豬CPB2基因可變剪接體的克隆及生物信息學(xué)研究

夏博策，張凱藝，苗佳坤，楊 宇，彭煥祺，王彥芳，楊述林

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

羧肽酶B2(carboxypeptidase B2，2)，是凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)的編碼基因，故2基因又稱之為基因。TAFI前體酶原主要在肝中合成，含有423個(gè)氨基酸，在去除22個(gè)殘基的信號(hào)肽后，以56 ku分子量的酶原(TAFI)分泌到血液循環(huán)中。TAFI包含92個(gè)殘基的(N末端)活化肽(Phe1-Arg92)和309個(gè)殘基的催化結(jié)構(gòu)域(Ala93-Val401)。TAFI具有較低的羧肽酶酶原活性，其真正發(fā)揮羧肽酶活性需要利用胰蛋白酶樣蛋白酶對(duì)Arg92-Ala93肽鍵切割去除激活肽后形成活化的TAFI(activated TAFI，TAFIa)。TAFIa是一種鋅依賴性外肽酶，可切割羧基末端(賴氨酸)肽鍵。目前，已經(jīng)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中在線發(fā)表了17個(gè)包含人、牛和豬的TAFI或TAFIa的結(jié)構(gòu)。

TAFIa主要被認(rèn)為具有抗纖溶的作用，可參與凝血與纖溶、傷口愈合等過(guò)程；除上述作用外，其還具有一定的抗炎癥作用，能夠滅活炎癥蛋白如過(guò)敏毒素C3a和C5a等。TAFI異常與心血管疾病和血栓性疾病有關(guān)，例如有研究中敲除鼠未表現(xiàn)出可觀察的明顯表型，但在FeCl誘導(dǎo)腔靜脈血栓研究中，敲除鼠中形成的血栓顯著減少，顯示Tafi在血栓形成過(guò)程中存在重要作用。也有研究探討了TAFI編碼基因2的多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系?？梢?jiàn)，TAFI紊亂與疾病密切相關(guān)，可被用作潛在的治療靶點(diǎn)。

目前，關(guān)于人和鼠的2基因報(bào)道較多，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2基因信息，顯示人類2基因存在兩種已驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄本(NM_001278541.2和NM_001872.5)，一種預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本(XM_0170203932)，對(duì)轉(zhuǎn)錄本之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)存在外顯子跳躍和5′端可變剪接事件。目前，對(duì)于豬的2基因及可變剪接的研究較少。前期本實(shí)驗(yàn)室巴馬小型豬肝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示，豬2基因可能存在多種可變剪接體。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)及基因平末端克隆技術(shù)擴(kuò)增豬2基因的CDS區(qū)及部分非編碼區(qū)，利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)2編碼蛋白的基本生物學(xué)特征，進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)2基因在肝、心、腎、皮下脂肪、腸系膜脂肪、股二頭肌和背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)特征；以實(shí)驗(yàn)室制備的代謝性疾病易感豬(轉(zhuǎn)3148、和基因豬)為試驗(yàn)動(dòng)物，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)在富營(yíng)養(yǎng)飲食效應(yīng)下的肝中2基因的表達(dá)特征。本研究結(jié)果將為2基因功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用健康狀態(tài)和體重相同的3頭12月齡巴馬小型豬，安樂(lè)死后收集肝、心、腎、皮下脂肪、腸系膜脂肪、股二頭肌和背最長(zhǎng)肌等組織樣本；選用健康狀態(tài)和體重相同的4頭9月齡代謝性疾病易感豬(轉(zhuǎn)3148、和基因豬)飼喂高脂高能量飼料(53%基礎(chǔ)日糧、37%蔗糖和10%豬油)作為富營(yíng)養(yǎng)飲食試驗(yàn)組(TG-HSHFD)，4頭9月齡代謝性疾病易感豬飼喂基礎(chǔ)日糧作為對(duì)照組(TG-CD)，試驗(yàn)期3個(gè)月，安樂(lè)死后收集肝等組織樣本；采集的所有組織樣品全部置于液氮內(nèi)備用；所有巴馬小型豬試驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可(許可證號(hào)：IAS2019-12)，單欄飼養(yǎng)，日飼2次，自由飲水，溫度16～28 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 試劑

TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))；高保真酶2×Phanta Flash Master Mix(Vazyme，中國(guó))；50×TAE(Solarbio，中國(guó))；瓊脂糖(Biowest，西班牙)；DNA Mark試劑(Generay，中國(guó))；瓊脂糖凝膠DNA試劑盒(Tianmobio，中國(guó))；5 min TA/Blunt-Zero cloning Kit載體克隆試劑盒(Vazyme，中國(guó))；DH5ɑ感受態(tài)(Vazyme，中國(guó))；PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB GreenPremix Ex Taq熒光定量試劑盒(TaKaRa，日本)等。

1.3 方 法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取2序列(登錄號(hào)：XM_001929146.4)及基因組序列，利用NCBI Primer BLAST設(shè)計(jì)2-1、2-2及2-3的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物(上游引物Fq和下游引物Rq)，根據(jù)基因克隆序列設(shè)計(jì)2-1、2-2及2-3定量引物(上游引物Fd和下游引物Rd)，內(nèi)參基因?yàn)?8S。引物序列(表1)由北京擎科生物公司合成。

表1 引物基本信息Table 1 Basic information of primers

1.3.2 組織總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 傳統(tǒng)TRIzol法提取樣品組織總RNA，利用1%濃度瓊脂糖凝膠和Nano-100檢測(cè)儀檢測(cè)RNA完整性和RNA濃度；利用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒合成cDNA(-20 ℃儲(chǔ)存)。

1.3.3 RT-PCR試驗(yàn)及基因克隆 以巴馬小型豬肝組織cDNA作為模板，擴(kuò)增2基因序列，RT-PCR反應(yīng)總體系為50 μL：2×Phanta Mix 25 μL，cDNA 2 μL，上游引物F 2 μL，下游引物R 2 μL，ddHO補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀顯影瓊脂糖凝膠目的條帶，編輯并保存圖片。

利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行DNA純化回收。利用5 min TA/Blunt-Zero cloning Kit 試劑盒克隆目的片段，反應(yīng)總體系為5 μL：5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix 1 μL，PCR純化產(chǎn)物2 μL，ddHO 2 μL。反應(yīng)程序：37 ℃連接5 min。采用熱應(yīng)激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用Amp抗性的固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)入Amp抗性的液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)2 h，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌送至北京擎科生物公司雙向測(cè)序。

1.3.4 qRT-PCR試驗(yàn) 利用TB GreenPremix Ex Taq熒光定量試劑盒檢測(cè)2基因表達(dá)量，qRT-PCR反應(yīng)總體系為20 μL：SYBR Green 10 μL，ddHO 6.8 μL，上游引物F 0.4 μL，下游引物R 0.4 μL，ROX dye II 0.4 μL，cDNA 2.0 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)2次，18S為內(nèi)參基因，分析數(shù)據(jù)使用2法計(jì)算各目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 生物信息學(xué)分析 利用Snapgene、DNAMAN 8軟件比對(duì)基因序列和蛋白序列；利用Swiss-PdbViewer軟件編輯蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；利用Cytoscape 軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；其他在線工具如表2。

表2 在線工具基本信息Table 2 Basic information of online tools

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)SAS 9.1 軟件和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行-test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，<0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 豬CPB2基因可變剪接體的克隆

前期肝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，豬2基因可能存在3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，以其特異性區(qū)域設(shè)計(jì)包含CDS區(qū)的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物(圖1A)。利用RT-PCR方法在肝組織中獲得豬2基因的3條不同轉(zhuǎn)錄本條帶(圖1B)。通過(guò)載體pCE2 TA/Blunt-Zero與切膠回收片段連接克隆，篩選陽(yáng)性菌測(cè)序，3種轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度(包括CDS區(qū)及部分非編碼區(qū))分別為1 445、1 344和1 268 bp(圖1C)。與數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)后，顯示長(zhǎng)片段轉(zhuǎn)錄本與NCBI中預(yù)測(cè)序列XM_001929146.4相同，命名為2-1；中片段和短片段轉(zhuǎn)錄本，分別命名為2-2和2-3(已將擴(kuò)增到的轉(zhuǎn)錄本2-1、2-2和2-3序列上傳至NCBI GenBank，登錄號(hào)分別為ON088314、ON088315和ON088316)。

A.引物設(shè)計(jì)(F. 上游引物；R. 下游引物；1～11、1a、4a為外顯子序列號(hào))；B. RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 轉(zhuǎn)錄本CPB2-1；2. 轉(zhuǎn)錄本CPB2-2；3. 轉(zhuǎn)錄本CPB2-3)；C. 陽(yáng)性菌鑒定結(jié)果(M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 轉(zhuǎn)錄本CPB2-1；2. 轉(zhuǎn)錄本CPB2-2；3. 轉(zhuǎn)錄本CPB2-3)A. Primer design drawing (F. Forward primer; R. Reverse primer; 1-11, 1a, 4a are exon numbers)；B. Gel map amplified by RT-PCR (M. DNA Marker; 1. Transcript CPB2-1; 2. Transcript CPB2-2; 3. Transcript CPB2-3)；C. Positive bacteria identification map (M. DNA Marker; 1. Transcript CPB2-1; 2. Transcript CPB2-2; 3. Transcript CPB2-3)圖1 CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3的克隆Fig.1 Cloning of CPB2-1, CPB2-2 and CPB2-3

2.2 豬CPB2基因的可變剪接分析

將2的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列與2基因組進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，2基因共有13個(gè)外顯子，其中外顯子5～11是3種轉(zhuǎn)錄本共有的；與轉(zhuǎn)錄本2-1相比，轉(zhuǎn)錄本2-2和2-3的第一外顯子組成不同，分別由外顯子1a和外顯子4a+4構(gòu)成，即均發(fā)生A5SS事件(圖2A)。組成3種轉(zhuǎn)錄本的第一外顯子與第二外顯子交界堿基都為5′….AG/TG….3′(圖2B)，其中，轉(zhuǎn)錄本與基因組比對(duì)顯示2-1外顯子1后端剪接位點(diǎn)與外顯子2前端剪接位點(diǎn)分別為G|G和G|T；2-2外顯子1a后端剪接位點(diǎn)和外顯子2前端剪接位點(diǎn)G|G和G|T；2-3外顯子4a與外顯子4之間的剪接位點(diǎn)為G|T。

A.轉(zhuǎn)錄本模式圖(1～11、1a、4a為外顯子序列號(hào))；B. 轉(zhuǎn)錄本部分核苷酸序列比對(duì)圖A.Transcription pattern diagram (1-11, 1a, 4a are exon numbers); B. Nucleotide sequence alignment diagram of the transcript portion圖2 CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3的可變剪接分析Fig.2 Alternative splicing analysis of CPB2-1, CPB2-2 and CPB2-3

2.3 豬CPB2蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白序列比對(duì) 經(jīng)NCBI ORF預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，2-1的CDS區(qū)1 272 bp，其起始密碼子為ATG，位于133 bp處，終止密碼子為TAA，位于1 404 bp處，編碼包含423個(gè)氨基酸的蛋白；2-2的CDS區(qū)846 bp，其起始密碼子為ATG，位于460 bp處，終止密碼子為TAA，位于1 305 bp，編碼包含281個(gè)氨基酸的蛋白；2-3的CDS區(qū)均為846 bp，其起始密碼子為ATG，位于383 bp處，終止密碼子為TAA，位于1 228 bp處，編碼包含281個(gè)氨基酸的蛋白。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2-2和2-3編碼同種蛋白；與CPB2-1蛋白相比，CPB2-2和CPB2-3蛋白缺失了前段的142個(gè)氨基酸(圖3)。

圖3 CPB2蛋白序列比對(duì)Fig.3 Comparison of CPB2 protein sequences

2.3.2 蛋白理化性質(zhì)分析 ProtParam軟件預(yù)測(cè)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，CPB2-1分子式為CHNOS，相對(duì)分子質(zhì)量為48 601.18，原子數(shù)6 784，理論等電點(diǎn)(PI)為6.83(<7)屬于酸性蛋白，帶負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為48，帶正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為46，消光系數(shù)為89 770, 預(yù)測(cè)其半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為49.79(<40)屬不穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為82.51；而CPB2-2和CPB2-3分子式為CHNOS，相對(duì)分子質(zhì)量為32 533.09，理論等電點(diǎn)(PI)為8.91(>7)屬于堿性蛋白，帶負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp + Glu)為30，帶正電荷殘基數(shù)(Arg + Lys)為37，消光系數(shù)為69 705，預(yù)測(cè)其半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為50.36，小于40屬不穩(wěn)定性蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為72.92。ProtScale軟件疏水性分析結(jié)果顯示，CPB2-1蛋白疏水性最強(qiáng)的氨基酸是位于第12位的Ala(正值3.344)，親水性最強(qiáng)的氨基酸是第328位的Lys(負(fù)值3.056)，總氨基酸中親水性氨基酸占比達(dá)61.23%，氨基酸平均值-0.308 95，推測(cè)為親水性蛋白(圖4C)；CPB2-2和CPB2-3蛋白疏水性最強(qiáng)的氨基酸是第50位的Leu(正值1.700)，親水性最強(qiáng)的氨基酸是第186位的Lys(負(fù)值3.056)，總氨基酸中親水性氨基酸占比64.77%，氨基酸平均值-0.430 71，推測(cè)為親水性蛋白(圖4D)。

A.CPB2-1蛋白氨基酸分布；B. CPB2-2和CPB2-3蛋白氨基酸分布；C. CPB2-1蛋白疏水性與親水性預(yù)測(cè)；D. CPB2-2和CPB2-3蛋白疏水性與親水性預(yù)測(cè)A. Amino acid distribution of CPB2-1 protein; B. Amino acid distribution of CPB2-2 and CPB2-3 proteins; C. Hydrophobicity and hydrophilicity prediction of CPB2-1 protein; D. Hydrophobicity and hydrophilicity prediction of CPB2-2 and CPB2-3 protein圖4 CPB2蛋白理化性質(zhì)Fig.4 Physicochemical properties analysis of CPB2 protein

2.3.3 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè) 信號(hào)肽是新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的短肽序列。通過(guò)在線工具SignalP 5.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽，結(jié)果表明，CPB2-1蛋白存在一個(gè)22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(圖5A)，可能屬于分泌蛋白，可信度0.870 1；CPB2-2和CPB2-3蛋白不存在信號(hào)肽(圖5B)，可能屬于不分泌蛋白。

A.CPB2-1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；B. CPB2-2和CPB2-3蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)A. Prediction of CPB2-1 protein signal peptide; B. Prediction of CPB2-2 and CPB2-3 protein signal peptide圖5 CPB2蛋白信號(hào)肽分析Fig.5 CPB2 protein signal peptide analysis

2.3.4 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) NCBI保守結(jié)構(gòu)域在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)CPB2蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，CPB2-1的N端含有1個(gè)Propep_M14羧肽酶激活肽結(jié)構(gòu)域；C端含有1個(gè)M14_CPB2羧肽酶活性功能域，由1個(gè)鋅結(jié)合位點(diǎn)和活性位點(diǎn)組成(圖6A)。與CPB2-1相比，截?cái)嗟鞍證PB2-2與CPB2-3缺少了Propep_M14羧肽酶激活肽結(jié)構(gòu)域，但具有相同的M14_CPB2羧肽酶活性功能域，推測(cè)其羧肽酶活性功能正常，但是功能激活方式可能存在一定差異(圖6B)。

A.CPB2-1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；B. CPB2-2和CPB2-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)A. Prediction of CPB2-1 protein conserved domain; B. Prediction of CPB2-2 and CPB2-3 proteins conserved domain圖6 CPB2蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conserved domain analysis of CPB2 protein

2.3.5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA軟件對(duì)CPB2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3的二級(jí)結(jié)構(gòu)均主要由ɑ-螺旋(h)、延伸(e)、β-折疊(t)和無(wú)規(guī)則卷曲(c)組成，這4種二級(jí)結(jié)構(gòu)在CPB2-1蛋白中占比分別為36.41%、19.15%、4.26%和40.19%，在CPB2-2和CPB2-3蛋白中占比分別為29.18%、22.78%、6.41%和41.64%(圖7A、7C)。SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)CPB2基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，CPB2-1蛋白主要由上、下兩部分組成，其中，紅色部分為信號(hào)肽和Propep_M14羧肽酶激活肽結(jié)構(gòu)域，彩色部分為M14_CPB2羧肽酶活性功能域(圖7B)；CPB2-2蛋白缺少紅色部分結(jié)構(gòu)，但是彩色部分與CPB2-1蛋白對(duì)應(yīng)位置的三維結(jié)構(gòu)相同(圖7D)。

A.CPB2-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B. CPB2-1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C. CPB2-2和CPB2-3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D. CPB2-2和CPB2-3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A. Prediction of secondary structure of CPB2-1 protein; B. Prediction of tertiary structure of CPB2-1 protein; C. Prediction of secondary structure of CPB2-2 and CPB2-3 proteins; D. Prediction of tertiary structure of CPB2-2 and CPB2-3 proteins圖7 CPB2蛋白二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Secondary and tertiary structure analysis of CPB2 protein

2.3.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用String網(wǎng)站，選擇物種豬()，選擇可信度0.7，對(duì)豬CPB2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，與CPB2具有互作關(guān)系的蛋白有SERPINC1、AHSG、F2、PROC、PLG、AGT、C8B、F7、CPE和DBT等(圖8)。對(duì)2及其互作基因進(jìn)行富集分析，GO、KEGG和REAC結(jié)果顯示，其可能通過(guò)肽酶水解及肽酶活性調(diào)節(jié)，參與纖溶、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)和創(chuàng)傷反應(yīng)等過(guò)程；HP結(jié)果顯示其與凝血異常、靜脈血栓和靜脈炎等疾病存在一定關(guān)系(表3)。

表3 CPB2互作相關(guān)基因富集分析Table 3 Enrichment analysis of CPB2 interaction related genes

(續(xù)表3 Continued)

圖8 CPB2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Protein interaction network analysis of CPB2

2.4 豬CPB2基因可變剪接體的組織表達(dá)譜

為研究2的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本在巴馬小型豬不同組織內(nèi)表達(dá)情況，利用RT-PCR檢測(cè)其全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)分布。結(jié)果顯示，2-1、2-2和2-3只在肝和腎中表達(dá)，與2-1和2-2相比，2-3表達(dá)量相對(duì)較低，可以看出2基因的3種轉(zhuǎn)錄本存在明顯的組織特異性，這與它的功能特點(diǎn)密切相關(guān)(圖9)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 肝；2. 心；3. 腎；4. 皮下脂肪；5. 腸系膜脂肪；6. 股二頭?。?. 背最長(zhǎng)肌M. DNA marker; 1. Liver; 2. Heart; 3. Kidney; 4. Subcutaneous fat; 5. Mesenteric fat; 6. Biceps femoris; 7. Longissimus dorsi圖9 CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的組織表達(dá)譜Fig.9 Tissue expression profiles of the full-length transcripts of CPB2-1, CPB2-2 and CPB2-3

2.5 富營(yíng)養(yǎng)飲食下代謝性疾病易感豬肝中CPB2基因表達(dá)分析

為研究富營(yíng)養(yǎng)飲食下代謝性疾病易感豬肝中2基因的表達(dá)模式，在豬2基因的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本共有區(qū)域設(shè)計(jì)引物檢測(cè)2基因總表達(dá)量，在3個(gè)轉(zhuǎn)錄本特異區(qū)域設(shè)計(jì)定量引物檢測(cè)2-1、2-2和2-3的表達(dá)量。結(jié)果顯示，2基因總表達(dá)量顯著降低(<0.05)；2-1和2-2兩種轉(zhuǎn)錄本極顯著降低(<0.01)；轉(zhuǎn)錄本2-3表達(dá)量降低，但未達(dá)到顯著水平(=0.14，圖10)。

*. P<0.05；**. P<0.01圖10 CPB2基因及3種轉(zhuǎn)錄本的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.10 qRT-PCR validation of CPB2 gene and 3 transcripts

3 討 論

可變剪接(alternative splicing，AS)現(xiàn)象的描述最早出現(xiàn)在20世紀(jì)70年代，是指一個(gè)基因的pre-mRNA通過(guò)不同的內(nèi)含子及外顯子拼接方式形成多個(gè)成熟mRNA的過(guò)程。動(dòng)植物體內(nèi)發(fā)生的可變剪接類型可分為8種，但是常見(jiàn)的可變剪接類型主要分為5種：外顯子跳躍(skipped exon，SE)、外顯子互斥(mutually exclusive exon，MXE)、內(nèi)含子保留(retained intron，RI)、5′端可變剪接(alternative 5′splice site，A5SS)和3′端可變剪接(alternative 3′splice site，A3SS)。2是凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)的編碼基因，主要具有抗纖溶的作用，可參與凝血與纖溶、傷口愈合、抗炎等過(guò)程，也有研究表明其與代謝性疾病(如2型糖尿病、心血管疾病)等存在一定關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)室前期富營(yíng)養(yǎng)飲食對(duì)代謝性疾病易感豬肝組織可變剪接影響的研究中，篩選到差異剪接基因2，富集分析顯示，2基因顯著富集到與代謝相關(guān)的通路中，由代謝相關(guān)差異剪接基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析篩選出的樞紐基因也包括2基因，顯示出2基因可能在代謝性疾病中的重要性。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了豬2的3個(gè)可變剪接體2-1、2-2和2-3，三者后7個(gè)外顯子為3種轉(zhuǎn)錄本共有；與2-1相比，2-2和2-3發(fā)生了A5SS事件，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人2基因中也觀察到可能存在A5SS事件，說(shuō)明人與豬之間可能存在一定保守的剪接模式，這與之前豬13基因在物種間存在相同剪接模式的研究結(jié)果一致。

大約75%的可變剪接事件出現(xiàn)在可變剪接體的編碼蛋白區(qū)，其對(duì)應(yīng)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，進(jìn)而可影響其結(jié)合特性、酶活性、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白穩(wěn)定性和表觀修飾等多個(gè)方面。經(jīng)NCBI工具預(yù)測(cè)，2-1的CDS區(qū)為1 272 bp，編碼423個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；由于5′端可變剪接事件的存在，2-2和2-3的翻譯起始位點(diǎn)發(fā)生改變，CDS區(qū)變?yōu)?46 bp，編碼281個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，兩者相差142個(gè)氨基酸。經(jīng)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示，CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3半衰期相同且均為不穩(wěn)定性蛋白，這與之前研究報(bào)道蛋白質(zhì)的半衰期和其穩(wěn)定性有密切關(guān)系的結(jié)果一致，也與報(bào)道中人CPB2蛋白存在自身熱不穩(wěn)定性的結(jié)果一致，這種不穩(wěn)定性被認(rèn)為是在抗纖溶活性的自動(dòng)調(diào)節(jié)中起作用。

有研究表明，人CPB2蛋白在肝中通過(guò)信號(hào)肽去除進(jìn)入血液，在血中去除激活肽后，才能正常發(fā)揮羧肽酶功能。根據(jù)信號(hào)肽和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，CPB2-1蛋白因包含信號(hào)肽、激活肽和羧肽酶活性功能域，推測(cè)其可以行使正常生理功能。CPB2-2蛋白和CPB2-3蛋白因天然缺少信號(hào)肽和激活肽，但具有羧肽酶活性功能域，推測(cè)其被保留在肝中發(fā)揮羧肽酶功能，這兩種截?cái)嗟鞍自诟沃邪l(fā)揮羧肽酶活性的高低以及是否行使與完整蛋白相同的生理學(xué)功能還需進(jìn)一步研究。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，CPB2-1蛋白結(jié)構(gòu)完整，截?cái)嗟鞍證PB2-2和CPB2-3羧肽酶活性功能域沒(méi)有因?yàn)槿笔盘?hào)肽和激活肽結(jié)構(gòu)而發(fā)生構(gòu)像改變，也證明其蛋白可能具有正常羧肽酶活性。豬CPB2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及其富集分析顯示，CPB2在豬體內(nèi)可能通過(guò)肽酶水解及肽酶活性調(diào)節(jié)，參與蛋白質(zhì)代謝反應(yīng)、纖溶、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)和創(chuàng)傷反應(yīng)等過(guò)程，功能失調(diào)可能導(dǎo)致凝血異常、靜脈血栓和靜脈炎等疾病。

有研究表明，人2基因與一些凝血因子具有相似的特殊轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列，使其在肝中特異性表達(dá)，在鼠中也只在肝中檢測(cè)到2基因的表達(dá)。本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)2-1、2-2和2-3全長(zhǎng)序列在7種組織(肝、心、腎、皮下脂肪、腸系膜脂肪、股二頭肌和背最長(zhǎng)肌)中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)豬2基因的3種轉(zhuǎn)錄本同樣具有明顯的組織特異性，除在肝中特異性表達(dá)外，在腎中也有表達(dá)。前期本實(shí)驗(yàn)室關(guān)于代謝性疾病易感豬的研究，已發(fā)現(xiàn)其肝內(nèi)靶向轉(zhuǎn)入代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)基因3148，肝表現(xiàn)出炎癥病灶等特征，與人類非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)等慢性肝病存在一定的相似性。本研究表明，在短期富營(yíng)養(yǎng)飲食誘導(dǎo)的代謝性疾病易感豬肝中，2總體表達(dá)量、轉(zhuǎn)錄本2-1和轉(zhuǎn)錄本2-2顯著降低，這與已有研究中2表達(dá)與慢性肝病存在負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)果相似，也與已有報(bào)道中NASH患者具有較低水平的2編碼蛋白TAFI值的結(jié)果相似；也可以看出2-1和2-2表達(dá)趨勢(shì)與2總體表達(dá)量相同，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能在豬體內(nèi)起主要作用。

4 結(jié) 論

本研究成功在肝中克隆了豬2基因的3種可變剪接體，推測(cè)2-1是行使纖溶與凝血等生理功能的正常轉(zhuǎn)錄本；新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本2-2和2-3被留在肝和腎中可能具有羧肽酶活性和重要生理學(xué)功能；2基因與代謝相關(guān)的慢性肝病存在一定聯(lián)系。本研究結(jié)果將為2基因功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。