PK-15細(xì)胞的ISG15基因敲除促進(jìn)PRV的復(fù)制

李 琛，何文峰，趙麗娜，凡 啟，楊國慶，劉慧敏

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的可感染多種家畜和哺乳動(dòng)物的急性傳染病，以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及急性腦脊髓炎為主要癥狀。PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科。豬是PRV的唯一自然感染宿主以及長期貯存和傳播宿主。PRV感染豬后可建立持續(xù)性感染，主要潛伏在豬的外周神經(jīng)組織，在機(jī)體免疫低下或受到應(yīng)激時(shí)可被激活，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病甚至成為傳染源。PRV特殊的致病方式和感染方式給該病的防控帶來較大困難，嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。近年來，PRV更是突破了常規(guī)疫苗，導(dǎo)致豬偽狂犬病的防控難度極大，成為養(yǎng)豬業(yè)防控偽狂犬病所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

在病毒入侵機(jī)體過程中，宿主產(chǎn)生各種防御機(jī)制來保護(hù)機(jī)體，先天性免疫應(yīng)答是抵抗入侵病原體的第一道防線。PRV對宿主細(xì)胞的感染力很強(qiáng)，能夠引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN，分泌的IFN與其受體結(jié)合激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致數(shù)百個(gè)干擾素刺激基因(ISGs)的表達(dá)。其中，ISG15(interferon-stimulated gene15)作為誘導(dǎo)最強(qiáng)烈、反應(yīng)最快的ISG蛋白之一，在宿主抵御病毒感染的過程中發(fā)揮重要的作用。

近年來，對ISG15抗病毒復(fù)制的作用有越來越多的研究。ISG15可以通過作用于病毒入侵的各階段影響病毒的增殖，也可以作為免疫調(diào)節(jié)蛋白來調(diào)控宿主的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)PRV感染能顯著上調(diào)ISG15，過表達(dá)ISG15能明顯抑制PRV復(fù)制。但是ISG15抑制PRV復(fù)制的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建15基因敲除PK-15細(xì)胞系(PK15-ISG15)，利用PRV毒株檢測敲除15基因?qū)RV復(fù)制的影響，以期為進(jìn)一步研究ISG15抑制PRV 復(fù)制的分子機(jī)制提供新思路，同時(shí)為有效防控豬偽狂犬病提供新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)、PRV、ISG15兔多克隆抗體由作者實(shí)驗(yàn)室保存；pCompass-LVKO 載體購自Addgene；載體質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2購自Sigma；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Ⅰ、RNAiso Plus、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、Primer STARMax DNA Polymerase購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；MonAmpSYBRGreen qPCR Mix試劑購自莫納生物科技有限公司；PRV鼠源gE單克隆抗體購自普萊柯生物工程股份有限公司；β-actin抗體購自賽維爾生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8購自生工生物工程股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI網(wǎng)站所公布的豬15基因序列(GenBank No.：NM_001128469)，在15的單一外顯子上找到2個(gè)合適的靶位點(diǎn)，將此靶序列與豬的基因組序列進(jìn)行比對，僅在15基因座上找到完全匹配序列，針對2個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)sgRNA上游引物與下游引物，同時(shí)，在基因組靶序列兩側(cè)設(shè)計(jì)15的驗(yàn)證引物(表1)；通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢需要檢測的基因 mRNA序列，應(yīng)用Primer-Blast設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表1)。

表1 引物序列及相關(guān)信息Table 1 Sequences and information of primers used in our study

1.3 ISG15基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

1.3.1 敲除載體的構(gòu)建 將兩對sgRNA引物95 ℃ 5 min進(jìn)行退火雜交，退火后連接至Ⅰ限制性內(nèi)切酶線性化的pCompass-LVKO載體中。重組載體送北京擎科生物科技有限公司測序，將測序正確質(zhì)粒命名為pCompass-LVKO-ISG15-1、pCompass-LVKO-ISG15-2，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 敲除細(xì)胞系的構(gòu)建 將pCompass-LVKO-ISG15-1、pCompass-LVKO-ISG15-2與psPAX2、pMD2G以2∶1∶1的比例，共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞；培養(yǎng)48 h后收集包裝病毒上清液，取1 mL感染PK-15細(xì)胞，感染48 h后，用2 μg·mL嘌呤霉素篩選細(xì)胞，使用胰酶消化存活細(xì)胞，梯度稀釋后，按照每孔1個(gè)細(xì)胞的比例接種至96孔板，37 ℃，5% CO培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞。取15完全敲除的克隆，抽提基因組DNA后以此為模板，使用驗(yàn)證引物ISG15 VerF和ISG15 VerR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系：PrimerSTAR Max Premix 10 μL,上、下游引物(0.2 μmol·L)各0.4 μL，模板1 μL，ddHO 8.2 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。如果在619 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，可初步說明敲除15細(xì)胞構(gòu)建成功，將此條帶連接至pEASY-T1 simple載體，隨機(jī)挑選陽性克隆送公司測序。

1.4 ISG15敲除效率的驗(yàn)證

6孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞，各設(shè)3組重復(fù)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70%左右接種病毒，以PRV MOI=2感染細(xì)胞，感染24 h收取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取35 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h后，加入ISG15兔多克隆抗體(1∶5 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)1 h，ECL顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 細(xì)胞增殖(CCK-8)檢測

以每孔1×10個(gè)細(xì)胞在96孔板中鋪種PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。參照CCK-8試劑盒在不同時(shí)間點(diǎn)向指定培養(yǎng)孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，隨后用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 間接免疫熒光檢測

12孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞，各3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70%左右進(jìn)行病毒處理，以PRV MOI=2感染細(xì)胞，24 h后取出，PBS洗滌兩次，然后使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，使用破膜液滲透15 min。然后用封閉緩沖液(含5%脫脂奶粉的PBS)封閉細(xì)胞1 h后，加入鼠源PRV-gE抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，室溫避光孵育FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1∶200)，PBS清洗3遍。滴入封片劑平鋪覆蓋細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

6孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞，各3組重復(fù)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70%左右進(jìn)行病毒處理，以PRV MOI=2感染細(xì)胞，分別在0、6、12、24、36和48 h收取RNA。TRizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR檢測。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系20 μL：MonAmpSYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物(0.2 μmol·L)各0.4 μL，cDNA 3 μL，ddHO 6.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以-mRNA表達(dá)水平為內(nèi)參值，計(jì)算PRV-0、PRV-、PRV-16、-β mRNA水平。

1.8 Western blot檢測PRV-gE蛋白的表達(dá)

6孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞，各3組重復(fù)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70%左右進(jìn)行病毒處理，以PRV MOI=2感染細(xì)胞，感染0、6、12、24、36和48 h收取蛋白，BCA法測蛋白濃度。取35 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h后，加入ISG15兔多克隆抗體(1∶5 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)1 h后ECL顯影。以β-actin作為內(nèi)參。Image J軟件分析條帶灰度值比較ISG15敲除對PRV-gE蛋白表達(dá)的影響。

1.9 PRV子代病毒滴定測定

取對數(shù)生長期PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞接種于6孔板。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70%左右，棄去細(xì)胞培養(yǎng)物，PBS洗2遍，將稀釋好的PRV病毒液400 μL接種到各孔中，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱1 h，期間每隔15 min搖晃一次，以便病毒吸附；棄去病毒液，加入含1%瓊脂糖細(xì)胞維持液覆蓋各孔，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，10%福爾馬林固定30 min，棄去細(xì)胞覆蓋物，PBS洗2遍，用0.5%結(jié)晶紫染色30 min，選擇合適的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.10 ISG15與PRV共孵育試驗(yàn)

取對數(shù)生長期PK-15細(xì)胞稀釋接種于6孔板。培養(yǎng)至細(xì)胞融合度70%左右，進(jìn)行分組處理：第1組直接用PRV(MOI=2)感染細(xì)胞；第2組將PRV與BSA于37 ℃孵育1 h后加入細(xì)胞；第3組將PRV與ISG15蛋白孵育1 h后加入細(xì)胞。吸附1 h后，更換成2%維持培養(yǎng)基，24 h后收取細(xì)胞總RNA、總蛋白和上清。分別檢測PRV-gE的mRNA和蛋白表達(dá)，以及子代病毒的增殖。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，通過GraphPad Prism 8.0軟件中-test檢驗(yàn)方法對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 Cas9/sgRNA載體的構(gòu)建

為構(gòu)建15基因敲除PK-15細(xì)胞系，針對豬源15的第二外顯子，設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性的CRISPR-Cas9 sgRNA。利用Ⅰ末端序列將sgRNA克隆到pCompass-LVKO載體上，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCompass-LVKO-sgRNA構(gòu)建成功(圖1)，提取質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

框內(nèi)序列分別為sgRNA1和sgRNA2序列The sequences in box are sgRNA1 and sgRNA2 sequence respectively圖1 pISG15-sgRNA測序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of pISG15-sgRNA

2.2 PK-15敲除ISG15基因單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pCompass-LVKO-sgRNA轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，并以pCompass-LVKO空載體作為陰性對照。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行嘌呤霉素篩選，通過有限稀釋法挑選單克隆。單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板對15進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,在619 bp處有出現(xiàn)一條特異性條帶，初步說明該敲除細(xì)胞構(gòu)建成功 (圖2A)。將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，與對照細(xì)胞的序列對比分析結(jié)果顯示，sgRNA1細(xì)胞株的15基因外顯子打靶區(qū)缺失20 bp堿基，sgRNA2細(xì)胞株的15基因外顯子打靶區(qū)缺失8 bp堿基，選取sgRNA2 細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)功能評價(jià)，并命名為PK15-ISG15。

A. PCR擴(kuò)增(M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. 陽性克隆細(xì)胞PCR結(jié)果；4. PK-15細(xì)胞為陰性對照)；B. PK15-ISG15-/-單克隆細(xì)胞測序結(jié)果A. PCR amplification (M. DL5000 DNA marker; 1-3. The ISG15 PCR results of cell colonies; 4. PK-15 cell as a negative control); B. Sequencing results of PK15-ISG15-/- monoclonal cell圖2 PK15-ISG15-/-單克隆細(xì)胞的篩選Fig.2 Screen of PK15-ISG15-/-monoclonal cell line

2.3 ISG15基因敲除效率的鑒定及對細(xì)胞增殖的影響

為驗(yàn)證15敲除效率，Western blot檢測PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞中ISG15蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在PK-15細(xì)胞中可見明顯的ISG15條帶，而PK15-ISG15細(xì)胞中沒有檢測到ISG15的表達(dá)，證實(shí)PK-15細(xì)胞中15基因完全敲除(圖3A)。

A. Western blot檢測ISG15敲除效率(1.PK-15細(xì)胞；2.PK15-ISG15-/- sgRNA1；3.PK15-ISG15-/- sgRNA2)；B. 敲除ISG15基因?qū)?xì)胞增殖無影響。ns.差異不顯著A. ISG15 knockout efficiency by Western blot(1. PK-15 cell; 2. PK15-ISG15-/- sgRNA1 polyclonal cell; 3. PK15-ISG15-/- sgRNA2 polyclonal cell); B. ISG15 gene knockout can induce the replication of PK-15. ns. No significant difference圖3 ISG15基因敲除細(xì)胞系的鑒定Fig.3 Identification of PK-15 cell line knockout of ISG15 gene

通過CCK-8檢測敲除15基因后是否影響細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，敲除15基因后PK15-ISG15細(xì)胞與PK-15細(xì)胞相比，OD波長吸光度值差異不顯著(>0.05)，結(jié)果表明，15基因敲除對PK15細(xì)胞的增殖沒有顯著影響(圖3B)。

2.4 敲除ISG15基因?qū)RV病毒復(fù)制的影響

為了研究ISG15對PRV復(fù)制的影響，作者評估了PRV在PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞中的復(fù)制狀態(tài)。用MOI=2的PRV分別感染PK15細(xì)胞和PK15-ISG15細(xì)胞，通過間接免疫熒光檢測PRV蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，PRV在PK15-ISG15細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于PK-15細(xì)胞中的表達(dá)(圖4)。該結(jié)果初步表明，敲除15顯著促進(jìn)PRV復(fù)制。

熒光顯微鏡觀察PRV感染PK-15及PK15-ISG15-/-細(xì)胞對病毒復(fù)制的影響(80×)Effect of PRV infecting PK-15 and PK15-ISG15-/- cells on viral replication observed by fluorescence microscopy(80×)圖4 敲除ISG15基因促進(jìn)PRV復(fù)制Fig.4 Knockout of ISG15 gene promotes PRV replication

2.5 ISG15基因敲除對PRV不同基因及IFN-β轉(zhuǎn)錄水平的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證15基因敲除對PRV復(fù)制的影響，利用RT-qPCR檢測PK15-ISG15細(xì)胞在感染PRV后的不同時(shí)間點(diǎn)，PRV-0、PRV-、PRV-16的mRNA水平。與對照組PK-15細(xì)胞相比，PK15-ISG15細(xì)胞中 PRV-0、PRV-、PRV-16的mRNA水平極顯著升高(<0.01；<0.001)(圖5A～C)，表明15基因的敲除顯著促進(jìn)PRV基因轉(zhuǎn)錄。

A. RT-qPCR檢測感染PRV不同時(shí)間PRV-EP0基因mRNA水平；B. RT-qPCR檢測感染PRV不同時(shí)間PRV-gE mRNA水平；C. RT-qPCR檢測感染PRV不同時(shí)間PRV-VP16 mRNA水平；D. RT-qPCR檢測感染PRV不同時(shí)間IFN-β mRNA水平。*.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ns. P>0.05A. PRV-EP0 gene mRNA were quantified by RT-qPCR; B. PRV-gE gene mRNA were quantified by RT-qPCR; C. PRV-VP16 gene mRNA were quantified by RT-qPCR; D. PRV-IFN-β gene mRNA were quantified by RT-qPCR. *.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ns. P>0.05圖5 敲除ISG15基因促進(jìn)PRV基因轉(zhuǎn)錄、抑制PRV誘導(dǎo)的IFN-β基因轉(zhuǎn)錄Fig.5 Knockdown of ISG15 promotes PRV transcription and inhibits PRV-induced IFN-β transcription

同時(shí)檢測不同時(shí)間段-β的mRNA水平，結(jié)果顯示，PK15-ISG15細(xì)胞中-β mRNA水平感染在0～6 h差異不顯著；6～36 h時(shí)顯著低于對照組(<0.05)(圖5D)，表明15基因敲除可以顯著抑制-β的表達(dá)。

2.6 ISG15基因敲除對PRV蛋白表達(dá)的影響

相同感染復(fù)數(shù)(MOI=2)的PRV感染PK-15細(xì)胞和PK15-ISG15細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測結(jié)果顯示，PRV感染后不同時(shí)間PK15-ISG15細(xì)胞中 PRV-gE蛋白的表達(dá)量顯著高于對照PK-15細(xì)胞(圖6A)。PK-15細(xì)胞在感染PRV 12 h時(shí)檢測到PRV-gE蛋白，而PK15-ISG15細(xì)胞在感染PRV 6 h就可以檢測到PRV-gE蛋白，并且顯示在PRV感染12、24、36 h的PK15-ISG15細(xì)胞檢測到的PRV-gE蛋白明顯高于PK-15細(xì)胞。對PRV病毒蛋白的表達(dá)進(jìn)行灰度分析顯示，PK15-ISG15中PRV-gE的蛋白表達(dá)極顯著高于PK-15細(xì)胞(<0.001)(圖6B)。以上結(jié)果表明，15基因敲除促進(jìn)PRV-gE蛋白表達(dá)。

PRV gE蛋白Western blot結(jié)果(A)及灰度值分析結(jié)果(B)。***. P<0.001Western blot results of PRV gE protein(A)and gray value analysis results (B). ***. P<0.001圖6 敲除ISG15基因促進(jìn)PRV-gE蛋白表達(dá)Fig.6 Knockout of ISG15 gene promotes PRV-gE protein expression

2.7 ISG15基因敲除對PRV病毒滴度的影響

為研究PK-15和PK15-ISG15細(xì)胞擴(kuò)增PRV子代病毒滴度的差異，用相同感染復(fù)數(shù)(MOI=2)的PRV分別感染這兩種細(xì)胞，通過病毒噬斑法測定并計(jì)算PRV的病毒滴度。結(jié)果顯示，PK15-ISG15細(xì)胞的空斑數(shù)多于PK-15細(xì)胞，并且每個(gè)稀釋度的空斑數(shù)均高于PK-15細(xì)胞(圖7A、B)。如圖7C所示，隨著感染時(shí)間的增加，PK15-ISG15細(xì)胞的病毒滴度顯著高于PK-15細(xì)胞的病毒滴度(<0.05)，并且在12 h后PK15-ISG15細(xì)胞的病毒滴度極顯著高于PK-15細(xì)胞(<0.001)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)15基因敲除促進(jìn)PRV的增殖。

A．PRV感染24 h PK-15細(xì)胞病毒噬斑(1表示細(xì)胞對照；2～6表示病毒4倍梯度稀釋，圖中按照標(biāo)號(hào)順序每孔的空斑數(shù)量分別為0、1、2、14、40、153個(gè))；B．PRV感染24 h PK15-ISG15-/-細(xì)胞病毒噬斑(1表示細(xì)胞對照；2～6表示病毒4倍梯度稀釋，圖中按照標(biāo)號(hào)順序每孔的噬斑數(shù)量分別為0、1、7、26、94、190個(gè))；C. PK15-ISG15-/-細(xì)胞與PK-15細(xì)胞的病毒滴度。*P<0.05; ***.P<0.001A. Plaque of PK-15 cell at 24 hpi (1. Cell control; 2-6. Virus 4-fold gradient dilution, the number of plaques in each well according to the labeled order in the figure was 0, 1, 2, 14, 40 and 153, respectively); B. Plaque of PK15-ISG15-/- cell at 24 hpi (1. Cell control; 2-6. Virus 4-fold gradient dilution, the number of plaques in each well according to the labeled order in the figure was 0, 1, 7, 26, 94 and 190, respectively); C. Virus titers of PK-15 and PK15-ISG15-/- cell. *.P<0.05; ***.P<0.001圖7 敲除ISG15基因促進(jìn)PRV子代病毒的增殖Fig.7 Knockout of ISG15 gene promotes proliferation of PRV virus

2.8 ISG15蛋白對PRV復(fù)制的影響

為了驗(yàn)證ISG15是否通過抑制病毒入侵抑制PRV的復(fù)制，將純化的ISG15蛋白與PRV于37 ℃孵育1 h后感染細(xì)胞，通過Western blot、RT-qPCR和病毒噬斑分別檢測PRV的蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)錄水平以及病毒滴度，BSA與PRV孵育作為陰性對照，說明ISG15與PRV的相互作用是特異性的。Western blot檢測和灰度分析結(jié)果顯示，與對照組相比ISG15抑制PRV-gE蛋白的表達(dá)(<0.05)(圖8A)；RT-qPCR結(jié)果顯示，PRV-的mRNA水平較對照組顯著降低 (<0.05)(圖8B)；病毒噬斑結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ISG15可以抑制PRV的復(fù)制(<0.05)(圖8C)。以上結(jié)果表明，ISG15蛋白對PRV的抑制作用是通過抑制病毒侵入宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。

A. Western blot檢測不同處理PRV感染后PRV-gE蛋白表達(dá)(左)及灰度值分析結(jié)果(右)；B. RT-qPCR 檢測不同處理PRV感染后PRV-gE基因的mRNA水平；C. 病毒噬斑檢測不同處理PRV感染后病毒滴度。*. P<0.05A. Expression of PRV-gE protein after infection with different treatments of PRV by Western blot (left) and gray value analysis results (right); B. Expression of PRV-gE protein after infection with different treatments of PRV by RT-qPCR; C. Virus titer after infection with different treatments of PRV by plaque. *. P<0.05圖8 ISG15通過抑制病毒入侵抑制PRV的復(fù)制Fig.8 ISG15 inhibits PRV replication by inhibiting viral invasion

3 討 論

ISG15是由病原微生物IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的，在宿主防御和清除外源病原感染方面發(fā)揮重要作用。ISG15已被證明在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用，既可以通過直接作用影響病毒感染的各階段，也可以通過間接作用影響病毒感染的宿主信號(hào)通路，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。由于作用機(jī)理的差異，ISG15在不同病原體之間甚至不同宿主物種之間的重要性可能會(huì)有所不同。對ISG15的研究有助于抗病毒藥物的研發(fā)，也能為干預(yù)許多疾病的進(jìn)展提供新的靶標(biāo)。本試驗(yàn)利用近年來發(fā)展迅速的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲除15基因的PK-15細(xì)胞系，選取sgRNA2細(xì)胞株進(jìn)行功能評價(jià)，并將該細(xì)胞克隆命名為PK15-ISG15，用于研究ISG15對PRV復(fù)制的影響及作用機(jī)制。

敲低15可促進(jìn)A型流感病毒(influenza virus，IAV)的復(fù)制。Nicholl等研究表明，單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染可以激活15、等干擾素應(yīng)答基因，從而抑制HSV-1的復(fù)制。Hsiao等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ISG15可以顯著抑制日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的復(fù)制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PRV感染PK-15細(xì)胞后引起ISG15的表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)ISG15顯著抑制PRV的復(fù)制。然而，ISG15抑制PRV復(fù)制的分子機(jī)制尚不清楚。本研究利用構(gòu)建的PK15-ISG15細(xì)胞系對15基因在PRV感染過程中的作用加以探究。結(jié)果表明，15基因的敲除能夠顯著增加PRV基因的轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白的翻譯以及病毒的增殖，由此確定了ISG15對PRV具有抗病毒作用，敲除ISG15能夠促進(jìn)PK-15細(xì)胞中PRV的復(fù)制。

病毒入侵機(jī)體后，免疫系統(tǒng)可以識(shí)別病毒來源的核酸，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN、促炎性細(xì)胞因子等。Chen等發(fā)現(xiàn)PRV感染過程中，ISG20在PK-15細(xì)胞中通過增強(qiáng)IFN-β信號(hào)抑制PRV復(fù)制。ISG15在抑制PRV復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ISG15敲除能抑制IFN-β的表達(dá)，推測 ISG15抗PRV復(fù)制的作用可能是通過調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN實(shí)現(xiàn)，這其中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究和闡明，本文構(gòu)建的15敲除細(xì)胞系可以為該機(jī)制的研究提供有力工具。

4 結(jié) 論

從PK-15細(xì)胞中敲除15并通過IFA、RT-qPCR、Western blot和病毒噬斑評估了15基因敲除后對PRV復(fù)制的影響，確定了ISG15對PRV的抗病毒作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)敲除15能夠抑制IFN-β的表達(dá)，在一定程度上促進(jìn)PRV的復(fù)制。本研究為進(jìn)一步探討ISG15抑制PRV復(fù)制的分子機(jī)制提供良好的生物材料。