基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合16S rDNA高通量測序技術(shù)分析丹參對感染大腸桿菌小鼠腸道菌群的影響

王 樂，陳泓岑，張永紅，吳 瓊，侯佳佳，王天祎，盧天航，黃傳發(fā)，張 華，崔德鳳

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

隨著畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展，飼料添加劑的發(fā)展進(jìn)入了一個新的階段，中草藥飼料添加劑以其能預(yù)防動物疾病、提高畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量和繁殖性能等優(yōu)點(diǎn)而日益受到關(guān)注，應(yīng)用前景極為廣闊。相對于抗生素而言，中草藥具有促進(jìn)動物生長，提高生產(chǎn)性能，改善動物機(jī)體免疫，抗氧化、抗炎、抗菌，減少有害氣體排放，降低抗性基因蓄積及轉(zhuǎn)移等作用，可作為抗生素替代產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于畜禽健康養(yǎng)殖。不論從健康角度還是從經(jīng)濟(jì)效益角度來看，替代抗生素產(chǎn)品的生產(chǎn)和研發(fā)顯得尤為重要，而中草藥以其獨(dú)有的優(yōu)勢成為眾多學(xué)者的優(yōu)先選擇。因此，開發(fā)安全性高的中藥飼料添加劑代替原有的抗生素及化學(xué)藥物將是大勢所趨。

丹參又名赤參、紫丹參、紅根等，為唇形科植物丹參的干燥根和根狀莖。味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，用于胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，瘡瘍腫痛。據(jù)報(bào)道，丹參的化學(xué)成分主要分為兩大類：脂溶性二萜醌類化合物和水溶性酚酸類成分。其中脂溶性包括丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱ A、丹參酮Ⅱ B、二氫丹參酮、隱丹參酮等，具有抗氧化、消炎、抑菌等作用；而水溶性成分包括丹參素、丹酚酸等，具有抑制血小板凝聚、擴(kuò)張冠狀動脈等作用。李曉明等研究表明，在衣霉素(1 mg·kg) 灌胃復(fù)制小鼠急性肝損傷模型中，經(jīng)丹參酮 Ⅱ 處理后，其可通過抑制肝組織Grp78/caspase-12 通路活化，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，改善衣霉素所致的小鼠急性肝損傷。張東濤等用丹參水提物治療乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)丹參水提物對缺氧-復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，這可能與 PI3K/Akt 信號通路的激活有關(guān)。由此可見，丹參對緩解應(yīng)激具有良好的作用。

然而，目前關(guān)于丹參是否對腸道菌群失衡具有調(diào)節(jié)作用，尚未見報(bào)道。因此，本研究以丹參提取物為研究對象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與高通量測序16S rDNA技術(shù)研究丹參對小鼠大腸桿菌感染模型的腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期闡明丹參提取物調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制，為丹參提取物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹參活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)的收集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索丹參活性成分，根據(jù)TCMCP，口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18表示藥物成分口服吸收良好并且適合于藥物開發(fā)，藥物對小腸上皮細(xì)胞通透性(Caco-2)≥0.4表示藥物對小腸上皮細(xì)胞通透性良好。因此，根據(jù)OB≥30%、DL≥ 0.18、Caco-2≥0.4這3個參數(shù)對丹參活性成分進(jìn)行初步篩選。同時收集活性成分所對應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，利用 STRING 數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org)，轉(zhuǎn)換靶點(diǎn)蛋白為對應(yīng)的基因名稱。

1.2 E. coli靶點(diǎn)基因的獲取

在 Genecards數(shù) 據(jù) 庫(https://www.genecards.org/) 中輸入關(guān)鍵詞“”，查詢并收集其靶點(diǎn)基因；將已轉(zhuǎn)換成基因名的丹參活性成分作用靶點(diǎn)與靶點(diǎn)基因取交集(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，從而得到丹參治療感染的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 丹參治療E. coli感染的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將活性成分與對應(yīng)潛在作用靶點(diǎn)基因?qū)?Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建丹參治療感染的“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用軟件中“Network Analyzer”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，可獲得活性成分及作用靶點(diǎn)的連接度(Degree)、緊密度(Closenesss)及介度(Betweenness)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。選取丹參成分連接度≥平均數(shù)為關(guān)鍵活性成分，靶點(diǎn)連接度≥平均值為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 丹參成分蛋白互作網(wǎng)絡(luò)KEGG通路與GO 功能富集分析

利用DAVID 數(shù) 據(jù) 庫(https://david.ncifcrf.gov/)，物種選擇“”，對潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，利用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，其中GO功能分析包括生物學(xué)過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)及細(xì)胞成分(Cellular component，CC)分析。

1.5 動物分組與處理

本試驗(yàn)以安徽地區(qū)精品丹參經(jīng)煎熬回旋蒸發(fā)濃縮后獲得的丹參提取藥液為研究對象，以110只體重為(20±5)g的昆明小鼠作為試驗(yàn)對象，隨機(jī)分為5組：對照組(CON)、大腸桿菌感染組()、飼喂低劑量丹參提取物大腸桿菌感染組(EL)、飼喂中劑量丹參提取物大腸桿菌感染組(EM)、飼喂高劑量丹參提取物大腸桿菌感染組(EH)，每組22只。參考人推薦用量的1、5、10倍，設(shè)丹參提取物的藥物濃度分別為0.0195、0.039、0.078 g·mL，分別為本次試驗(yàn)的低、中、高劑量丹參提取物大腸桿菌感染組給藥劑量。小鼠體重以20 g計(jì)，按390 mg·kg量進(jìn)行灌胃，即每次每只試驗(yàn)鼠灌胃0.2 mL。每日定時定量灌胃1次，連續(xù)28 d，各丹參組灌胃不同濃度藥物0.2 mL，對照組與大腸桿菌感染組均灌胃0.2 mL同等劑量的生理鹽水。

1.6 菌種的復(fù)蘇

將檢查過菌種純度的O菌種進(jìn)行傳代復(fù)蘇。在滅菌的試管當(dāng)中進(jìn)行將該菌種的復(fù)蘇，將凍存菌液加入到5 mL左右的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，置于搖床上，轉(zhuǎn)速設(shè)定成為220 r·min，溫度設(shè)定成為37 ℃，培養(yǎng)12 h，傳三代復(fù)蘇至鏡下觀察菌形態(tài)良好即可。將菌液用比濁管比濁，將菌液濃度大概培養(yǎng)至 6×10CFU·mL。

1.7 大腸桿菌的腹腔注射

本試驗(yàn)的5組小鼠連續(xù)灌胃28 d后，將新鮮培養(yǎng)所得的O按半數(shù)致死量對灌胃低、中、高劑量丹參組和大腸桿菌感染組進(jìn)行腹腔注射0.2 mL·只，而對照組腹腔注射0.2 mL·只的無菌生理鹽水，觀察24 h。

1.8 腸道菌群高通量測序

丹參組和大腸桿菌感染組腹腔注射O及對照組注射無菌生理鹽水24 h后取小鼠的糞便，進(jìn)行標(biāo)記，保存于-80 ℃。使用MagPure Stool DNA KF試劑盒B(Magen，中國)，按照制造商的說明書提取糞便樣本的微生物群落DNA。使用Qubit dsDNA BR Assay kit (Invitrogen公司，美國)對DNA進(jìn)行定量，并用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行均一檢測。使用引物341 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的可變區(qū)V3-V4。正向和反向引物均用Illumina接頭、pad和接頭序列標(biāo)記。在含有30 ng模板、融合PCR引物和PCR主混合物的50 μL反應(yīng)中進(jìn)行PCR富集。PCR循環(huán)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用AmpureXP磁珠純化，在洗脫緩沖液中洗脫。庫通過Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司)鑒定。使用經(jīng)過驗(yàn)證的文庫在Illumina MiSeq平臺(中國深圳BGI)上按照Illumina標(biāo)準(zhǔn)管道進(jìn)行測序，并產(chǎn)生2×300 bp 的雙端讀數(shù)。

1.9 生物信息學(xué)分析

美吉生物一站式科研服務(wù)平臺(http://www.majorbio.com/)的物種組成分析選項(xiàng)功能中物種Venn圖分析，統(tǒng)計(jì)多組或多個樣本中所共有和獨(dú)有的物種(如OTU)數(shù)目，可以比較直觀地展現(xiàn)不同環(huán)境樣本中物種(如OTU)組成相似性及重疊情況；物種組成分析選項(xiàng)功能中群落組成分析，在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的物種豐度。根據(jù)線性判別分析(liner discriminant analysis，LDA)進(jìn)行LEfSe 多級物種差異判別分析，找出組間在豐度上有顯著差異的物種?；蚪M功能預(yù)測與分析應(yīng)用PICRUSt(PICRUSt流程存儲了Greengene ID對應(yīng)的COG信息和KO信息)對OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即去除16S marker gene在物種基因組中的copy數(shù)目的影響；然后通過每個OTU 對應(yīng)的Greengene ID，獲得OTU對應(yīng)的COG家族信息和KEGG Ortholog (KO)信息；并計(jì)算各COG的豐度和KO豐度。根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的信息，可以從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG的描述信息，以及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的信息，可以獲得KO、Pathway、EC信息，并能根據(jù)OTU豐度計(jì)算各功能類別的豐度。此外，針對Pathway，運(yùn)用PICRUSt可獲得代謝通路的3個水平信息，并分別得到各個水平的豐度表。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2021進(jìn)行初步處理，采用SPSS 21.0軟件ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 丹參活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)

通過TCMSP平臺，輸入“丹參”搜索。依據(jù)設(shè)定的OB值、DL值、Caco-2值，從202個化合物中篩選出41個符合條件的化合物(表1)。將符合條件但靶點(diǎn)數(shù)為0的化合物，如α-amyrin、sclareol、microstegiol、NSC 122421、tanshinone iia活性成分去除后，最終剩余36個活性成分及669個蛋白質(zhì)靶點(diǎn)；進(jìn)入STRING 數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org)，選擇Multiple protein，Lists of Name輸入669個蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，物種選擇“Human”，最終轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名。

表1 丹參活性成分Table 1 Active components of Radix Salviae Miltiorrhizae

(續(xù)表1 Continued)

2.2 丹參治療E. coli感染的潛在作用靶點(diǎn)

從Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中共獲取基因8 902個。同時利用Venny 2.1軟件將丹參活性成分的作用靶點(diǎn)與基因靶點(diǎn)取交集，共獲得51個潛在作用靶點(diǎn)。

2.3 丹參活性成分蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲得的51個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，通過Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理，并將丹參活性成分與潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行對應(yīng)，得到活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)包含87個節(jié)點(diǎn)，457條邊，87個節(jié)點(diǎn)包括 36個活性成分與51個潛在作用靶點(diǎn)，457條邊代表丹參活性成分與潛在作用靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，長方形代表丹參活性成分，六邊形代表潛在作用靶點(diǎn)。通過 Cytoscape 3.8.2軟件的內(nèi)置“network analyze”插件分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，得到活性成分及潛在作用靶點(diǎn)的介度、緊密度、連接度。經(jīng)計(jì)算，活性成分的連接度平均數(shù)為12.69，故選取連接度≥12.69為關(guān)鍵活性成分。關(guān)鍵活性成分作用的靶點(diǎn)個數(shù)較多，可能是丹參治療感染的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，選取連接度>10為關(guān)鍵靶點(diǎn)，共有18個靶點(diǎn)符合，分別為PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、CHRM3、NCOA1、PTGS1、ACHE、CA2、RXRA、OPRD1、ADRA1B、CHRM2、NCOA2、SERPIND1、ESR1、AR、DPP4。

圖1 丹參治療E. coli感染的活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Active components-potential action target network of Radix Salviae Miltiorrhizae response to E. coli infection

2.4 丹參成分蛋白互作網(wǎng)絡(luò)通路與GO功能富集分析

通過 Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)的51個潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，得到<0.01的通路82條，選取<0.01，Count≥6通路可視化(圖2)。同時，找出18個關(guān)鍵靶點(diǎn)所對應(yīng)的通路為關(guān)鍵信號通路，共47條。主要包含神經(jīng)活性配體-受體相互作用、5-羥色胺能突觸、雌激素信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、cGMP-PKG信號通路等途徑。

圖2 KEGG信號通路富集分析Fig.2 KEGG signaling pathway enrichment analysis

通過 DAVID數(shù)據(jù)庫對丹參治療感染的51個潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 富集分析。以<0.05為篩選條件，獲得 BP、MF、CC條目各 174、76、45條。值從小到大排名前10可視化(圖3)。結(jié)果顯示，丹參成分作用的BP主要富集在細(xì)胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路、突觸囊泡胞吐調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)節(jié)，DNA模板、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、核糖核酸聚合酶ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、血壓調(diào)節(jié)；MF主要富集在RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、血清素結(jié)合、類固醇激素受體活性、高分子復(fù)合物結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、類固醇結(jié)合；CC主要富集在神經(jīng)元投射、突觸前膜的組成成分、樹突、高分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜的整體部件、突觸后膜的組成成分、軸突、谷氨酸能突觸、質(zhì)膜。

圖3 GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis

2.5 關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-關(guān)鍵信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)拓?fù)鋮?shù)、KEGG、GO 富集分析所得到的關(guān)鍵成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、關(guān)鍵信號通路，構(gòu)建丹參治療“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-關(guān)鍵信號通路”網(wǎng)絡(luò)(圖4)。結(jié)果顯示，關(guān)鍵成分為丹參“酮、醌”型結(jié)構(gòu)的脂溶性成分。由圖4可知，丹參的1種活性成分可對應(yīng)1個或多個靶標(biāo)，多種活性成分可對應(yīng)相同的靶標(biāo)，提示丹參治療感染具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

圖4 丹參治療E. coli感染的“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Network of “key components-key targets-signaling pathway” of E.coli infection treated with Radix Salviae Miltiorrhizae

2.6 測序數(shù)據(jù)處理和稀釋曲線

2.6.1 測序數(shù)據(jù)處理 小鼠糞便樣本中，剔除低質(zhì)量序列，最終檢出了950 855個有效序列進(jìn)行后續(xù)的分析，去除掉Barcode后，平均長度為460 bp左右。

2.6.2 稀釋曲線 按試驗(yàn)數(shù)據(jù)在各個測序深度下檢測到的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線。在曲線的起始段，每條曲線的斜率很大，隨著測序的增加曲線趨于平緩，顯示大部分樣品達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，說明測序的充分性足夠，滿足后續(xù)分析要求(圖5)。

圖5 OTU稀釋曲線Fig.5 OTU dilution curve

2.7 菌群相似度分析

通過聚類，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，每個小組為一個分類操作單元(OTU)，通常在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。由圖6可知，各組之間共有和單獨(dú)含有的OTUs數(shù)量。其中對照組本身含有519個OTUs，大腸桿菌組本身含有174個OTUs，低劑量丹參提取物大腸桿菌感染組本身含有581個OTUs，中劑量丹參提取物大腸桿菌感染組本身含有565個OTUs，高劑量丹參提取物大腸桿菌感染組本身含有698個OTUs，對照組與大腸桿菌組共有的OTUs數(shù)量為130個。丹參低劑量大腸桿菌感染組與大腸桿菌感染組共有的OTUs數(shù)量為156個，丹參中劑量大腸桿菌感染組與大腸桿菌感染組共有的OTUs數(shù)量為135個，丹參高劑量大腸桿菌感染組與大腸桿菌感染組共有的OTUs數(shù)量為136個；丹參低劑量大腸桿菌感染組與對照組共有的OTUs數(shù)量為409個，丹參中劑量大腸桿菌感染組與對照組共有的OTUs數(shù)量為429個，丹參高劑量大腸桿菌感染組與對照組共有的OTUs數(shù)量為403個。說明單獨(dú)感染大腸桿菌減弱了與正常組小鼠菌群的相似度，飼喂低、中、高劑量丹參的大腸桿菌感染組與對照組共有的OTUs數(shù)量分別增加了253、294和267個，說明丹參可以提高各組小鼠腸道內(nèi)菌群的相似度，緩解大腸桿菌對小鼠腸道菌群的損害。

CON. 對照組；E. coli. 大腸桿菌感染組；EL. 低劑量丹參大腸桿菌感染組；EM. 中劑量丹參大腸桿菌感染組；EH. 高劑量丹參大腸桿菌感染組。下同CON. Blank control group; E. coli. E. coli infection group; EL. Low dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group; EM. Medium dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group; EH. High dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group. The same as below圖6 五組小鼠糞便的韋恩圖分析Fig.6 Venn diagram analysis of feces from five groups of mice

2.8 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)中Chao指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣品中群落的多樣性，其中的Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，大腸桿菌感染組極顯著降低了腸道菌群豐富度(<0.01)，而丹參低、中、高劑量大腸桿菌感染組極顯著提高了腸道菌群豐富度(<0.01)，其中丹參高劑量組與其他兩個劑量組相比，效果更佳(表2)。與對照組相比，大腸桿菌組腸道菌群多樣性顯著降低(<0.05)，而丹參低、中、高劑量大腸桿菌感染組與對照組和大腸桿菌感染組相比，則顯著增加了腸道菌群多樣性(<0.05)。

表2 Alpha多樣性結(jié)果Table 2 The results of alpha diversity %

2.9 菌群相對豐度變化

2.9.1 門分類學(xué)水平上的差異 如表3與圖7所示，在門水平上相對排名前三的菌群依次為Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)。與對照組相比，大腸桿菌感染組中的Bacteroidetes極顯著減少(<0.01)，F(xiàn)irmicutes豐度顯著減少(<0.05)，Proteobacteria豐度極顯著增高(<0.01)；與大腸桿菌感染組相比，添加丹參低，中，高劑量大腸桿菌組中的Bacteroidetes豐度極顯著增高(<0.01)、Firmicutes豐度顯著增高(<0.05)，Proteobacteria豐度極顯著降低(<0.01)。說明低、中、高劑量丹參提取物可以緩解大腸桿菌對腸道菌群的破壞，從而維護(hù)腸道菌群平衡。

表3 門水平排名前三菌群相對豐度的變化Table 3 Changes in relative abundance of top three microflora at phylum level %

不同顏色的柱子代表不同的物種，柱子的長短代表該物種所占比例的大小。下同The columns of different colors represent different species, and the length of the column represents the proportion of the species. The same as below圖7 門水平的樣本物種組成分析Fig.7 Analysis of sample species composition at phylum level

2.9.2 屬分類學(xué)水平上的差異分析 如表4與圖8所示，在屬水平上相對排名前五的菌群分別為(擬桿菌屬)、(螺桿菌屬)、(乳桿菌屬)、(普氏菌屬)和Unclassified(未知菌屬)。與對照組相比，大腸桿菌感染組中的、、、豐度極顯著降低(<0.01)，Unclassified豐度無顯著差異(>0.05)；與大腸桿菌組相比，添加低劑量丹參大腸桿菌組中的、、Unclassified豐度極顯著增加(<0.01)，豐度顯著增加(<0.05)，豐度無顯著差異(>0.05)；添加中劑量丹參大腸桿菌組中的、、豐度極顯著增加(<0.01)，、Unclassified豐度無顯著差異(>0.05)；添加高劑量丹參大腸桿菌組中的、、Unclassified豐度極顯著增加(<0.01)，、豐度顯著增加(<0.05)。

表4 屬水平排名前五菌群相對豐度的變化Table 4 Changes in relative abundance of top five microflora at genus level %

圖8 屬水平的樣本物種組成分析Fig.8 Analysis of sample species composition at genus level

2.9.3 差異菌群篩選結(jié)果 LEfSe分析展示了組間在豐度上有顯著差異的物種。從圖9可以看出，共發(fā)現(xiàn)了14個差異菌群(LDA>4，<0.05)。其中，空白對照組占1種，屬水平上有___；大腸桿菌感染組占6種，科水平上有Enterobacteriaceae，屬水平上有-、___1，__，，；丹參高劑量大腸桿菌感染組占7種，綱水平上有unclassified_p__Firmicutes，目水平上有unclassified_p__Firmicutes、Lachnospirales，科水平上有unclassified_p__Firmicutes、Lachnospiraceae，屬水平上有___、。

圖中不同顏色節(jié)點(diǎn)表示各級分類水平上的微生物群落，淡黃色節(jié)點(diǎn)表示在兩個時間點(diǎn)對比均無顯著差異的菌群；紅色表示兩個時間點(diǎn)對比差異顯著，且在術(shù)前中顯著富集的菌群；藍(lán)色表示兩個時間點(diǎn)對比差異顯著The nodes with different colors indicated the microbial communities at all levels of classification, and the nodes with pale yellow color indicated the microflora with no significant difference compared at two time points. The red color indicated the flora with significant difference in comparison between the two time points and significant enrichment in pre-surgery; Blue indicates significant differences between the two time points圖9 LEfSe 分析比較對照組、大腸桿菌感染組、丹參高劑量大腸桿菌感染組差異菌群Fig.9 Differential gut bacterial in control group, E. coli infection group and high-dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group determined by LEfSe analysis

2.10 功能預(yù)測分析

2.10.1 COG 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果 基于美吉生物一站式科研服務(wù)平臺PICRUSt分析平臺的功能預(yù)測分析將獲得的 OTU 豐度表與Greengene 數(shù)據(jù)庫比對，獲得相應(yīng)的 COG 及 KO功能信息及其豐度。分析發(fā)現(xiàn)，EL、EM、EH組小鼠腸道菌群功能主要集中于氨基酸、碳水化合物運(yùn)輸與代謝，未知功能，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化，細(xì)胞壁/膜/生物合成等方面，此外還有與能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換，復(fù)制、重組和修復(fù)，轉(zhuǎn)錄，無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝等相關(guān)的功能基因，隨著丹參提取物劑量的增加能夠增強(qiáng)這些功能趨勢(圖10)。

圖10 COG功能分類Fig.10 COG functional classification

2.10.2 KEGG 功能預(yù)測 根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中得到的代謝通路Level 2豐度分析結(jié)果，各組共有 44 種代謝通路，根據(jù)Level 1可以分為6類，其中新陳代謝12種、遺傳信息處理4、環(huán)境信息處理3種、細(xì)胞生理過程4種、人類疾病12種和組織系統(tǒng)9種，去除人類疾病作旭日圖。由圖11可知，一級代謝通路分別為新陳代謝37.50%、環(huán)境信息處理9.38%、遺傳信息處理 12.50%、細(xì)胞過程 12.50%、組織系統(tǒng)28.13%。二級主要代謝通路有Carbohydrate metabolism-碳水化合物代謝(3.99%)、Amino acid metabolism-氨基酸代謝(3.72%)、Signal transduction-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(7.40%)、Replication and repair-復(fù)制和修復(fù)(4.41%)、Cell growth and death-細(xì)胞生長和死亡(5.56%)、Endocrine system-內(nèi)分泌系統(tǒng)(9.14%)、Immune system-免疫系統(tǒng)(5.63%)。

圖11 KEGG 一級和二級代謝通路Fig.11 KEGG of category level 1 and 2

2.10.3 腸道菌群基因功能預(yù)測 通過美吉PICRUt 分析發(fā)現(xiàn)，在KEGG L2水平，組與EH組在代謝途徑上存在明顯差異(圖12)。在EH組存在顯著差異的功能通路有11個(<0.01)，主要包括肽聚糖生物合成、錯配修復(fù)、DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)輸出、同源重組、核糖體、氨酰tRNA生物合成、光合作用、萜類骨架生物合成、賴氨酸生物合成、谷氨酰胺與谷氨酸代謝，在組有2個差異極顯著的功能通路(<0.01)，主要包括生物膜形成-銅綠假單胞菌、C5-支鏈二元酸代謝。

圖12 E. coli組與EH組在KEGG L2水平代謝途徑差異分析圖Fig.12 Analysis chart of metabolic pathway difference between E. coli group and EH group at KEGG L2 level

3 討 論

腸道菌群數(shù)量多、種類龐大而且功能復(fù)雜多樣，正常的菌群微生態(tài)在動物的發(fā)育、代謝、免疫、感染的預(yù)防及治療等方面發(fā)揮了舉足輕重的作用，而這種平衡的關(guān)系一旦被打破，則會引起疾病的發(fā)生。在過去的生產(chǎn)中，主要使用抗生素來解決腸道菌群失調(diào)等問題，其作用機(jī)理是殺滅或抑制畜禽體內(nèi)(特別是消化道內(nèi))的有害微生物，調(diào)節(jié)畜禽胃腸道微生態(tài)平衡，從而改善動物機(jī)體健康，促進(jìn)動物生長。然而長期使用抗生素會導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生進(jìn)而降低藥效，使疾病難控，此外抗生素殘留在動物性食品中也將危害人類健康。在此環(huán)境下，中藥以其很少產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小、且能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。臨床上中藥的有效成分與腸道菌群相互作用，大多數(shù)藥物經(jīng)腸內(nèi)菌群吸收代謝后發(fā)揮藥效。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，通過OB、DL 和Caco-2參數(shù)來篩選丹參的有效成分，為其在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過篩選丹參的36種有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，丹參成分作用的生物學(xué)過程主要富集在細(xì)胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的正調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)等；這與先前的研究結(jié)果相一致，丹參具有通經(jīng)止痛、活血化瘀及涼血消癰等功效，而且還有抗氧化、抗菌消炎、保護(hù)心臟、抗肝損傷等作用?？捎糜谂R床上肝炎、腫瘤、冠心病等治療。羅曉梅等研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥大鼠模型中，丹參注射液能改善心肌功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗氧化通路，下調(diào)炎癥通路，進(jìn)而對膿毒癥大鼠心肌損傷起到治療作用。此外，本研究揭示了丹參有效成分的分子功能富集分析主要在RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、血清素結(jié)合、類固醇激素受體活性等方面；細(xì)胞成分主要富集在神經(jīng)元投射、突觸前膜的組成成分、質(zhì)膜的整體部件、谷氨酸能突觸等方面。值得注意的是，Luo等研究表明，用丹參提取物治療卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠，可減少氣道炎癥細(xì)胞浸潤、Th1/Th2細(xì)胞因子量和杯狀細(xì)胞增生，減輕OVA致敏哮喘小鼠的氣道炎癥。Liu等采用丹酚酸B (SAB)治療實(shí)驗(yàn)性肺纖維化，發(fā)現(xiàn)SAB通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷而在肺纖維化中發(fā)揮抗炎作用，減少氧化應(yīng)激損傷主要通過抑制內(nèi)皮通透性和通過MAPK和NF-κB信號通路表達(dá)促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)。由此可見，丹參具有抗菌、抗炎和減少機(jī)體氧化損傷的作用。此外，本研究通過“成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參治療感染的關(guān)鍵成分為丹參“酮、醌”型結(jié)構(gòu)的脂溶性成分。據(jù)報(bào)道，從總丹參酮中分離得到丹參酮 Ⅰ、丹參酮 ⅡA、丹參酮 ⅡB、隱丹參酮、羥基丹參酮、丹參酸甲酯；另外還有4個新成分：二氫丹參酮 Ⅰ、丹參新鯤甲、乙、丙，所分離到的化學(xué)成分經(jīng)體外抑菌試驗(yàn)表明，具有二氫呋喃結(jié)構(gòu)的隱丹參酮和二氫丹參酮 Ⅰ有較強(qiáng)的抑菌作用，而其他具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的成分抑菌作用弱或沒有表現(xiàn)出抑菌作用。陳姍姍等研究發(fā)現(xiàn)，丹參新酮能抑制 THP-1 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)2、1 基因的表達(dá)，Bax/Bcl-2 的值增大，激活促凋亡因子caspase-3有關(guān)。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，丹參新酮以劑量依賴的方式下調(diào)-、-1b、-6、-8基因的表達(dá)，表明丹參新酮對炎癥性腸病的抗炎作用可能是通過調(diào)TLR4/NF-κB/IQGAP2信號通路實(shí)現(xiàn)的。由此可推測，丹參可能通過抑制大腸桿菌所引起的細(xì)胞凋亡以及機(jī)體的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮主要作用。本研究的丹參提取物雖然表現(xiàn)出了良好的改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和抗大腸桿菌感染的作用，但具體發(fā)揮作用的有效成分作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

此外，丹參抗感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 富集分析表明，cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路具有重要的作用。據(jù)報(bào)道，環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)是作為哺乳動物體內(nèi)重要且保守的第二信使之一，可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號參與調(diào)節(jié)多種器官和組織的發(fā)育及生理功能。劉陽研究發(fā)現(xiàn)，和胃理氣方通過激活 cAMP/PKA 信號通路，提高 cAMP和PKA的表達(dá)，能夠改善肝郁氣滯型 FD 模型大鼠的胃腸排空，調(diào)節(jié)胃腸功能，進(jìn)而促進(jìn)胃腸動力。值得注意的是，PI3K/Akt 信號通路由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激B(PKB/Akt)兩部分組成，參與多種生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時還參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)得到丹參抗感染的主要通路為cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路，在前人的研究基礎(chǔ)上，得知這兩條通路可以作用胃腸和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，從而為丹參治療大腸桿菌感染所致的菌群失調(diào)提供了相關(guān)理論依據(jù)。

本研究OTU聚類分析和Alpha多樣性結(jié)果表明，感染大腸桿菌的小鼠腸道內(nèi)菌群的豐富度與均勻度都呈下降趨勢，而灌服了低、中、高劑量丹參素提取物之后再感染大腸桿菌的小鼠糞便中，菌群豐富度與均勻度與正常組相似，說明灌服丹參提取物可以提高大腸桿菌感染小鼠腸道中菌群的多樣性，其中高劑量丹參提取物組效果最好。此外，通過菌群相似度分析可知，單獨(dú)感染大腸桿菌減弱了與正常組小鼠菌群的相似度，但飼喂低、中、高劑量丹參組與對照組共有的OTUs數(shù)量皆有所增加，說明丹參可以提高小鼠腸道內(nèi)菌群OTUs數(shù)量，緩解大腸桿菌對小鼠腸道菌群的損害性。運(yùn)用分類學(xué)組成，通過不同組分的菌群構(gòu)成比例繪制柱狀圖發(fā)現(xiàn)，丹參主要影響門水平中的Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)，前兩者是健康宿主共有的腸道微生物優(yōu)勢菌群。擬桿菌門和厚壁菌門在大腸桿菌感染組中含量較低，在丹參低、中劑量大腸桿菌感染組依次升高，丹參高劑量大腸桿菌感染組有所降低，但整體為增長趨勢，因此丹參可以緩解大腸桿菌對腸道菌群的破壞，使腸道內(nèi)菌群接近對照組，維護(hù)腸道菌群平衡，丹參中劑量組藥效最佳。在屬水平上，丹參主要影響的是(擬桿菌屬)、(螺桿菌屬)，擬桿菌屬是擬桿菌門中重要的糖化菌，可以產(chǎn)生豐富的糖苷水解酶，將三萜糖苷等轉(zhuǎn)化為極性較小且親脂性更高的小分子，從而更好地被腸道吸收，說明丹參誘導(dǎo)腸道菌群中擬桿菌屬的相對豐度增加有利于小鼠機(jī)體更好地維持生理狀態(tài)。此外，通過COG、KEGG代謝通路對比分析發(fā)現(xiàn)，丹參對抗大腸桿菌感染的功能主要集中在氨基酸運(yùn)輸和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝上，說明可能含有豐富的蛋白分解、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝酶相關(guān)基因，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，丹參治療感染作用機(jī)制可能是通過18種關(guān)鍵藥物活性成分作用于動物機(jī)體關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、CHRM3、NCOA1、PTGS1、ACHE、CA2、RXRA、OPRD1、ADRA1B、CHRM2、NCOA2、SERPIND1、ESR1、AR、DPP4，影響cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路等。丹參主要通過影響腸道菌群的Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)的豐度來緩解大腸桿菌感染對小鼠腸道菌群的損害作用，調(diào)控菌群平衡。