高雪麗，李蒙蒙，加爾恒·別建汗，齊·阿拉達爾*

(1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.阿勒泰地區(qū)布爾津縣禾木哈納斯蒙古民族鄉(xiāng)農業(yè)(畜牧業(yè))發(fā)展服務中心，阿勒泰 836500)

馬屬動物屬草食單胃動物，其胃部雖然不能像反芻動物的瘤胃一樣對食物進行發(fā)酵，但是其腸道的消化功能十分強大，里面包含了極其豐富和高度復雜的厭氧微生物群體。這些腸道菌群通過影響個體的細胞增殖、神經信號等對機體的新陳代謝、生理、營養(yǎng)和免疫產生影響。因此，腸道菌群的適應性變化是馬匹適應生存環(huán)境變化和食性組成變化的途徑之一。

哈薩克馬是新疆數(shù)量最多的馬品種，大多數(shù)分布于阿勒泰地區(qū)，這里冬季氣溫一般為-30 ℃左右。山區(qū)牧民飼養(yǎng)的哈薩克馬能夠很好地適應逐水草而居，自然放牧的生存環(huán)境。冬季時期用于騎乘或擠奶時，哈薩克馬會被圈養(yǎng)。而那些冬季暫無用途的馬匹，則被放于山中，在積雪20～30 cm厚的草場上刨雪覓食，吞雪解渴。

有研究發(fā)現(xiàn)，不同飼養(yǎng)模式下蒙古馬腸道菌群組成結構存在整體性差異。目前，對于蒙古馬腸道菌群已有較為系統(tǒng)的研究。李曉斌等研究了新疆伊犁馬馬駒及新疆本地自繁的純血馬母馬與馬駒的腸道菌群特點，發(fā)現(xiàn)腸道菌群在生長發(fā)育過程中呈現(xiàn)階段性變化，且斷奶前馬駒與母馬糞便菌群多樣性和相似性均有一定差異。de Fombelle等研究騸馬的前腸道消化率時發(fā)現(xiàn)，與增加淀粉類谷物飼料相比，飼喂高纖維飼料能夠促進胃腸道蠕動，顯著縮短飼料在腸道的停留時間，從而增加腸道消化能力，這與其他研究得出的結果一致。在兩種不同飲食下，飼喂高纖維飼料的騸馬腸道中纖維素降解菌濃度均高于飼喂高谷物飼料的騸馬。馬屬動物被喂養(yǎng)不同的飼料后，其腸道菌群明顯不同，飼喂大麥的馬匹與飼喂干草的馬匹相比，其盲腸和結腸中的厭氧菌(如乳酸桿菌、鏈球菌等)顯著增加，且腸道內纖維素分解菌的群落結構也不相同。

哈薩克馬作為我國重要的種質資源，對于其腸道菌群的研究鮮見報道，對于不同飼養(yǎng)模式對哈薩克馬腸道菌群組成產生怎樣的影響尚不清楚。因此，本研究選取了圈養(yǎng)和自由放牧的哈薩克馬作為研究對象，旨在比較不同飼養(yǎng)模式下哈薩克馬腸道菌群組成差異，從而探討自由放牧和圈養(yǎng)因素對腸道菌群結構的影響，為進一步研究哈薩克馬腸道菌群奠定基礎，也為后期探究馬屬動物腸道菌群組成差異及功能方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取圈養(yǎng)和自由放牧條件下成年哈薩克馬各5匹為試驗材料，編號分別為JY1～JY5和FM1～FM5。圈養(yǎng)組馬匹以定時投喂干草和補飼一定精料的半放牧半舍飼方式飼養(yǎng)。自由放牧組馬匹主要采食積雪下的干草，不投喂精料。圈養(yǎng)組馬匹采食的干草為牧民夏季在山中收割而得，與放牧組采食的干草種類相同。在采集圈養(yǎng)組糞便時，圈養(yǎng)馬匹的牧民較少，樣本有限，因此圈養(yǎng)組樣本有騸馬糞便和母馬糞便，騸馬為牧民騎乘馬匹，母馬為牧民預備擠奶用馬匹。放牧組馬匹全為騸馬。由于腸道菌群受性別影響非常有限，故在本試驗中未將性別作為固定因素。在1月份無菌采集新鮮糞便，放于5 mL無菌無酶凍存管中，并立即投入液氮中低溫保存。

1.2 總DNA的提取、純化和構建文庫

提取糞便總DNA、使用通用引物(F:ACTCTACGGAGGCAGCA；R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進行PCR擴增、構建文庫后經NanoDrop定量和文庫檢測合格后，使用Illumina MiSeq PE250進行上機測序。以上步驟均由上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

根據(jù)上海派森諾生物科技股份有限公司給出的原始序列、有效序列等信息，使用DADA2分析進行序列質控(去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體)。利用派森諾基因云分析平臺(https://www.genescloud.cn)進行OTU聚類、物種注釋、α多樣性、β多樣性以及各分類水平物種組成分析。使用Origin 2021、GraphPad Prism 8.0軟件繪制堆積柱狀圖、條形圖。使用IBM SPSS Statistics 26.0軟件做獨立樣本檢驗，其中，<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 測序結果和α多樣性分析

對哈薩克馬的10個糞便樣本進行測序，共獲得高質量序列數(shù)735 234條，根據(jù)97%的序列一致性，共得到29 955個操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。對兩種飼養(yǎng)模式的哈薩克馬腸道菌群進行多樣性檢驗(表1)，10個樣本的測序覆蓋率平均為94%以上，說明本試驗中獲得的序列代表了微生物界94%以上的細菌種系型，測序覆蓋率好，每個樣本中均觀察到較豐富的物種。但放牧組和圈養(yǎng)組菌群豐度差異不顯著(Chao1指數(shù)：6 538.38. 6 485.338；Observed_species：4 655.04. 4 683.24；Faith_pd：276.381 4. 301.457 4；>0.05)。放牧組菌群多樣性顯著高于圈養(yǎng)組(Shannon指數(shù)：10.853 48. 10.194 9，<0.05；Simpson指數(shù)：0.998 7. 0.984 0，<0.01)。

表1 測序結果及α多樣性分析Table 1 Sequencing result and α diversity analysis

2.2 物種組成和β多樣性分析

兩組10匹馬的糞便共鑒定出21個門，45個綱，70個目，126個科，226個屬，286個種。圈養(yǎng)組與放牧組哈薩克馬腸道菌群中豐度最高的5個菌門為厚壁菌門(Firmicutes，78.08%. 76.10%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，15.72%. 17.16%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，2.48%. 2.91%)、變形菌門(Proteobacteria，0.69%. 0.91%)和TM7菌門(0.69%. 0.56%)，如圖1A。其中前三個優(yōu)勢菌門占據(jù)了兩組96%的序列，未鑒定出的細菌序列占所有序列的0.82%。

科分類水平的分析顯示(圖1B)，在放牧組中優(yōu)勢菌科為瘤胃球菌科(Ruminococcaceae，30.44%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，21.96%)和艱難桿菌科([Mogibacteriaceae]，4.86%)。而在圈養(yǎng)組的優(yōu)勢菌科為瘤胃球菌科(28.73%)、糞便鏈球菌科(Streptococcaceae，15.08%)和毛螺菌科(14.51%)。在兩組中豐度占比最高的瘤胃球菌科是馬匹發(fā)酵纖維素的基礎。在圈養(yǎng)組中發(fā)現(xiàn)糞便鏈球菌科的顯著上升(<0.05)和毛螺菌科占比下降。

圖1 門水平(A)和科水平(B)上Top10物種組成豐度堆積柱狀圖Fig.1 Accumulation histogram of Top 10 species composition abundance at phylum(A) and family(B) level

圈養(yǎng)組與放牧組Top10的菌屬為瘤胃球菌屬(，1.15%. 4.27%)、羅氏菌屬(，0.32%. 1.51%)、糞球菌屬(，0.67%. 1.45%)、普雷沃氏菌屬(，0.21%. 0.80%)、考拉桿菌屬(，0.50%. 0.95%)、艱難桿菌屬(，0.63%. 0.68%)、梭狀芽孢菌屬(，1.46%. 1.41%)、顫螺菌屬(，3.27%. 3.03%)、BF311(0.68%. 0.37%)、糞便鏈球菌屬(，15.43%. 0.38%)。根據(jù)菌屬差異顯著分析顯示(圖2)，放牧組中瘤胃球菌屬極顯著高于圈養(yǎng)組(<0.01)，羅氏菌屬、糞球菌屬和普雷沃氏菌屬顯著高于圈養(yǎng)組(<0.05)；圈養(yǎng)組中糞便鏈球菌屬顯著高于放牧組(<0.05)。

圖2 屬水平Top10物種差異顯著分析Fig.2 Significant difference analysis of Top 10 species at genus level

基于加權Unifrac指數(shù)，繪制個體的分布特征圖(圖3)。非量度多維尺度(NMDS)分析中，應力值(stress)為 0.074 9，一般認為該值小于0.2時，排序結果較為可靠。圈養(yǎng)組和放牧組的樣本分別分布在主坐標NMDS1的左側和右側，表明圈養(yǎng)組和放牧組組間群落差異較大。在主坐標NMDS2上，圈養(yǎng)組和放牧組組內各樣本之間較為分散，說明組內各樣本腸道菌群組成也存在一定差異。

圖3 基于加權Unifrac指數(shù)的NMDS分析Fig.3 NMDS analysis based on weighted UniFrac index

2.3 標志物種篩選及功能預測分析

LDA Effect Size(LEfSe)分析是為了尋找在組內樣本中都存在、但組與組之間具有統(tǒng)計學差異的物種，即標志物種。在LDA值(lg)>3的閾值下，圈養(yǎng)組與放牧組中分別發(fā)現(xiàn)了12和24個標志物種(圖4)。數(shù)據(jù)顯示，圈養(yǎng)組中的標志物種有：糞便鏈球菌()、乳酸桿菌()、WCHB1_25和韋榮氏球菌科的RFN20。放牧組中的標志物種主要以瘤胃球菌()、梭菌()、羅氏菌()、糞球菌()、普雷沃氏菌()、假丁酸弧菌()和甲基桿菌()為主。

圖4 LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis

基于序列功能預測分析，哈薩克馬腸道菌群中共預測到175個直系同源分類(KOs)，并將其注釋到KEGG第一功能途徑(圖5)。大多數(shù)功能序列被注釋為代謝(77.44%)，其次是遺傳信息處理(14.59%)、細胞過程(5.06%)、環(huán)境信息處理(2.26%)，生物系統(tǒng)和人類疾病占比最低，分別為0.46%和0.20%。

圖5 一級KEGG功能途徑組成柱狀圖Fig.5 Histogram of functional pathway composition of primary KEGG

進一步注釋到次級KEGG功能途徑(圖6)。放牧組與圈養(yǎng)組中“碳水化合物代謝”(13.68%. 14.018%)是“代謝”中最大的類別，其次是氨基酸代謝(12.933%. 13.04%)、輔助因子和維生素的代謝(12.128%. 11.992%)、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝(10.51%. 9.779%)、其他氨基酸代謝(7.087%.7.312%)、脂質代謝(5.353%. 5.435%)以及能量代謝(5.426%. 5.095%)等。根據(jù)結果顯示，放牧組與圈養(yǎng)組在次級功能途徑上有4個功能途徑存在顯著差異(<0.05)：傳染病、能量代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、核苷酸代謝。其中傳染病和核苷酸代謝在圈養(yǎng)組中顯著富集，能量代謝和萜類化合物和聚酮化合物的代謝在放牧組中顯著富集。

圖6 次級KEGG功能途徑條形圖Fig.6 Bar chart of secondary KEGG functional pathway

3 討 論

由于遺傳背景、生存環(huán)境及食性組成不同，每個個體的腸道菌群都是獨一無二的。但同一地區(qū)遺傳背景和生存環(huán)境又具有一定的相似性，故馬匹中腸道菌群組成呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。哈薩克馬作為我國重要的馬品種資源，數(shù)量占新疆馬匹數(shù)的1/2、全國馬匹數(shù)的1/10，對于其研究報道多見于生產性能和開發(fā)利用方面，在腸道菌群方面研究較少，尤其是飼養(yǎng)模式對哈薩克馬腸道菌群的組成結構方面有何影響鮮有報道。

3.1 不同飼養(yǎng)模式下哈薩克馬腸道菌群多樣性

本研究在10個哈薩克馬糞便樣本中共獲得高質量序列數(shù)735 234條，Dougal等在10匹騸馬的糞便樣本中獲得559 623條高質量序列，說明不同馬匹的腸道菌群序列量存在較大差異。邢振存在對比干草舍飼與青草放牧兩種不同飼養(yǎng)條件下蒙古馬腸道菌群結構時發(fā)現(xiàn)，干草舍飼的馬匹腸道真菌群落多樣性更高，但均勻度較低。本試驗結果顯示，放牧組物種多樣性顯著高于圈養(yǎng)組，這說明只采食干草的放牧組比補喂精料的圈養(yǎng)組腸道菌群組成更為多樣。Julliand等也得出不同飼喂條件下纖維源對腸道菌群具有較大影響的結論。Willing等在研究騸馬腸道菌群組成時發(fā)現(xiàn)，與投喂草料(貓尾草/干羊茅)的馬匹相比，投喂草料(50%干物質(貓尾草/干羊茅))及精料(35.8%淀粉+41%燕麥+7%豆粕+1.35%麥麩))的馬匹腸道菌群多樣性偏低。這與本研究得出的結果相一致。

3.2 不同飼養(yǎng)模式下哈薩克馬腸道菌群組成及變化

有學者在研究阿拉伯馬的糞便菌群時發(fā)現(xiàn)，分布最多的是厚壁菌門(Firmicutes，占細菌總數(shù)的43.7%)，疣微菌門(Verrucomicrobia，4.1%)，變形菌門(Proteobacteria，3.8%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，3.7%)。本試驗中，圈養(yǎng)組與放牧組哈薩克馬腸道菌群在門水平上由厚壁菌門(78.08%. 76.10%)、擬桿菌門(15.72%. 17.16%)和疣微菌門(2.48%. 2.91%)等組成。不同馬品種在腸道菌群組成上可能不同。厚壁菌門的成員在代謝、消化吸收蛋白質和其他營養(yǎng)物質等功能中扮演著重要的作用，擬桿菌門是草食動物分解纖維素的主要菌群。本研究中，厚壁菌門和擬桿菌門在圈養(yǎng)組與放牧組腸道中占比相近，可能是兩種飼養(yǎng)條件下，宿主腸道菌群為應對能量和體溫脅迫而做出的適應性波動。

在本試驗中，瘤胃球菌是圈養(yǎng)組與放牧組的優(yōu)勢菌科和優(yōu)勢菌屬，有研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃球菌的數(shù)量與纖維素消化利用存在密切關系，在放牧組中還存在豐度較高的毛螺菌科、艱難桿菌科、羅氏菌屬、糞球菌屬和普雷沃氏菌屬等，這些軟化、發(fā)酵、降解纖維素的菌是放牧組馬匹能夠充分利用干草的微生物基礎。與放牧組相比，圈養(yǎng)組中糞便鏈球菌科顯著增加。不僅如此，圈養(yǎng)組中存在豐度較高的乳酸桿菌。有研究表明，糞便鏈球菌和乳酸桿菌的主要功能是參與淀粉類碳水化合物的水解，圈養(yǎng)組馬匹乳酸桿菌和鏈球菌相對豐度的增加，可能與飼糧中添加了淀粉類谷物有關，這與其他一些體外和體內研究得出的結果一致。

3.3 不同飼養(yǎng)模式下哈薩克馬腸道菌群標志物種及菌群功能

放牧組中的標志物種(瘤胃球菌、梭菌、羅氏菌、糞球菌、普雷沃氏菌、假丁酸弧菌、甲基桿菌等)均與降解/發(fā)酵纖維素有關。Baniel等在分析食性變化對獅尾狒(靈長類中唯一以草為食的種類)腸道菌群的影響時發(fā)現(xiàn)，以牧草為食的獅尾狒腸道中以纖維素分解/發(fā)酵細菌(梭菌、糞球菌、普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科的兩個菌屬)為主。圈養(yǎng)組中的標志物種為糞便鏈球菌、乳酸桿菌、WCHB1_25和韋榮氏球菌科的RFN20等。Arnold在飼喂谷物類淀粉的馬匹中發(fā)現(xiàn)，在消化道前段沒有被消化的玉米、燕麥、大麥和高粱等谷物淀粉到達后腸后，被馬后腸道的鏈球菌和乳酸桿菌等轉化為乳酸，乳酸繼續(xù)被韋榮氏球菌等轉化為丙酸，丙酸被盲腸壁吸收后為機體提供能量。這些研究結果可以為篩選不同飼養(yǎng)模式下標志物種提供一定的理論依據(jù)。

Baniel等得出當獅尾狒處于溫度較低的旱季(以干草等為食)時，菌群功能變化傾向于能量、氨基酸和脂質等代謝途徑。本研究結果顯示，圈養(yǎng)組和放牧組的馬匹菌群功能傾向于碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質代謝以及能量代謝等。在放牧組中能量代謝和萜類化合物和聚酮化合物的代謝顯著富集，放牧組馬匹在野外需要應對食物匱乏和風雪天氣，因此放牧組有著更高的能量需求，這些功能途徑的增加可以使放牧組馬匹在具有挑戰(zhàn)性的寒冷季節(jié)維持能量和溫度調節(jié)。傳染病這一功能途徑在圈養(yǎng)組中顯著富集，使馬匹有患腸道疾病的可能，這很有可能與圈養(yǎng)組馬匹補喂了谷物飼料有關，攝入的濃縮物、谷物以及淀粉，會引起腸道疼痛，增加腸道疾病的風險。

4 結 論

本研究通過16S rRNA基因測序分析，對冬季不同飼養(yǎng)模式下的哈薩克馬腸道菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)哈薩克馬在放牧與圈養(yǎng)條件下，腸道菌群的多樣性及組成結構存在整體性差異。哈薩克馬的腸道菌群是可塑的，其可以對飼養(yǎng)模式等變化做出快速的波動性反應。這些研究結果有助于研究人員進一步理解哈薩克馬腸道菌群多樣性與飼養(yǎng)模式之間的關系。