朱佳依，袁海波，滑金杰，王近近，楊艷芹，沈 帥，江用文

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，國(guó)家茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省茶葉加工工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310008)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高，飲酒人數(shù)逐年增加，急性酒精中毒的發(fā)生率隨之大幅增加，不但嚴(yán)重?fù)p害大眾健康，也非常容易產(chǎn)生許多社會(huì)問題。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇進(jìn)入機(jī)體后主要依靠肝臟代謝，由乙醇脫氫酶作用后轉(zhuǎn)化為乙醛，再在乙醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酸，從而排出體外。在乙醇的代謝過(guò)程中，會(huì)使機(jī)體氧化性應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致肝臟機(jī)體的損傷。因此，在不能立刻拒絕飲酒時(shí)，解酒保肝成為克服飲酒所帶來(lái)的傷害的又一途徑。我國(guó)的藥食同源植物資源豐富，自古以來(lái)已發(fā)現(xiàn)眾多具有解酒保肝、抗氧化功效的植物，此外由于作用獨(dú)特、方便攜帶、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，袋泡茶這一形式廣受市場(chǎng)青睞。

葛根、枳椇子是我國(guó)藥食同源物質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值十分豐富，也是經(jīng)典的解酒原料。根據(jù)《千金要方》《神農(nóng)本草經(jīng)》等古代醫(yī)藥文獻(xiàn)中記載，葛根在唐代就被用于“解酒毒”。葛根中所含的葛根異黃酮等生物活性物質(zhì)可以清除乙醇及代謝產(chǎn)物，具有解酒護(hù)肝作用。枳椇子，鼠李科植物枳椇的成熟種子，《本草綱目》等文獻(xiàn)記載，枳椇子在民間亦被廣泛用于“治酒病”。藥理研究表明，枳椇的解酒、護(hù)肝和抗病毒等作用均與其中的黃酮類成分有關(guān)，且中醫(yī)處方也驗(yàn)證兩者之間無(wú)配伍禁忌，結(jié)合使用具有止渴除煩、清濕熱、解酒毒的功效。茶葉中大量的茶多酚和茶褐素可顯著降低乙醇和乙醛濃度，提高肝中乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)酶活性，并縮短醉酒小鼠醉睡時(shí)間，咖啡堿通過(guò)興奮大腦，還可以達(dá)到“醒酒”的效果，但茶湯濃度不宜太高。羅漢果中含有的黃酮類等成分都利于解酒醒酒、保護(hù)肝臟。另外飲茶還可以稀釋酒精，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，減少酒精的吸收。但是，目前研究多集中于解酒配方的優(yōu)化，往往忽略了感官口感的需求，或局限于單一功能評(píng)價(jià)手段，缺乏全面和系統(tǒng)的研究。同時(shí)，將解酒類藥食同源原料與紅茶聯(lián)合應(yīng)用于袋泡茶方面的研究也鮮有報(bào)道。因此，該研究選擇葛根、枳椇子、紅茶和羅漢果作為配方基礎(chǔ)，以解酒活性物質(zhì)總黃酮及感官審評(píng)分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，研究解酒袋泡茶的配方優(yōu)化；通過(guò)建立急性酒精中毒小鼠模型，觀察醉酒行為學(xué)指標(biāo)以及測(cè)定血乙醇含量、肝臟生化指標(biāo)，探討葛根、枳椇子、紅茶、羅漢果混合配方解酒袋泡茶的解酒功效，為解酒茶類產(chǎn)品研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

試材。葛根(益陽(yáng)神奇草養(yǎng)生茶業(yè)有限公司)，枳椇子(深圳市泰斯古德食品實(shí)業(yè)有限公司)，羅漢果(上海梅家塢茶業(yè)有限公司)，紅茶(課題組自制)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性ICR小鼠100只，體質(zhì)量18～22 g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供，許可證號(hào)SCXK(浙)2019-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，設(shè)定室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。

藥物及試劑。海王金樽(深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20210302)；56°北京二鍋頭酒(北京二鍋頭酒業(yè)股份有限公司，批號(hào)20201118)；血乙醇(ALC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20210802)；乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20211101)；乙醛脫氫酶(ALDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20211101)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)1221221323)。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁(上海國(guó)藥，分析純)；蘆丁對(duì)照品(源葉生物科技有限公司，純度95%)。

儀器與設(shè)備。Centrifuge 5810R型離心機(jī)(Eppendorf公司)；Power Wave XS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Gene 公司)；T10型自動(dòng)組織勻漿機(jī)(IKA公司)；HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(力辰科技有限公司)；UV-1800型紫外分光光度計(jì)(島津公司)。

解酒茶的配方優(yōu)化設(shè)計(jì)。使用粉碎機(jī)將葛根、枳椇子、紅茶和羅漢果適當(dāng)粉碎過(guò)6號(hào)篩，備用。配方試驗(yàn)以感官評(píng)分(香氣、湯色、滋味)和總黃酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert中混料設(shè)計(jì)D-Optional方法對(duì)解酒茶的配方進(jìn)行優(yōu)化，確定葛根、枳椇子、羅漢果和紅茶的最佳配比。設(shè)定葛根(A)、枳椇子(B)、紅茶(C)和羅漢果(D)為4個(gè)參數(shù)，其中紅茶與羅漢果在配方中所占比例不超過(guò)50%，A + B + C + D = 100%，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后葛根、枳椇子、紅茶和羅漢果的質(zhì)量選定范圍如表1所示。

解酒茶總黃酮含量測(cè)定。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定總黃酮含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=6527 7+8×10(=0.999 4)。取配備好的解酒茶(3 g/袋)，加入150 mL 100 ℃純凈水沖泡5 min。用移液槍精確吸取1 mL解酒茶茶湯置于25 mL容量瓶中，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法得到待測(cè)樣品，在波長(zhǎng)511 nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量。

表1 各指標(biāo)的設(shè)定

解酒茶的感官評(píng)價(jià)。取制備好的袋泡茶以150 mL的100 ℃蒸餾水沖泡5 min后，組織5名品評(píng)員分別從湯色、香氣和滋味進(jìn)行品評(píng)打分。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T 24690—2018《袋泡茶》制定，并結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)進(jìn)行適當(dāng)修改(表2)。

表2 解酒茶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

動(dòng)物分組及給藥。將配制好的解酒茶在100 ℃下水浴提取，料水比為1∶10，浸提30 min，過(guò)濾，濃縮至0.8、0.4、0.2 g/mL備用。小鼠隨機(jī)分成5組，分別為模型組、解酒茶低劑量組、解酒茶中劑量組、解酒茶高劑量組、海王金樽對(duì)照組，每組10只，分別根據(jù)動(dòng)物藥理試驗(yàn)用藥折算方法，以人體劑量的10、20和40倍作為試驗(yàn)的低劑量、中劑量和高劑量組。試驗(yàn)分2次進(jìn)行，禁食不禁水12 h后，各組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥液0.02 mL/g(模型組灌胃等量水)，低劑量為4 g/kg，中劑量組8 g/kg，高劑量組16 g/kg；海王金樽對(duì)照組小鼠灌胃給予劑量為4 g/kg。30 min后，空腹灌胃給予北京二鍋頭酒(56°)0.015 mL/g。

解酒茶對(duì)醉酒小鼠的解酒評(píng)價(jià)。給予白酒后開始計(jì)時(shí)，觀察并記錄造模以及給藥期間小鼠有無(wú)死亡、嘔吐、乏力等癥狀，記錄小鼠翻正反射消失和恢復(fù)時(shí)間，計(jì)算小鼠醉倒率、醉酒潛伏期和醉酒維持時(shí)間(柔和地翻轉(zhuǎn)小鼠，使之出于仰臥位，30 s內(nèi)不能翻正則判定為醉酒，即記錄醉酒潛伏期；恢復(fù)翻身反射判定為醒酒)。

解酒茶對(duì)醉酒小鼠的酒精代謝評(píng)價(jià)。給予白酒后，每隔1 h眼眶取血，3 h內(nèi)共取血3次，室溫靜置后，2 000 r/min離心，取上清-20 ℃保存?zhèn)溆?，按照試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定血乙醇(ALC)濃度。于末次小鼠取血后處死并取肝臟，各組拍照，-80 ℃保存?zhèn)溆?，肝組織制備成肝組織勻漿，按照試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定ADH、ALDH水平。

2 結(jié)果與分析

按照軟件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)組合進(jìn)行復(fù)配，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表3。應(yīng)用 Design-expert 軟件對(duì)響應(yīng)值的試驗(yàn)值進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立感官分?jǐn)?shù)和總黃酮含量的回歸模型，回歸模型方程如下：

感官分?jǐn)?shù)=83.32A+86.32B+92.37C+84.04D

總黃酮含量=1.65A+0.49B+3.77C+0.22D

對(duì)模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總黃酮含量和感官分?jǐn)?shù)的線性模型均呈極顯著水平(<001)，判定系數(shù)()均大于0.85，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合程度良好。

表3 設(shè)計(jì)方案和結(jié)果

在混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)中可以根據(jù)三元等值線圖直觀反映各原料組分的變化對(duì)響應(yīng)值的影響。由軟件得到各原料交互作用的等高線圖和三維曲面圖。如圖 1 所示，感官評(píng)分隨著紅茶的添加量增加而明顯上升；提高枳椇子和葛根的添加量，則感官評(píng)分降低；葛根沖泡后茶湯中會(huì)帶有淡淡草木清香味，同時(shí)茶湯口感醇和，可以在規(guī)定比例內(nèi)適當(dāng)提高其用量。紅茶的添加對(duì)湯色、香氣和滋味均有較好的提升作用，但由于并不具有較強(qiáng)的解酒功效，因此需控制紅茶添加量來(lái)平衡功效和口感的協(xié)調(diào)。枳椇子泡水后帶有輕微的苦澀味，會(huì)加重茶湯的澀味，降低感官評(píng)分，但由于其可以同時(shí)賦予茶湯特有的烘烤果仁香味，可以適當(dāng)少量添加。

圖1 葛根、枳椇子、紅茶對(duì)感官分?jǐn)?shù)交互影響的等高線圖和三維曲面圖Fig.1 Contour map and three-dimensional surface map of the interaction of Radix Puerariae，Semen Hoveniae and black tea on sensory score

從圖2可以看出，當(dāng)適當(dāng)控制紅茶的添加量，提高葛根的添加比例更有利于增加茶湯中總黃酮的溶出量。響應(yīng)曲面隨著紅茶和葛根添加量增加的方向顯著傾斜，說(shuō)明紅茶和葛根添加量對(duì)茶湯中總黃酮含量影響較強(qiáng)，是解酒茶中最主要的黃酮貢獻(xiàn)組分。這與紅茶和葛根中均含有豐富的黃酮類成分有關(guān)。從圖2還可以看出，黃酮含量隨著枳椇子添加量的增加沒有明顯的增幅。枳椇子含有解酒活性物質(zhì)黃酮類化合物，如黃酮醇、二氫黃酮醇、黃酮、二氫黃酮和二倍體黃酮醇等，但推測(cè)由于果實(shí)粉碎度不高，其黃酮類成分未能在茶湯中大量溶出。

圖2 葛根、枳椇子、紅茶對(duì)總黃酮含量交互影響的等高線圖和三維曲面圖Fig.2 Contour map and three-dimensional surface map of the interaction of Radix Puerariae，Semen Hoveniae and black tea on the content of total flavonoid contents

解酒茶配方的確定優(yōu)先考慮其解酒功效，因此，以最大程度獲得活性物質(zhì)(總黃酮含量)為要點(diǎn)，根據(jù)三維曲面試驗(yàn)結(jié)果和對(duì)各組分的限制條件，使紅茶的添加量盡可能不超過(guò)50%，在保證解酒茶口感醇和的同時(shí)，賦予解酒茶良好的解酒功效。得到解酒茶配方的最優(yōu)組合為紅茶50.0%、葛根41.7%、枳椇子8.3%、羅漢果0%。根據(jù)優(yōu)化后的配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到解酒茶的總黃酮含量為26.12 mg/g，感官評(píng)分為88.10分，與預(yù)測(cè)值基本接近，說(shuō)明混料設(shè)計(jì)法在解酒茶配方設(shè)計(jì)和優(yōu)化中的應(yīng)用有效。

對(duì)小鼠給予白酒后，立刻進(jìn)行“翻正反射”試驗(yàn)來(lái)判斷醉酒與醒酒狀態(tài)，每1 min 觀察一次，造模及給藥期間小鼠無(wú)死亡、嘔吐等癥狀(圖3)。由表4可知，中劑量組和高劑量組中均有1只保持“翻正反射”現(xiàn)象，即沒醉；小鼠醉酒潛伏期從短到長(zhǎng)依次為海王金樽對(duì)照組<模型組<中劑量組<低劑量組<高劑量組。與模型組相比，解酒茶中劑量和高劑量組的醉倒率為90%；低、中、高劑量組的醉酒潛伏期均有延長(zhǎng)，平均延長(zhǎng)24.44 min，其中高劑量組顯著延長(zhǎng)(<0.01)，將醉酒時(shí)間延長(zhǎng)至69.00 min。小鼠醉酒維持時(shí)間從長(zhǎng)到短依次為模型組>海王金樽對(duì)照組>低劑量組>中劑量組>高劑量組；低、中、高劑量組的醉酒維持時(shí)間均顯著縮短(<0.01)，將醉酒維持時(shí)間縮短至62～152 min，平均縮短了205.18 min。由此可看出，解酒茶能延長(zhǎng)小鼠的醉酒潛伏期并且縮短小鼠的醉酒維持時(shí)間，對(duì)醉酒小鼠有一定的防醉和解酒作用。

圖3 小鼠急性酒精中毒高劑量組(a)和模型組(b)Fig.3 High-dose group(a)and model group(b)of acute alcoholism in mice

表4 解酒茶對(duì)小鼠急性酒精中毒的預(yù)防作用(n=10)

血液中酒精濃度也能反映酒精中毒嚴(yán)重程度。從圖4可以看出，酒精處理后的模型組小鼠血液中酒精濃度達(dá)1 913.3 mg/L。與模型組相比，解酒茶各劑量組1、2 h的血乙醇濃度都顯著降低(<0.05)，在2 h時(shí)降低至507.9～767.9 mg/L，其中中劑量組的3 h血乙醇濃度依舊顯著低于模型組(<0.01)，濃度為490.1 mg/L；海王金樽對(duì)照組僅在第1小時(shí)顯著降低血乙醇濃度(<0.01)，且在2、3 h時(shí)高于模型組。此結(jié)果表明解酒茶可顯著降低急性酒精中毒小鼠血液中的酒精含量。

從圖5可以看出，與模型組相比，解酒茶低、中、高劑量組均小幅提高了ADH活力，但并無(wú)顯著差異，海王金樽對(duì)照組顯著提高了ADH和ALDH活力(<0.05)；解酒茶高劑量組能顯著提高ALDH活力(<0.01)，表明解酒茶高劑量組能明顯提升乙醛氧化成乙酸的速度，促進(jìn)了酒精在肝臟中的分解代謝，降低乙醛對(duì)肝臟的損傷作用。試驗(yàn)結(jié)果表明解酒茶具有的解酒功效可能是通過(guò)激活肝臟ALDH 活力，加速乙醛的分解，從而降低體內(nèi)乙醇濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

注：*表示與模型組比較P<0.05；**表示與模型組比較P<0.01Note：* means P<0.05 compared with model group；** means P<0.01 compared with model group圖4 解酒茶對(duì)醉酒小鼠血乙醇濃度的影響(n=10)Fig.4 Effect of anti-alcoholism tea on serum ethanol concentration in drunken mice(n=10)

注：*表示與模型組比較P<0.05；**表示與模型組比較P<0.01Note：* means P<0.05 compared with model group；** means P<0.01 compared with model group圖5 解酒茶對(duì)醉酒小鼠酒精代謝酶活性的影響(n=10)Fig.5 Effect of anti-alcoholism tea on the activity of alcohol metabolism enzymes in drunken mice

3 討論與結(jié)論

急性酒精中毒是當(dāng)今世界的一大醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題，給人們的日常生活帶來(lái)許多嚴(yán)重危害和問題。當(dāng)飲酒后，90%以上的乙醇通過(guò)肝臟途徑代謝，首先被 ADH 氧化成乙醛，再經(jīng)過(guò) ALDH 被氧化為乙酸，最后通過(guò)三羧酸循環(huán)被分解為 CO和HO。試驗(yàn)證明，大量飲酒會(huì)對(duì)肝臟組織造成損傷，造成ADH、ALDH活性下降，進(jìn)而影響酒精代謝速度，使血液中乙醇濃度升高。因此，測(cè)量血清乙醇濃度、肝ADH、ALDH活性，能夠反映出乙醇在體內(nèi)的代謝情況以及肝臟損害程度。

該研究應(yīng)用混料設(shè)計(jì)法探索解酒茶以功效和口感為基礎(chǔ)的最優(yōu)配方，得到各原料添加的最優(yōu)比例為紅茶50.0%、葛根41.7%、枳椇子8.3%、羅漢果0%，此配方下所得袋泡茶中總黃酮含量26.12 mg/g，感官評(píng)分88.10分。沖泡后茶湯橙黃明亮，帶有淡淡果香味，口感醇正，回味甘甜。同時(shí)，還進(jìn)一步探究了解酒茶對(duì)醉酒模型小鼠醒酒能力的影響，結(jié)果顯示，解酒茶低、中、高劑量均能延長(zhǎng)醉酒潛伏期，顯著縮短醉酒維持時(shí)間，明顯改善醉酒小鼠的行為學(xué)指標(biāo)。同時(shí)，該研究測(cè)定了小鼠灌胃白酒后 1、2、3 h 的血乙醇濃度變化，結(jié)果顯示，低、中、高劑量組顯著降低了小鼠飲酒后1、2 h的血乙醇濃度(<0.05)；且中劑量組的血乙醇濃度在3 h后依舊顯著低于模型組(<0.01)，表明解酒茶能夠較好地降低血乙醇濃度，且中劑量組體現(xiàn)了良好的持續(xù)性功效。此外，肝臟生化指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果顯示解酒茶高劑量組有效增強(qiáng)了ALDH的活性，提示解酒茶可能通過(guò)提高肝臟中ALDH的水平，加快酒精的轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而起到防醉、解酒的作用，有效避免或減輕酒精造成的急性肝臟損傷。

綜上所述，該研究從配方組合、動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)和生化指標(biāo)測(cè)定這3個(gè)層面探討了葛根、枳椇子、紅茶、羅漢果復(fù)合袋泡茶的配方優(yōu)化和解酒功效，在保證解酒功效的基礎(chǔ)上，提高其香氣和口感和滋味，使其更易為市場(chǎng)接受。為今后進(jìn)一步研究解酒作用機(jī)制提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為解酒保健產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。