程杏安，劉 欣，張漢輝，東方云，王彩云，李恒謙，呂曉靜，李俊杰，鄒啟文，蔣旭紅*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州 510225；2.畢節(jié)市中藥研究所，貴州畢節(jié) 551799)

刺梨(Tratt，RRT)，屬于薔薇科植物，是云貴高原等地區(qū)特有的一種植物資源。刺梨富含多種營養(yǎng)元素和功能成分，包括多糖、多酚、V、超氧化物歧化酶、黃酮、V及多種礦物質(zhì)元素。有研究發(fā)現(xiàn)，刺梨中多酚類物質(zhì)含量豐富，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要由沒食子酸、兒茶素、鞣花酸等成分復(fù)合而成，是極具開發(fā)利用價值的優(yōu)質(zhì)資源。此外，植物多酚的抗氧化能力被認(rèn)為是抑菌及防治慢性疾病的基礎(chǔ)。而提取工藝的不同會對多酚的組成和微觀結(jié)構(gòu)造成影響，因此選擇合適的提取方法不僅是提高多酚提取率的關(guān)鍵，也是維持多酚的理化、流變性、功能、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的關(guān)鍵。

多酚提取的方法有微波輔助法、有機(jī)溶劑浸提法、超聲-微波協(xié)同輔助法和生物酶提取法等，其中有機(jī)溶劑浸提法主要是利用不同酚類成分在溶劑中溶解能力的差別，通過選用合適的溶劑采用浸提的方式使目標(biāo)物質(zhì)析出；而生物酶可專一性地作用于植物胞壁與胞間的某些物質(zhì)成分，導(dǎo)致細(xì)胞壁的緊密結(jié)構(gòu)變得膨脹而疏松，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性增強(qiáng)，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)成分更易浸出。筆者采用乙醇提取法和纖維素酶提取法，分別對刺梨果肉多酚進(jìn)行提取，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，以DPPH和ABTS自由基清除率為指標(biāo)，評價了2種提取方法的抗氧化活性，旨在為刺梨的開發(fā)利用及功能性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

刺梨樣品為刺梨果期時，按規(guī)范采摘自貴州省畢節(jié)市7個縣(區(qū))的38個村莊(社區(qū))。借助手機(jī)奧維地圖選點定位各采樣點，記錄相關(guān)樣品所在經(jīng)緯度及海拔高度。共計56份樣品，分為野生、貴農(nóng)5號、貴農(nóng)7號3個品種(表1)。

2，2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2，2’-azino-bis(3-ethyl benzothia- zoline-6-sulfonic acid)，ABTS]98%，上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH]純度≥98%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；福林酚，南京都萊生物技術(shù)有限公司；纖維素酶，河南萬邦實業(yè)有限公司。

UV-2450型紫外分光光度計，美國安捷倫科技有限公司；L400臺式低速自動平衡離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

表1 畢節(jié)市7個縣(區(qū))38個村莊刺梨產(chǎn)地的環(huán)境情況

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取(0.100±0.001) g沒食子酸，5 mL 70%甲醇溶解，用超純水定容至100 mL配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)。分別移取 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，分別用超純水定容至刻度，搖勻，得到的質(zhì)量濃度分別為20、25、30、35、40、45 μg/mL。分別移取不同質(zhì)量濃度的沒食子酸工作液1 mL于10 mL 容量瓶中，加入5 mL 10%福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8 min，加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容至刻度，搖勻，室溫下靜置60 min。用10 mm比色皿，在765 nm條件下用分光光度計進(jìn)行吸光度的測定。以沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，用origin 2021軟件繪制沒食子酸濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

刺梨果肉多酚的提取工藝。

單酶提取法。產(chǎn)地赫章縣威奢鄉(xiāng)中銀村的野生刺梨在同縣區(qū)刺梨品種中多酚含量與出汁率均為最高，以其為試驗樣品，準(zhǔn)確稱取該刺梨果肉粉末放入燒杯，按試驗設(shè)置的料液比在相應(yīng)溫度下恒溫水浴，加入相應(yīng)含量的纖維素酶于刺梨樣品中提取一定時間，80 ℃下水浴滅酶2 min后，將提取液置于臺式低速自動平衡離心機(jī)中3 000 r/min離心30 min，收集上清液，記錄體積()，即得到刺梨果肉多酚提取液，測定多酚提取率。

乙醇提取法。準(zhǔn)確稱取赫章縣威奢鄉(xiāng)中銀村的野生刺梨果肉粉末放入燒杯中，配置一定濃度乙醇水溶液待用，按試驗設(shè)置的料液比將乙醇水溶液加入燒杯中，恒溫水浴提取一定時間后置于臺式低速自動平衡離心機(jī)中3 000 r/min離心30 min，收集上清液，記錄體積()，即得到刺梨果肉多酚提取液，測定多酚提取率。

單因素試驗及正交試驗設(shè)計。

單酶提取法提取刺梨多酚。以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度、纖維素酶含量為單因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取提取時間、料液比、提取溫度3個因素進(jìn)行L(3)正交試驗設(shè)計，確定最佳提取工藝。正交試驗因素與水平見表2。

表2 單酶提取法正交試驗設(shè)計

乙醇提取法提取刺梨多酚。以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度、提取溶劑種類為單因素，同時在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取溫度、提取時間3個因素進(jìn)行L(3)正交試驗設(shè)計，確定最佳提取工藝。正交試驗因素與水平見表3。

表3 乙醇提取法正交試驗設(shè)計

出汁率的測定。各組各取一部分刺梨，洗凈后常溫吹干，去除表面水分，而后進(jìn)行刺梨重量計算，得到出汁前的重量()，將其放入榨汁機(jī)中榨汁，離心去除固體物質(zhì)后，得到剩余溶液，稱重得。

Folin-Ciocalteu分光光度測定法測定不同區(qū)域刺梨多酚含量。參考譚曉舒等的方法，分別取對照品沒食子酸及待測多酚溶液，將待測多酚溶液稀釋倍后，各取1.0 mL于10 mL離心管中，分別加入5.0 mL稀釋10 倍的福林酚試劑(0.1 mol/L)，搖勻。反應(yīng)3～8 min，加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，充分混勻，黑暗處室溫放置反應(yīng)60 min。用紫外可見分光光度計在 765 nm 波長處測定吸光度值()，空白組以蒸餾水替代，每組平行測定3次。以為縱坐標(biāo)()，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)()，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程=0011 4+0014 9(=0999 6)。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測溶液中的多酚含量，結(jié)果表示為沒食子酸(gallic acid equivalents，GAE)當(dāng)量濃度，即 μg/mL 。

式中，為待測溶液測得的吸光度；為待測溶液稀釋的倍數(shù)；為提取離心后的待測溶液總體積，mL;為提取試驗稱取的刺梨樣品質(zhì)量，g。

抗氧化活性的測定。

清除DPPH自由基能力。參照陳永平等的方法，稱取8 mg DPPH到小燒杯中，加無水乙醇溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到容量瓶中用無水乙醇定容至100 mL，即0.2 mmol/L DPPH溶液配制完成。用無水乙醇稀釋多酚提取液至濃度分別為0.12、0.10、0.08、0.06、0.04 mg/mL。取2 mL稀釋后的提取液和2 mL配制好的DPPH溶液到試管中。二者在室溫黑暗處反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后在517 nm處測定，記作。樣品對照組則以無水乙醇代替DPPH測定?？瞻捉M以無水乙醇替代樣品液測定。用V重復(fù)步驟。所有試驗均重復(fù)操作3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

以沒食子酸濃度(μg/mL)為軸，以吸光度為軸，建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程=0011 4+0014 9，=0999 6，如圖1所示其線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

單酶提取法。從圖2可見，隨著料液比增加，提取率先增后減，最大值為14.48%，這可能是由于繼續(xù)增加料液比，纖維素酶的有效作用濃度被稀釋，酶解不充分，最終多酚提取率下降。溫度升高有利于加快分子間的運動，提高纖維素酶的活性，提取率最大值為14.48%，之后，由于多酚在較高溫度下可能發(fā)生氧化或者降解，且纖維素酶可能因溫度過高而失去活性，提取率下降。提取時間剛開始增加時，提取率不斷增加，之后由于提取時間過長，多酚類物質(zhì)發(fā)生了分解，使得提取率下降。乙醇濃度增大時，多酚提取率也隨之增加，之后隨著乙醇濃度繼續(xù)升高，醇溶性和親脂性強(qiáng)的雜質(zhì)溶出增多，導(dǎo)致多酚類含量下降，提取率逐漸下降。提取率隨纖維素酶含量的增加先升后降，在0.6%時達(dá)到最大值(14.90%)。這可能是由于細(xì)胞壁的分解，增大了細(xì)胞內(nèi)液與外界的接觸面積，促進(jìn)酚類物質(zhì)向溶劑中擴(kuò)散，有利于多酚浸出。但隨著纖維素酶含量的不斷增加，酶與多酚形成絡(luò)合物，使得多酚提取率下降。

圖2 單酶提取法單因素對刺梨多酚提取率的影響Fig.2 Effects of single factors on polyphenols extraction rate of Rosa roxburghii Tratt by single enzyme extraction

乙醇提取法。從圖3可見，提取率隨料液比的增加先增后減，在1∶50時，達(dá)最大值17.0%。這可能是多酚的溶出已達(dá)到飽和，溶劑體積的進(jìn)一步增加，反而促進(jìn)了其他成分的溶出，當(dāng)溶劑比例較低時，溶劑難以將多酚完全提取，增加溶劑用量，未溶解的多酚向提取劑中轉(zhuǎn)移，溶劑與原料的比值越大，濃度梯度越大，有效成分的擴(kuò)散速率也越大。由于溫度升高有利于加快分子間的運動，溶劑與刺梨粉末接觸也更加充分，因此促進(jìn)了提取率的增加，到30 ℃時，提取率達(dá)到最大，為16.34%；之后隨著溫度升高，多酚在較高溫度下可能發(fā)生氧化或者降解，提取率開始下降。提取率隨著提取時間的延長呈先增后減趨勢，在40 min時達(dá)到最大值12.33%。之后由于提取時間過長，多酚類物質(zhì)發(fā)生了分解，使得提取率開始下降。隨著乙醇濃度增大，提取率不斷升高，濃度為40%時，提取率最大，達(dá)11.85%。這是由于在乙醇濃度較低時，水溶性糖類等物質(zhì)溶出，影響多酚的提取，隨著乙醇濃度的增加，多酚與乙醇溶劑的極性越來越接近，根據(jù)相似相溶原理，多酚的提取量會增大，但乙醇溶液過高時，一些脂溶性成分也會浸出，同時乙醇與多酚類物質(zhì)極性差異變大，乙醇溶液在高體積分?jǐn)?shù)條件下會揮發(fā)出來，這些都會影響多酚的提取效果。脂溶性物質(zhì)的極性與無水乙醇最為接近，因此，溶劑種類中，無水乙醇和60%乙醇溶液提取率均高于其他溶劑，參考乙醇濃度單因素結(jié)果可知，乙醇濃度超過40%時，提取率逐漸降低，可解釋60%乙醇溶液的提取率高于無水乙醇的提取率。

圖3 乙醇提取法單因素對刺梨多酚提取率的影響Fig.3 Effects of single factors on polyphenols extraction rate of Rosa roxburghii Tratt by ethanol extraction

單酶提取法。根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，進(jìn)行L(3)正交試驗設(shè)計(纖維素酶含量作誤差列)，以確定刺梨多酚的最佳提取工藝，結(jié)果見表4。由表4可知，各因素對多酚提取率的影響表現(xiàn)為提取溫度>料液比=提取時間，刺梨果肉多酚單酶提取法的最佳提取工藝組合為提取料液比1∶50，提取溫度30 ℃，提取時間80 min。在該條件下重復(fù)3次試驗得到提取率為14.27%。

表4 單酶提取法正交試驗結(jié)果

乙醇提取法。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L(3)正交試驗設(shè)計(乙醇濃度作誤差列)，結(jié)果見表5。由表5可知，各因素對多酚提取率的影響表現(xiàn)為提取時間>提取溫度>料液比，最佳提取工藝組合為料液比1∶60，提取溫度40 ℃，提取時間50 min。該條件下重復(fù)3次試驗得到的提取率為14.47%。

由表6可知，各地區(qū)刺梨多酚含量在9.57%～44.42%，最高為納雍縣水東鎮(zhèn)鍋嘎村，達(dá)44.42%，最低為金海湖新區(qū)小壩鎮(zhèn)水井邊村，僅9.57%。各地區(qū)的刺梨出汁率分布在35.30%～83.00%，最高為大方縣黃泥塘鎮(zhèn)甘塘村，達(dá)83.00%，最低為黔西縣谷里鎮(zhèn)新陽村，僅35.30%。刺梨鮮果榨汁后可作為原汁進(jìn)行加工出售，提高經(jīng)濟(jì)效益，但刺梨成熟收獲期為30 d左右，采摘后很快會變質(zhì)腐爛，鮮果難以運輸保存。因此，需在產(chǎn)地進(jìn)行初加工，壓榨成原汁后常溫保存，不同地區(qū)刺梨出汁率的高低可作為篩選高品質(zhì)刺梨的指標(biāo)之一，作為其經(jīng)濟(jì)價值的參考。

表5 乙醇提取法正交試驗結(jié)果

表6 畢節(jié)市不同地區(qū)刺梨多酚含量與出汁率

在相同的多酚濃度下，分別測定乙醇提取法和單酶提取法所得多酚的ABTS自由基清除能力，并與V進(jìn)行對比，結(jié)果如圖4a所示。在多酚濃度小于0.4 mg/mL，通過單酶提取法所得刺梨多酚的ABTS自由基清除能力強(qiáng)于乙醇提取法所得的多酚，2種方法均強(qiáng)于相同濃度下V的清除能力。由圖4b可知，通過乙醇提取法所得刺梨多酚的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于單酶提取法，強(qiáng)于相同濃度下V的DPPH自由基清除能力。由以上結(jié)果可知，通過不同提取方法得到的刺梨多酚均對DPPH和ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除活性，可將其作為潛在的天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)利用。

3 結(jié)論

該研究采用乙醇提取法和單酶提取法對刺梨果實中的多酚進(jìn)行提取，并分別用正交試驗對這2種刺梨多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，單酶提取法的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶50，提取溫度30 ℃，提取時間80 min；乙醇提取法的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶60，提取溫度40 ℃，提取時間50 min。此外，對比2種提取方法所得刺梨多酚的抗氧化性可知，在多酚濃度小于0.4 mg/mL時，單酶提取法所得刺梨多酚對ABTS自由基清除能力強(qiáng)于乙醇提取法所得多酚；乙醇提取法所得多酚在濃度小于0.1 mg/mL時，清除率即可達(dá)到90%，且其對DPPH自由基清除能力強(qiáng)于單酶提取法所得多酚。據(jù)此可知，不同提取工藝可能會影響其抗氧化活性。

畢節(jié)市不同區(qū)域的刺梨多酚含量與出汁率結(jié)果顯示，畢節(jié)市38個地區(qū)多酚含量在9.57%～44.42%，出汁率分布在35.30%～83.00%，不同地區(qū)與品種間的刺梨多酚含量與出汁率有差異。數(shù)據(jù)顯示，貴農(nóng)品種刺梨優(yōu)于野生品種刺梨。根據(jù)畢節(jié)市不同地區(qū)采摘的刺梨多酚含量及出汁率的差異，可為后期大規(guī)模的種植、培育、加工刺梨提供科學(xué)依據(jù)。

圖4 提取方法對刺梨多酚抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of extraction method on antioxidant activity of Rosa roxburghii Tratt polyphenols