鄭曉楠，李婷婷，王金磊，鄭文斌，朱興全, 4*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046； 3.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室、溫州市環(huán)境衛(wèi)生微生物檢驗重點實驗室，溫州 325035；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，昆明 650201)

剛地弓形蟲()簡稱弓形蟲，它可感染幾乎所有的溫血動物，引起危害嚴(yán)重的人獸共患弓形蟲病。全世界約1/3的人慢性感染弓形蟲，感染途徑主要是攝入被弓形蟲卵囊污染的食品或含有弓形蟲包囊的肉類。不同個體感染弓形蟲的癥狀不同，免疫功能正常的人群感染弓形蟲表現(xiàn)為無癥狀；但免疫缺陷患者(例如器官移植患者、癌癥患者和HIV感染患者等)感染弓形蟲可導(dǎo)致弓形蟲腦炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、甚至死亡；孕婦感染弓形蟲可能導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎、甚至死胎。弓形蟲除引起人類疾病外，還可能導(dǎo)致家畜流產(chǎn)和死胎，尤其是豬、綿羊和山羊。因此，弓形蟲是一種威脅畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康的重要人獸共患寄生蟲。

治療弓形蟲病最有效的方案是組合使用乙胺嘧啶-磺胺嘧啶。但這種治療方案仍有多種劣勢，包括僅對弓形蟲快速分裂的速殖子有效，但對包囊中相對緩慢分裂的緩殖子沒有顯著的治療效果；不能治愈持續(xù)感染；治療后的宿主可能出現(xiàn)多種副作用。針對弓形蟲病的疫苗有助于預(yù)防弓形蟲病，也可減少宿主對化學(xué)療法的依賴和化學(xué)療法造成的副作用。但目前只有一種商業(yè)可用的弓形蟲疫苗(Toxovax)被許可用于防止綿羊流產(chǎn)，且這種減毒活疫苗并不適用于預(yù)防人弓形蟲病。

致密顆粒蛋白(dense granule proteins，GRAs)是由弓形蟲的致密顆粒分泌的一類蛋白質(zhì)，具有重要的生物學(xué)功能。有些致密顆粒蛋白通過調(diào)控宿主細(xì)胞的基因表達(dá)、信號通路進(jìn)而調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)，是弓形蟲重要的毒力因子，也是潛在的疫苗候選分子；有些致密顆粒蛋白參與弓形蟲營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運與定位等重要的生理過程，以期成為治療弓形蟲病的潛在藥物靶點。因此，作者對弓形蟲致密顆粒蛋白生物學(xué)功能的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為弓形蟲的致病機(jī)制、藥物靶點、疫苗等相關(guān)研究提供新思路。

1 致密顆粒蛋白的概述

致密顆粒(dense granule，DG)是弓形蟲的一個亞細(xì)胞分泌器官，于20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)，其在電子顯微鏡下的形態(tài)類似于聚集的球狀顆粒，大小約為200 nm；致密顆粒分泌的蛋白被統(tǒng)一命名為致密顆粒蛋白。致密顆粒蛋白中的氨基酸主要為脯氨酸，但不同的致密顆粒蛋白的氨基酸組成、含量、結(jié)構(gòu)域均不同，因此其發(fā)揮的生理學(xué)功能也有很大差異。在不同的生長周期，弓形蟲分泌的致密顆粒蛋白種類和數(shù)量不同。速殖子在入侵宿主細(xì)胞后會分泌致密顆粒蛋白，這些致密顆粒蛋白往往溶于納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)管腔、結(jié)合于納蟲泡膜(PV membrane，PVM)、定位于PV內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(intravacuolar network，IVN)或被分泌到宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞核中，參與調(diào)控宿主細(xì)胞免疫、調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞周期、蛋白轉(zhuǎn)運、營養(yǎng)吸收等多種重要的生理過程。

2 致密顆粒蛋白的生物學(xué)功能

目前，已報道近70種致密顆粒蛋白，主要包括典型的GRA類致密顆粒蛋白(GRAs)、STAT轉(zhuǎn)錄抑制劑(inhibitor of STAT transcription，TgIST)、線粒體結(jié)合因子(mitochondrial association factor，MAF)、c-Myc調(diào)節(jié)因子(c-Myc regulation，MYR)等，其分泌后的定位主要包括PVM、IVN、PV、宿主細(xì)胞核、宿主細(xì)胞質(zhì)等。

2.1 調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)

弓形蟲速殖子入侵宿主細(xì)胞后，致密顆粒蛋白可改變宿主細(xì)胞的免疫狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，以實現(xiàn)免疫逃避和長期寄生。這類致密顆粒蛋白包括主要定位于PVM及PV的GRA6、GRA7、GRA15、GRA60、MAF1，主要定位于PV的GRA25，以及分泌后轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞核的GRA24、TgIST、TEEGR/HCE和宿主細(xì)胞質(zhì)的GRA18、MAG1(matrix antigen 1)，其調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的途徑包括操控宿主的免疫信號通路和(或)宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)、抵抗免疫相關(guān)GTP酶(immunity related GTPases,IRG)介導(dǎo)的防御體系(表1)。

表1 參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的致密顆粒蛋白Table 1 Dense granule proteins involved in regulating immune response of host cells

2.1.1 操控宿主的免疫信號通路和(或)免疫相關(guān)的基因表達(dá) 弓形蟲入侵宿主細(xì)胞后，會在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成一個由PVM包裹的PV，并在PV中繁殖。定位于PVM的GRA6、GRA15、MAF1可調(diào)控宿主免疫相關(guān)的信號通路和基因表達(dá)，進(jìn)而控調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)。GRA6通過鈣調(diào)節(jié)配體(calcium modulating ligand，CAMLG)激活T細(xì)胞核因子4(nuclear factor of activated T cells 4，NFAT4)，進(jìn)而操控宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如刺激趨化因子CXCL2(C-X-C motif chemokine ligand-2)和CCL2(C-C motif chemokine ligand-2)的產(chǎn)生，將炎性單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吸引到感染部位，進(jìn)而抑制弓形蟲的擴(kuò)散。GRA15是一種蟲株特異性效應(yīng)物，在Ⅱ型弓形蟲Pru蟲株中介導(dǎo)NF-κB(nuclear factor kappa B)的核易位和調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)白細(xì)胞介素12(interleukin-12，IL-12)的表達(dá)；GRA15還可通過核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding oligomeric domain，NOD)樣模式識別受體3(NOD-like receptor 3，NLRP3)刺激炎癥小體的形成，并誘導(dǎo)IL-1β的分泌。另外，定位于PVM的弓形蟲線粒體結(jié)合因子1(MAF1)在弓形蟲感染期間調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。研究表明，MAF1可參與弓形蟲對宿主線粒體的招募(host mitochondrial association，HMA)，改變宿主細(xì)胞免疫基因的轉(zhuǎn)錄和感染小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，例如增強(qiáng)IL-6、IL-10和CCL5的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控弓形蟲的生長。

GRA24、TgIST、TEEGR/HCE(E2F4-associated EIH2-inducing gene regulator)分泌后最終易位到細(xì)胞核，影響宿主的基因表達(dá)和(或)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GRA24被分泌后易位至宿主細(xì)胞質(zhì)，與p38α絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞核，通過激活促炎性細(xì)胞因子，尤其是CCL2、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和IL-12的產(chǎn)生，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，從而增強(qiáng)感染部位的吞噬細(xì)胞的吞噬活性，限制弓形蟲的生長繁殖。STAT轉(zhuǎn)錄抑制劑(TgIST)分泌后跨過PVM并聚集在宿主細(xì)胞核發(fā)揮功能，例如將Mi-2/NuRD(Mi-2/nucleosome remodeling and deacetylase)復(fù)合物募集到STAT1依賴性啟動子上，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)改變和轉(zhuǎn)錄受阻；通過阻斷STAT1信號傳導(dǎo)，抑制宿主細(xì)胞對Ⅱ型干擾素IFN-γ的免疫反應(yīng)，對控制感染至關(guān)重要；通過抑制宿主細(xì)胞中STAT1/STAT2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄來阻斷Ⅰ型干擾素IFN-β反應(yīng)；在感染早期，通過阻斷免疫血清球蛋白(immune serum globulin,ISG)介導(dǎo)的有效寄生蟲殺滅作用，保護(hù)原始細(xì)胞內(nèi)第一波入侵的速殖子。弓形蟲E2F4相關(guān)的EZH2誘導(dǎo)基因調(diào)控因子(TEEGR/HCE)分泌后被最終轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，可結(jié)合宿主轉(zhuǎn)錄因子E2F3和E2F4并誘導(dǎo)基因表達(dá)，同時通過開啟EZH2以促進(jìn)非宿主細(xì)胞容許的染色質(zhì)的形成，進(jìn)而抑制宿主NF-κB信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞周期，促進(jìn)弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。GRA28也是分泌后最終轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞核的一種致密顆粒蛋白，但其生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步研究。

GRA18和MAG1跨越PVM后，可最終易位到宿主細(xì)胞質(zhì)，調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。GRA18穿過PVM后在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中選擇性地調(diào)控宿主細(xì)胞免疫基因的表達(dá)。在巨噬細(xì)胞感染的情況下，GRA18可誘導(dǎo)趨化因子CCL17和CCL22的表達(dá)以及抗炎反應(yīng)相關(guān)的特定基因的表達(dá)。MAG1除分布在速殖子的PV基質(zhì)、包囊的囊壁和基質(zhì)外，在速殖子和緩殖子階段均會分泌到宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；MAG1是弓形蟲的毒力因子和炎癥調(diào)節(jié)分子，在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可刺激IL-1β的分泌進(jìn)而抑制炎癥小體的激活，有利于弓形蟲的存活和慢性感染的建立。定位于PV的GRA25則可降低被感染巨噬細(xì)胞的CCL2和CXCL1的表達(dá)，是Ⅱ型弓形蟲的毒力因子和免疫調(diào)節(jié)劑。

弓形蟲感染宿主后，宿主會識別弓形蟲并激活自身的固有免疫、誘導(dǎo)產(chǎn)生獲得性免疫，進(jìn)而控制弓形蟲在宿主的大量繁殖；而弓形蟲也會分泌一些效應(yīng)蛋白到宿主中，通過調(diào)控宿主的基因表達(dá)或信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，逃避宿主的免疫反應(yīng)、避免宿主過早識別并清除弓形蟲和被感染的宿主細(xì)胞。除以上GRA6、GRA15、GRA24、TgIST等致密顆粒蛋白外，弓形蟲還可能分泌其他未知的效應(yīng)蛋白至宿主細(xì)胞，也可能調(diào)控未知基因的表達(dá)或信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而維持兩者之間的免疫平衡。激活宿主免疫反應(yīng)的效應(yīng)蛋白可用于構(gòu)建亞單位疫苗，抑制宿主免疫反應(yīng)的蛋白可用于構(gòu)建基因缺失弱毒疫苗。因此，進(jìn)一步高通量篩選并鑒別新的分泌到宿主細(xì)胞的致密顆粒蛋白或其他效應(yīng)蛋白、發(fā)現(xiàn)新的宿主與弓形蟲互作并影響兩者免疫平衡的基因或信號通路，對揭示宿主與弓形蟲之間的免疫互作機(jī)制及闡明弓形蟲的致病機(jī)制均意義重大。

2.1.2 抵抗IRG防御體系 除以上致密顆粒蛋白可通過調(diào)控宿主細(xì)胞信號通路和(或)基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)外，定位于PVM的部分致密顆粒蛋白可抑制通過IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的IRG，避免宿主細(xì)胞對PV的破壞，進(jìn)而改變宿主免疫反應(yīng)(表1)。GRA7、GRA60也可抵抗宿主細(xì)胞的IRG防御系統(tǒng)，增強(qiáng)弓形蟲的毒力。在入侵宿主細(xì)胞時，GRA7被磷酸化并與棒狀體蛋白ROP18相互作用后，使調(diào)節(jié)免疫相關(guān)GTP酶6(IRGA6)特異性失活，從而抵抗IFN-γ激活的宿主先天免疫。GRA60可抑制宿主細(xì)胞IRGA10和IRGA6被招募到PVM上，以促進(jìn)弓形蟲在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，是Ⅰ型弓形蟲RH蟲株抵抗IRG的重要毒力因子。除此之外，定位于IVN的GRA12可抵抗宿主細(xì)胞IFN-γ介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，是弓形蟲重要的毒力因子，但其與IRG6在PVM的招募無關(guān)。研究表明，在小鼠體內(nèi)，IFN-γ可控制弓形蟲的生長主要是由于其可誘導(dǎo)IRGs和鳥苷酸結(jié)合蛋白(guanylate binding proteins，GBPs)的產(chǎn)生，大量的IRGs和GBPs結(jié)合到PVM后，最終導(dǎo)致弓形蟲死亡。GRA12雖與IRG6在PVM的聚集無關(guān)，但其可能與其他IRGs或GBPs有關(guān)。因此，進(jìn)一步挖掘弓形蟲中能抑制IRGs或GBPs的致密顆粒蛋白，將有助于發(fā)現(xiàn)其他毒力因子。

2.2 調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞周期

GRA16和TEEGR/HCE可通過改變宿主細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而調(diào)整宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期，降低弓形蟲在宿主細(xì)胞中的繁殖速度(表2)。GRA16分泌后穿越PVM，在宿主細(xì)胞質(zhì)與B55蛋白磷酸酶調(diào)控亞基2A(protein phosphatase 2A regulatory subunits B55，PP2A-B55)和皰疹病毒相關(guān)泛素特異性蛋白酶(herpes virus-associated ubiquitin-specific protease，HAUSP)結(jié)合后核易位，進(jìn)而干擾腫瘤抑制因子P53的穩(wěn)定性和活性，延長宿主細(xì)胞周期中的G2期。TEEGR/HCE可與特定的轉(zhuǎn)錄因子E2F3、E2F4、DP1結(jié)合，可調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)編碼細(xì)胞周期蛋白E的基因表達(dá)，從而促使感染細(xì)胞較快速地通過G1/S轉(zhuǎn)換期，并進(jìn)入G2期，以利于弓形蟲的生長。另外，與GRA16轉(zhuǎn)運相關(guān)的致密顆粒蛋白MYR1～4和GRA44可通過介導(dǎo)GRA16的易位，進(jìn)而致使宿主細(xì)胞c-Myc和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白E1上調(diào)(表2)。但目前尚不清楚宿主細(xì)胞停滯在G2期會有益于弓形蟲生長的機(jī)制，需要進(jìn)一步探究。

表2 參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞周期的致密顆粒蛋白Table 2 Dense granule proteins involved in regulating host cell cycle

2.3 參與蛋白的轉(zhuǎn)運與定位

致密顆粒蛋白分泌后需轉(zhuǎn)運至PVM或宿主細(xì)胞質(zhì)或宿主細(xì)胞核，以發(fā)揮其功能，如參與蟲體生長、調(diào)控蟲體的毒力及包囊形成、維持PV和PVM的穩(wěn)定性以及調(diào)控蟲體的營養(yǎng)攝取和宿主信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。目前發(fā)現(xiàn)，參與致密顆粒蛋白轉(zhuǎn)運和定位的有MYR(1～4)、TgPPM3C(protein phosphatases Mg21/Mn21 dependent 3C)、GRA42、GRA43、GRA44和GRA45等(表3)。

表3 參與蛋白轉(zhuǎn)運和定位的致密顆粒蛋白Table 3 Dense granule proteins involved in protein transport and localization

部分致密顆粒蛋白主要定位于PVM，其在弓形蟲分泌的效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，特別是MYRs、TgPPM3C。MYR是弓形蟲的一類分泌蛋白，因其可調(diào)控宿主細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)而命名，目前發(fā)現(xiàn)的MYR主要包括MYR1、MYR2、MYR3和MYR4；MYR2和MYR3分泌后在PVM上與MYR1共定位，且MYR3與MYR1穩(wěn)定地結(jié)合在PVM上，這類MYR均參與弓形蟲分泌蛋白的易位。研究表明，弓形蟲感染宿主細(xì)胞后，大多數(shù)對弓形蟲感染應(yīng)答的差異性基因均依賴于MYR1；MYR1可與GRA44、GRA45、TgPPM3C相互作用，將弓形蟲分泌的效應(yīng)子易位到宿主細(xì)胞后，影響宿主細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)等；MYR1還可與GRA44、GRA45、MYR4互作，共同介導(dǎo)GRA16的易位以及宿主細(xì)胞c-Myc和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白E1的上調(diào)。TgPPM3C是含有絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的致密顆粒蛋白，可與MYR1互作，參與GRA18、GRA28、MYR1的磷酸化，并可介導(dǎo)這類分泌蛋白到宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運過程。

主要定位于PV的GRA42、GRA43、GRA44和GRA45也參與分泌蛋白的轉(zhuǎn)運和定位。GRA42和GRA43介導(dǎo)了包括GRA17、GRA23、GRA35在內(nèi)的多種致密顆粒蛋白在PVM的正確定位。GRA44與GRA45以及弓形蟲高爾基體天冬氨酰蛋白酶(aspartyl protease V，ASP5)、MYR1、MYR2、MYR3、PPM3C、棒狀體蛋白17(ROP17)共同形成的PVM轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，將GRA蛋白由PV轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞核。GRA44和GRA45作為ASP的底物，主要參與GRA16和GRA24至宿主細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運；GRA44還與MYR1/2/3復(fù)合物互作，激活宿主致癌因子c-Myc。伴侶蛋白GRA45可以通過維持其在分泌途徑中的天然折疊狀態(tài)將PVM定位的GRAs正確轉(zhuǎn)運和定位，例如GRA5、GRA7、MAF1、GRA23和GRA44的定位與轉(zhuǎn)運。另外，GRA45還是弓形蟲的毒力因子，敲除后弓形蟲的生長和毒力均下降。

ASP5在弓形蟲致密顆粒轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究表明，ASP5可識別轉(zhuǎn)運原件(export element，TEXEL)，即RRL位點。含有RRL位點的致密顆粒蛋白會在高爾基體中被ASP5切割，切割后被轉(zhuǎn)運至PVM，例如MYR1、GRA16、GRA19、GRA20和GRA44。而部分不含有RRL位點的致密顆粒蛋白的定位也會因ASP5缺失而受到影響，例如GRA2、GRA3、GRA7、GRA35、GRA24、MYR2、MYR3和TEEGR/HCE1，這可能是因為ASP5操控了其他參與轉(zhuǎn)運這類蛋白的轉(zhuǎn)運子。分子伴侶GRA42、GRA43、GRA45參與GRA17、GRA23、GRA35等在PVM上的定位，GRA45還影響定位在宿主細(xì)胞核的致密顆粒蛋白的轉(zhuǎn)運。但GRA45含有RRL位點，GRA42和GRA43不含有RRL位點，說明可能存在其他含有RRL位點的調(diào)控蛋白影響GRA42和GRA43的功能。這啟示著需要進(jìn)一步挖掘參與GRAs轉(zhuǎn)運的致密顆粒蛋白，完善對弓形蟲致密顆粒蛋白轉(zhuǎn)運機(jī)制的認(rèn)識。

2.4 參與營養(yǎng)物質(zhì)的攝取

弓形蟲需要從宿主細(xì)胞中攝取自身生長發(fā)育所需的營養(yǎng)素。PVM作為弓形蟲與宿主細(xì)胞質(zhì)的物理屏障界面，可介導(dǎo)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和運輸、并最終將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運至PV內(nèi)供弓形蟲生長所用。多種定位于PVM的GRAs在維持PVM滲透性以及攝取營養(yǎng)物質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用，例如GRA2、GRA3、GRA6、GRA7、GRA14、GRA17、GRA23(表4)。

表4 參與營養(yǎng)物質(zhì)攝取的致密顆粒蛋白Table 4 Dense granule proteins involved in nutrient uptake

2.4.1 參與PVM中微孔的形成，維持PV的正常形態(tài)和PVM的滲透性 PVM是一種選擇性滲透膜，允許高達(dá)1.3 ku的分子物質(zhì)在不依賴電荷的情況下進(jìn)行自由擴(kuò)散。GRA17和GRA23定位于弓形蟲的致密顆粒、PVM和IVN中，參與PVM中微孔的組成，可介導(dǎo)宿主細(xì)胞質(zhì)和PV內(nèi)小分子物質(zhì)的運輸，對維持PVM的滲透性起著重要作用。研究表明，弓形蟲缺失GRA17后，PV出現(xiàn)體積增大的異常形態(tài)，PVM減弱了對小分子的滲透性，但在GRA17的缺失株回補(bǔ)高表達(dá)的GRA23后，可部分恢復(fù)PV的形態(tài)以及PVM對小分子的滲透性。這說明GRA17與GRA23協(xié)同參與弓形蟲PVM的滲透性，其對弓形蟲營養(yǎng)物質(zhì)的攝入以及有毒有害產(chǎn)物的排出至關(guān)重要。另外，GRA17在慢性感染階段定位于包囊膜，對包囊的正常形態(tài)和包囊膜通透性的維持以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)運也至關(guān)重要。GRA17和GRA23也是弓形蟲重要的毒力因子，Ⅰ型和Ⅱ型的基因敲除蟲株均可在小鼠急性、慢性和先天性感染中構(gòu)建免疫保護(hù)作用。由此可知，PVM中微孔對維持PV內(nèi)的滲透壓、從宿主細(xì)胞質(zhì)攝取營養(yǎng)物質(zhì)以及排除有毒的代謝產(chǎn)物等過程至關(guān)重要。進(jìn)一步探索PVM中微孔的組成成分，將有助于揭示小分子在弓形蟲與宿主細(xì)胞之間的滲透機(jī)制。

2.4.2 參與IVN的形成或維持IVN的穩(wěn)定 弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后，會在宿主細(xì)胞內(nèi)形成的PV中復(fù)制。PV內(nèi)具有一個與PVM連接的納米管網(wǎng)絡(luò)(IVN)，其由直徑為20～50 nm的膜小管組成，貫穿整個空泡空間。IVN增加了弓形蟲與宿主之間物質(zhì)交換的表面積，有利于效應(yīng)蛋白和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而促進(jìn)弓形蟲的生長。IVN在弓形蟲入侵后幾分鐘內(nèi)形成，但其具體的形成機(jī)制仍然未知。目前，多種定位于IVN的GRAs相繼被發(fā)現(xiàn)，例如GRA1、GRA2、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12、GRA41、WNG1等。其中，GRA2、GRA6、GRA41和WNG1參與IVN形成；GRA6和WNG1維持IVN的穩(wěn)定。

IVN的生物發(fā)生需要GRA2和GRA6。GRA2的兩個完整的兩親性α-螺旋是IVN正確形成所必需的；GRA2缺失會導(dǎo)致PV內(nèi)結(jié)構(gòu)明顯紊亂，對宿主細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、Rab小泡和脂滴的攝取顯著減少。GRA6缺失后INV的初始結(jié)構(gòu)正常，但I(xiàn)VN的成熟結(jié)構(gòu)發(fā)生突變。另外，GRA2和GRA6也是弓形蟲的毒力因子。GRA41是一種與IVN相關(guān)的致密顆粒蛋白，其缺失后組成IVN的小管變短且數(shù)量減少，形成小管的小泡數(shù)量增多，致使INV形態(tài)出現(xiàn)異常。但GRA2、GRA6、GRA41轉(zhuǎn)運至IVN的機(jī)制仍然未知。GRA12也是PV內(nèi)與IVN相關(guān)的蛋白，可抵抗宿主IFN-γ介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控宿主免疫應(yīng)答，是Ⅰ型和Ⅱ型弓形蟲的毒力因子，在急性和慢性感染中均發(fā)揮了重要作用。除以上致密顆粒蛋白外，定位于PV內(nèi)的WNG1激酶也是一種參與IVN的形成與穩(wěn)定的致密顆粒蛋白，這是由于包括GRA4、GRA6在內(nèi)的多種與IVN形成有關(guān)的GRA類蛋白均需要被WNG1磷酸化后才可發(fā)揮功能。除GRA4、GRA6外，仍可能存在其他具有磷酸化位點的GRAs被WNGI磷酸化，進(jìn)而影響IVN的形成。而IVN作為PVM的延伸，可有效地增強(qiáng)弓形蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率。由此推測，影響IVN形成的因子可能會限制弓形蟲的生長。因此，深入研究IVN的形成過程、參與IVN形成的GRAs的轉(zhuǎn)運方式、WNG1的其他磷酸化底物等，將有助于深入揭示IVN的形成機(jī)制和生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)弓形蟲的潛在藥物靶點。

2.4.3 參與脂質(zhì)營養(yǎng)的攝取 弓形蟲會從宿主細(xì)胞中攝取多種脂質(zhì)物質(zhì)，例如鞘磷脂、膽固醇等。定位于PVM的部分GRA本身是跨膜蛋白或與跨膜蛋白互作，形成特定的脂質(zhì)攝取結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響弓形蟲對宿主細(xì)胞中脂質(zhì)的攝取。GRA3是一種定位于PVM和包囊囊壁的Ⅰ型跨膜蛋白，是GRA7的組成鏈；GRA3可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅱ型跨膜蛋白CAMLG相互作用，特異性地結(jié)合脂質(zhì)，促進(jìn)PVM的結(jié)構(gòu)修飾，進(jìn)而招募宿主高爾基體并將其吞噬到PV中，攝取宿主細(xì)胞內(nèi)的鞘磷脂。GRA7可與宿主的微管相互結(jié)合形成納蟲泡胞內(nèi)膜-宿主微管橋(host organelle-sequestering tubulo-structures，HOST)結(jié)構(gòu)，幫助蟲體攝取宿主溶酶體中的膽固醇；GRA7還使脂質(zhì)體變形成管狀膜，并與GRA2、GRA6聯(lián)合限制了PV內(nèi)的IVN擴(kuò)展。截至目前，HOST結(jié)構(gòu)的組成部分、HOST結(jié)構(gòu)攝取宿主細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)的種類、脂質(zhì)物質(zhì)攝取后的轉(zhuǎn)運及應(yīng)用機(jī)制的相關(guān)研究仍是空白。開展相關(guān)研究將為揭示弓形蟲攝取宿主營養(yǎng)物質(zhì)的機(jī)制提供新思路。

在弓形蟲中，參與物質(zhì)代謝的致密顆粒蛋白較少，目前報道只有GRA39參與弓形蟲的脂質(zhì)代謝。GRA39定位于PV，參與Ⅱ型弓形蟲的脂質(zhì)代謝，可通過調(diào)控弓形蟲脂質(zhì)來影響蟲體的生長和毒力。缺失GRA39蛋白后，Ⅱ型弓形蟲蟲株脂質(zhì)堆積顯著，且弓形蟲生長緩慢、毒力和組織包囊數(shù)均顯著下降。但缺失GRA39導(dǎo)致弓形蟲脂質(zhì)堆積的原因尚不清楚，GRA39可能參與弓形蟲攝取脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運或脂質(zhì)再利用的過程，進(jìn)一步的相關(guān)研究將填補(bǔ)弓形蟲脂質(zhì)代謝的部分空白。

2.4.4 參與對宿主可溶性蛋白質(zhì)的攝取 與運輸相關(guān)的宿主內(nèi)體分類復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)除參與弓形蟲對宿主的入侵外，在弓形蟲復(fù)制時會被招募到PVM，參與對宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)的攝入。GRA14和其他致密顆粒蛋白會與ESCRT互作，介導(dǎo)攝取了宿主蛋白質(zhì)的囊泡可以以依賴ESCRT機(jī)制的病毒樣粒子的出芽方式跨過PVM，進(jìn)而消化吸收從宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)獲取的蛋白。另外，IVN形成所需的GRA2也參與對宿主蛋白的吸收。GRA14雖定位于IVN，但其不參與IVN結(jié)構(gòu)的形成。據(jù)此可推斷，GRA2缺失后，弓形蟲對宿主蛋白的吸收減少可能是由于IVN結(jié)構(gòu)異常破壞了GRA14的分布、進(jìn)而影響了GRA14與ESCRT的互作。IVN形成所需的其他致密顆粒蛋白可能會影響GRA14在IVN的分布，ESCRT也可能與其他致密顆粒蛋白間發(fā)生互作，這均需要進(jìn)一步的研究證實。

2.5 參與弓形蟲的逸出

弓形蟲在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散依賴于弓形蟲的逸出，弓形蟲從宿主細(xì)胞內(nèi)逸出依賴于胞內(nèi)鈣離子濃度的升高以及微線體蛋白的分泌。GRA8、GRA22和GRA41與弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的逸出存在關(guān)聯(lián)(表5)。GRA22定位于致密顆粒和PV，參與對弓形蟲逸出的調(diào)控；缺失GRA22后弓形蟲的逸出時間提前。定位于IVN的GRA41對維持弓形蟲的鈣離子穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。缺失GRA41后弓形蟲攝取胞外鈣離子的穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從感染細(xì)胞內(nèi)的逸出延遲。但GRA22和GRA41并非含有鈣離子結(jié)合位點，其影響弓形蟲逸出的機(jī)制可能與鈣離子穩(wěn)態(tài)無關(guān)；其能影響弓形蟲的逸出可能只是這兩種致密顆粒蛋白缺失間接導(dǎo)致的結(jié)果；而且具體因何種機(jī)制引起還需進(jìn)一步的研究。另外，GRA8定位于PVM，是弓形蟲速殖子階段膜下細(xì)胞骨架的組成部分，與弓形蟲膜下細(xì)胞骨架的組織和運動相關(guān)；敲除Ⅰ型(RH株)蟲株的GRA8基因，可降低其對宿主細(xì)胞的入侵能力和從宿主細(xì)胞的逸出能力(表5)。

表5 參與逸出的致密顆粒蛋白Table 5 Dense granule proteins involved in egress

2.6 參與慢性感染中包囊的形成

針對GRAs的基本功能的研究主要聚焦在速殖子階段，但在免疫功能正常的情況下，速殖子轉(zhuǎn)化為生長較為緩慢的緩殖子，以包囊的形式存在于骨骼、心、腦組織中，建立慢性感染。一旦宿主免疫力下降，會導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至致命的弓形蟲腦炎。研究發(fā)現(xiàn)，多種致密顆粒蛋白也參與弓形蟲的慢性感染，在包囊的形成中發(fā)揮重要作用(表6)。

表6 參與慢性感染中包囊形成的致密顆粒蛋白Table 6 Dense granule proteins involved in cyst formation in chronic infection

主要定位于PVM的GRA3、GRA5、GRA7、GRA8、GRA9、GRA14和GRA17參與包囊的形成，這類蛋白缺失后，弓形蟲慢性感染階段的小鼠腦包囊數(shù)顯著減少。在包囊發(fā)育和成熟階段，GRA3和GRA14影響包囊囊壁組成物質(zhì)在囊壁周圍的積聚率，其在Ⅱ型弓形蟲的缺失可顯著減少感染小鼠體內(nèi)的包囊數(shù)量；定位于包囊膜的GRA17可介導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)緩殖子在包囊內(nèi)的活力；GRA3和GRA7介導(dǎo)囊壁和囊膜的發(fā)育和成熟；GRA7和GRA5在整個包囊發(fā)育過程中定位于囊膜和囊壁區(qū)域，有助于PVM保持完整并發(fā)育成囊膜。GRA8與GRA3、GRA7、GRA9和GRA14一致，其基因敲除后，感染小鼠的腦包囊數(shù)可減少60%～80%。

與IVN相關(guān)的GRA2、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12對囊壁和囊膜的發(fā)育和成熟也至關(guān)重要。缺失GRA2、GRA4和GRA6后，弓形蟲在小鼠慢性感染階段形成的腦包囊數(shù)可顯著減少90%。缺失GRA12后，慢性感染小鼠中形成的腦包囊數(shù)幾乎完全消失；而與GRA12同源的GRA12A、GRA12B和GRA12D在弓形蟲慢性感染中參與包囊的形成、成熟與激活。

部分在緩殖子階段表達(dá)量高的致密顆粒蛋白也參與包囊的形成。GRA50～GRA53均定位于囊壁，屬于囊壁蛋白(CST)。CST1、GRA50(CST2)缺失后，包囊囊壁變得脆弱，且在慢性感染中形成的腦包囊數(shù)顯著減少。另外，定位于PV的GRA55和GRA39對小鼠腦包囊的形成或維持也是至關(guān)重要的。

目前，參與慢性感染中包囊建立的多個致密顆粒蛋白已被鑒定，但這類致密顆粒蛋白可能是作為調(diào)節(jié)因子調(diào)控包囊的形成，也可能是包囊的結(jié)構(gòu)性組成成分。磷酸化研究表明，參與包囊建立的多種致密顆粒蛋白在緩殖子階段和速殖子階段的磷酸化水平不同。由此推斷，在包囊轉(zhuǎn)化過程中，致密顆粒蛋白被磷酸化可能是一種調(diào)控致密顆粒蛋白在包囊分布的方式。因此，進(jìn)一步研究含有磷酸化位點的致密顆粒蛋白在緩殖子階段的功能，以及深入研究包囊囊壁、囊膜的組成成分，將進(jìn)一步揭示弓形蟲在慢性感染階段轉(zhuǎn)化為包囊的機(jī)制。

3 小 結(jié)

近年來，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在弓形蟲研究中得到了廣泛的應(yīng)用，針對弓形蟲重要基因和蛋白質(zhì)生物學(xué)功能、致病機(jī)制、藥物靶點以及疫苗的研究也不斷展開。目前尚未研制出安全有效的防控弓形蟲病的理想藥物或疫苗。致密顆粒蛋白作為弓形蟲一類重要的分泌蛋白質(zhì)，不僅種類豐富，而且參與調(diào)控宿主細(xì)胞信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)以及免疫逃避、營養(yǎng)物質(zhì)的攝取等重要的生物學(xué)過程?；蚪M學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等組學(xué)技術(shù)和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)、鄰近依賴生物素鑒定(proximity-dependent biotin identification，BioID)等互作技術(shù)在弓形蟲研究中的應(yīng)用，將有助于深入挖掘不同階段或參與不同功能的致密顆粒蛋白。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)則可幫助人們高效地構(gòu)建致密顆粒蛋白的基因缺失株，進(jìn)而深入研究其生物學(xué)功能。因此，進(jìn)一步挖掘并探索弓形蟲的新型致密顆粒蛋白及其生物學(xué)功能，將推動弓形蟲致病機(jī)制的研究和抗弓形蟲疫苗或潛在藥物的研發(fā)。