鯛在面對低溫時(shí)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，易受驚且游動(dòng)迅速，頻繁的游動(dòng)會(huì)對肌肉組織造成一定損傷。與對照組相比，10 ℃ 下的肌纖維出現(xiàn)間隙增大、彎曲等現(xiàn)象，表明溫度驟降會(huì)影響黑鯛的肌肉結(jié)構(gòu)。當(dāng)水溫降至5 ℃ 并脅迫24 h后，肌肉出現(xiàn)肌纖維斷裂、溶解、細(xì)胞核暴露現(xiàn)象，致使黑鯛無法游動(dòng)。相關(guān)研究表明，低溫下細(xì)胞膜的流動(dòng)性會(huì)降低且其脂質(zhì)會(huì)發(fā)生過氧化損傷，此時(shí)劇烈的運(yùn)動(dòng)將導(dǎo)致細(xì)胞膜破損[39-40]。因此在降溫過程中，黑鯛頻繁游動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致部分肌細(xì)胞的細(xì)胞膜遭到破壞甚至露出細(xì)胞核。

3.2 冷應(yīng)激對黑鯛肝臟相關(guān)指標(biāo)的影響

AST和ALT在糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝過程中起到重要作用，主要存在于細(xì)胞中，在各組織器官中，心臟和肝臟中的活性最高[10-13]。本研究中，黑鯛肝臟的AST活性隨著溫度的降低先升高后下降；ALT活性在10 ℃時(shí)無明顯變化，在5 ℃時(shí)顯著升高。表明當(dāng)黑鯛在10 ℃處理后肝臟出現(xiàn)了損傷，當(dāng)溫度持續(xù)降低至5 ℃并保持24 h后，肝臟損傷加劇，部分肝細(xì)胞受損后AST可能被釋放進(jìn)入機(jī)體中導(dǎo)致活性降低。這與低溫脅迫下條紋鋸鮨 (Centropristis striata) 血清中的ALT、AST活性的變化趨勢相似[41]。結(jié)合10、5 ℃下的黑鯛肝臟組織切片(圖1-b、圖1-c)，表明黑鯛肝臟的損傷程度隨溫度的降低而加重。

TG和T-CHO是機(jī)體內(nèi)重要的能源物質(zhì)，它們主要通過肝、腸進(jìn)行合成和分泌，能夠反映合成以及攝取蛋白質(zhì)的能力[11]。本研究中的10、5 ℃處理組的TG濃度均顯著低于對照組，說明作為能源物質(zhì)的TG在降溫實(shí)驗(yàn)中被大量消耗。同時(shí)，陳旭等[13]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致魚體的代謝能力下降，各種代謝酶的活性受到抑制，TG的合成減緩。因此，10 ℃處理組黑鯛肝臟的TG濃度與5 ℃處理組相比無顯著變化。T-CHO濃度在5 ℃時(shí)顯著高于對照組和10 ℃處理組，這與溫度驟降時(shí)吉富羅非魚 (GIFTO. niloticus) 血清中T-CHO濃度變化趨勢相似[42]。推測黑鯛肝臟內(nèi)T-CHO濃度上升促進(jìn)了機(jī)體內(nèi)相關(guān)生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生，以抵御急性低溫脅迫所帶來的損傷。

3.3 冷應(yīng)激對黑鯛肝臟中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)DNA降解，細(xì)胞核固縮、碎裂，凋亡小體形成，但細(xì)胞膜保持完整，不會(huì)引起繼發(fā)炎性反應(yīng)[15]。郭曉麗等[43]在研究熱應(yīng)激對大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 心臟的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，其心臟細(xì)胞在高溫下會(huì)發(fā)生凋亡并伴隨著線粒體空泡化現(xiàn)象，電鏡下顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞。從圖1-b、圖1-c中可以觀察到，冷應(yīng)激下黑鯛肝臟細(xì)胞形態(tài)的變化符合細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)，但電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化未知。因此推測黑鯛在10、5 ℃條件下，肝臟會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。

熒光定量PCR結(jié)果表明，冷應(yīng)激對黑鯛肝臟中的apaf-1、bax、bcl-2、caspase-1、caspase-3以及diablo基因的表達(dá)量均產(chǎn)生顯著影響。在對Apaf-1-caspase-9通路進(jìn)行研究時(shí)，Bratton等[21]發(fā)現(xiàn)Apaf-1基因可以激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。因此，冷應(yīng)激可能會(huì)誘導(dǎo)黑鯛肝臟中apaf-1基因表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡途徑。秦華平等[44]通過研究深低溫情況下大鼠(Rattus norvegicus) 腦部的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)大鼠會(huì)抑制Bax基因表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞Cyto-C釋放，阻止細(xì)胞凋亡。由此推測黑鯛處于冷應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)通過調(diào)控抗凋亡基因bcl-2與促凋亡基因bax的表達(dá)，抑制或促進(jìn)肝臟細(xì)胞Cyto-C的釋放，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，10 ℃下黑鯛肝臟的促凋亡基因diablo、凋亡啟動(dòng)基因caspase-3會(huì)同時(shí)發(fā)揮作用，抑制抗凋亡蛋白并執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)損傷[22-23]。當(dāng)線粒體損傷后，細(xì)胞會(huì)將超出耐受閾值的氧化應(yīng)激給予負(fù)面的生理反饋[43]。陳自強(qiáng)等[28]發(fā)現(xiàn)急性低溫脅迫會(huì)對黑鯛肝臟抗氧化指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響。對線粒體Smac/Diablo-XIAP-Caspase-9/3凋亡途徑研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-24可能通過抑制此途徑，抑制H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞凋亡[45]。5 ℃處理組的黑鯛可能通過同樣的方式，調(diào)控肝臟中促凋亡基因diablo以及凋亡啟動(dòng)caspase-3基因的表達(dá)，以此抑制細(xì)胞凋亡，維持肝臟細(xì)胞的基本功能。而與低溫下青鳉 (Oryzias latipes)[37]腮部的細(xì)胞凋亡研究結(jié)果不同的是，黑鯛肝臟中caspase-1基因在降溫過程中始終被抑制。推測黑鯛的肝臟細(xì)胞在驟降的低溫環(huán)境中，抑制了細(xì)胞炎癥反應(yīng)，保證凋亡時(shí)細(xì)胞無炎癥發(fā)生。

4 結(jié)論

綜上所述，冷應(yīng)激下黑鯛的肝臟、腮以及肌肉的生理結(jié)構(gòu)遭受破壞，隨著溫度的降低損傷加重；冷應(yīng)激對黑鯛肝臟中AST、ALT、TG、T-CHO均產(chǎn)生了顯著的影響并誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。當(dāng)水溫低于黑鯛機(jī)體的耐受閾值時(shí)，肝臟中apaf-1、diablo基因的表達(dá)上調(diào)激活其凋亡通路，去除壞死細(xì)胞；降低bax、caspase-3、caspase-1基因的表達(dá)量并促進(jìn)bcl-2基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，盡量保證肝細(xì)胞的完整性與數(shù)量、維持肝臟的功能和穩(wěn)態(tài)。