田 雨，郭瑩瑩，李 娜，尹大芳，王聯(lián)珠,，許加超,

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266101；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

紫菜（）是我國(guó)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型海藻之一，富含蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)和多酚等物質(zhì)。目前我國(guó)栽培的紫菜主要分為壇紫菜（）和條斑紫菜（）兩種，其中壇紫菜主要產(chǎn)于我國(guó)的福建、廣東和浙江等地，以國(guó)內(nèi)消費(fèi)為主，常見(jiàn)的商品形式為干壇紫菜及沖泡類湯料。壇紫菜的生長(zhǎng)和采收季節(jié)性非常強(qiáng)，福建地區(qū)一般在9月份開(kāi)始苗簾下海，10月份左右進(jìn)行采收，采收期可以一直持續(xù)到翌年的2月份。初次采收的壇紫菜稱為頭水紫菜最為珍貴，之后一般每隔15～20 d左右采收一次。有研究認(rèn)為不同采收期的紫菜在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面存在差異，一般隨采收期的延伸紫菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)逐漸降低。

酚類物質(zhì)是從植物中發(fā)現(xiàn)的一大類次生代謝產(chǎn)物，主要包括酚酸和類黃酮兩大類，藻類、水果和蔬菜等是酚類物質(zhì)的天然來(lái)源。藻類中酚類物質(zhì)的研究大多集中于提取方法、結(jié)構(gòu)測(cè)定，對(duì)于功能活性主要局限于抗氧化測(cè)定方面。由于酚類物質(zhì)往往含有一個(gè)或多個(gè)極易被氧化的酚羥基結(jié)構(gòu)，使得其具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力，酚類物質(zhì)的攝入可以保護(hù)機(jī)體免受自由基和過(guò)氧化產(chǎn)物的損傷，因此藻類中酚類物質(zhì)被認(rèn)為是其抗氧化能力的主要貢獻(xiàn)者。但在胃腸道條件下酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性和生物可及性都會(huì)受到影響，此外一些在胃腸道中不被消化的酚類物質(zhì)還可能會(huì)進(jìn)入結(jié)腸被腸道菌群分解代謝。生物可及性即食物中營(yíng)養(yǎng)成分在進(jìn)入胃腸道消化過(guò)程中從食物基質(zhì)中釋放出來(lái)并可能被吸收的比例，常采用體外模擬消化進(jìn)行評(píng)估。這是評(píng)估食物營(yíng)養(yǎng)的一個(gè)重要因素，不同的食物基質(zhì)和食物成分的差異都會(huì)導(dǎo)致生物可及性的變化。

壇紫菜作為我國(guó)主要食用的一類紅藻，含有豐富的酚類物質(zhì)，煮制是其主要的加工食用方法。本研究探究煮制后壇紫菜經(jīng)體外消化發(fā)酵后酚類物質(zhì)（總酚和總黃酮）的變化。紫菜中含有豐富的酚類物質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)探究不同采收期壇紫菜煮制后酚類物質(zhì)經(jīng)體外模擬消化后的生物可及性和抗氧化活性（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除活性和鐵氰化鉀還原活性），并進(jìn)一步探究壇紫菜的攝入對(duì)腸道菌群和腸道微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，旨在為壇紫菜的消費(fèi)選擇及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：早期紫菜（2020年10月4日采收一水紫菜，XP1）、中期紫菜（2020年11月17日采收四水紫菜，XP4）、末期紫菜（2021年1月12日采收七水紫菜，XP7）。

-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶、吐溫80、VK、膽汁鹽、DPPH 美國(guó)Sigma公司；氯化鈣、鹽酸、蛋白胨、酵母提取物、氯高鐵血紅素、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、-半胱氨酸鹽酸鹽 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150 B 生化培養(yǎng)箱 廣東醫(yī)療器械廠；Spectramax i3x酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；L-8800型高速氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣處理

原始試樣：干壇紫菜直接粉碎后，過(guò)40 目篩，密封保存于-18 ℃。

煮制試樣：取40 g干壇紫菜，浸沒(méi)于1 L沸水中煮沸5 min，撈出控水后，再冷凍干燥，粉碎過(guò)40 目篩，密封保存于-18 ℃。

1.3.2 體外模擬消化和結(jié)腸發(fā)酵

1.3.2.1 體外模擬消化

體外消化過(guò)程參照INFOGEST方法，對(duì)煮制后壇紫菜進(jìn)行口腔、胃和小腸3 個(gè)階段的體外模擬消化。

口腔階段：稱取1.5 g壇紫菜樣品與3.5 mL的蒸餾水渦旋混合1 min，以5 mL蒸餾水作為空白對(duì)照（BLK），添加模擬唾液4 mL、0.3 mol/L CaCl溶液0.025 mL、-淀粉酶（1 000 U/mL）0.75 mL，加水補(bǔ)充溶液至10 mL。37 ℃孵育5 min。

胃階段：將4 mL模擬胃液添加到前一階段的消化液中，用HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至3.0，再加入0.3 mol/L CaCl溶液0.005 mL、胃蛋白酶溶液（60 000 U/mL）0.667 mL和超純水補(bǔ)充溶液至20 mL，將混合物在37 ℃孵育2 h。

小腸階段：將8 mL模擬小腸液添加至前一階段的消化液中，用NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0，加入133.2 mmol/L膽鹽溶液3 mL、0.3 mol/L CaCl溶液0.04 mL，胰酶溶液（800 U/mL）2.5 mL和超純水補(bǔ)充至40 mL，將混合物在37 ℃孵育2 h。

反應(yīng)結(jié)束后，將消化液轉(zhuǎn)移至1 000 Da透析袋中，于100 mL 10 mmol/L NaCl透析液中，在4 ℃條件下透析24 h。透析液-18 ℃保存，用于抗氧化活性、總酚和總黃酮含量測(cè)定；透析袋內(nèi)殘?jiān)鋬龈稍镉糜诤罄m(xù)結(jié)腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 體外模擬結(jié)腸發(fā)酵

體外結(jié)腸發(fā)酵過(guò)程參照Pérez-Burillo等方法并略作修改。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2.0 g蛋白胨，2.0 g酵母提取物，0.02 g氯高鐵血紅素，0.5 g-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g膽汁鹽，0.1 g NaCl，0.04 g KHPO，0.04 g KHPO，0.01 g MgSO·7HO，0.01 g CaCl·6HO，2 g NaHCO，1.0 mL刃天青溶液（0.1 g/100 mL），2.0 mL吐溫80，10 μL VK，將pH值調(diào)節(jié)至7.4±0.2后，定容至1 L，并在121 ℃高壓滅菌20 min。

腸道菌群來(lái)源：收集2 名女性和1 名男性（3 名志愿者的年齡范圍20～25 歲，至少3 個(gè)月以上都沒(méi)有胃腸道疾病或接受抗生素治療，自愿在身體和精神上參與該實(shí)驗(yàn)）的新鮮糞便，將收集的糞便樣品等量混合，以32%（/）的比例加入預(yù)還原的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L，pH 7.4）進(jìn)行混合，經(jīng)8 層滅菌紗布過(guò)濾至錐形瓶中，置于冰上備用。

將消化樣品（2 g/100 mL）和菌液（10%）添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菊粉（INK）作陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水（BLK）作陰性對(duì)照。37 ℃孵育，分別于0、6、12 h和24 h后取樣，并于冷凍離心機(jī)中以500 r/min離心3 min，收集紫菜沉淀。上清液12 000 r/min離心2 min，收集沉淀的細(xì)菌用于DNA提取和16S rRNA測(cè)序；收集發(fā)酵上清液用于短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）、總酚和總黃酮含量測(cè)定。

1.3.3 酚類物質(zhì)測(cè)定

準(zhǔn)確稱取200 mg壇紫菜樣品浸沒(méi)于10 mL甲醇-水（80∶20，/）溶液中，超聲提取30 min，12 000 r/min離心10 min。再加入10 mL甲醇水，重復(fù)提取1 次。合并提取液，并定容到20 mL。采用Folin-Denis法測(cè)定總酚含量；采用NaNO-Al(NO)法測(cè)定總黃酮含量?？偡?、總黃酮生物可及性按下式計(jì)算：

式中：為消化透析液總體積/mL；為透析液中物質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為煮制壇紫菜提取液總體積/mL；為提取液中物質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力

將100 μL 透析液與100 μL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）渦旋混合，于黑暗中室溫孵育30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液1∶1混合，在黑暗中室溫反應(yīng)12～16 h。用5 mmol/L PBS（pH 7.4）稀釋獲得ABTS陽(yáng)離子自由基溶液。將20 μL透析液與180 μL ABTS陽(yáng)離子自由基溶液渦旋混合，靜置6 min后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.4.3 鐵氰化鉀還原能力

將0.2 mL透析液、0.5 mL PBS（0.2 mol/L，pH 6.6）和0.2 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合50 ℃水浴20 min，再加入1 mL 10% TCA溶液渦旋混合，8 000 r/min離心5 min。取離心上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，搖勻靜置10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；取離心后上清液0.5 mL，加入0.6 mL蒸餾水，搖勻靜置10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5 SCFAs和支鏈脂肪酸（branched chain fatty acids，BCFAs）含量測(cè)定

9.2 mol/L HSO溶液0.16 mL、發(fā)酵上清液0.8 mL和2-乙基丁酸0.04 mL混合，4 ℃酸化30 min。向離心管中加入0.8 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液用于進(jìn)樣。

儀器條件：采用配備有氫火焰離子化檢測(cè)器的Agilent 7890B氣相色譜儀，DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm）；載氣為氮?dú)猓?9 mL/min的恒定流速和1∶10的分流比，氫氣和空氣的流速分別為40 mL/min和400 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL；檢測(cè)器和進(jìn)樣的溫度均為250 ℃；色譜柱升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以15 ℃/min速率升溫至200 ℃。

1.3.6 DNA提取和16S rRNA測(cè)序

使用DNA Stool Mini Kit提取DNA。使用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)分離的DNA，Qubit進(jìn)行定量。通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)純化的DNA擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行方差和顯著性分析，＜0.05，差異顯著。采用Origin 2020進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期壇紫菜總酚含量及體外消化后生物可及性

原始?jí)喜酥锌偡雍繛?.66～7.53 mg/g（沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)，下同），隨采收期的延伸壇紫菜中總酚含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)（表1）。XP1中總酚含量最高，XP4中總酚含量顯著降低至6.66 mg/g，XP7中總酚含量有所增加，為6.95 mg/g。酚類物質(zhì)作為次生代謝產(chǎn)物可以幫助藻類克服惡劣天氣適應(yīng)周?chē)h(huán)境，因此其含量的變化可能受水/空氣溫度、水域環(huán)境、光照、采收次數(shù)等多種因素的綜合作用。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的壇紫菜總酚含量與邱小明采用響應(yīng)面法測(cè)得的壇紫菜中總酚的最大提取率6.78 mg/g相似，其含量與卷心菜、蘆筍、枸杞等食物含量相當(dāng)，是酚類物質(zhì)較好的食物來(lái)源。

表1 不同采收期壇紫菜煮制前后總酚含量及其消化后釋放量Table 1 Changes in contents and bioaccessibility of total phenols in P.haitanensis harvested at different times after cooking and digestion

煮制后壇紫菜中總酚含量為6.47～7.61 mg/g，與原始?jí)喜讼啾容^，煮制后XP1和XP4中總酚含量略有增加，分別為7.61 mg/g和6.76 mg/g，但XP7中總酚含量降低為6.47 mg/g，煮制后XP1中總酚含量仍最高。雖然煮制過(guò)程導(dǎo)致壇紫菜中總酚含量有所變化，但由于總酚耐熱，且煮制過(guò)程會(huì)導(dǎo)致多酚氧化酶失活，使得總酚的降解受抑制。因此短時(shí)間的煮制對(duì)壇紫菜中總酚含量無(wú)顯著影響。

煮制壇紫菜經(jīng)過(guò)體外消化后，消化液中總酚含量均有不同程度的增加，XP1和XP4分別為7.98 mg/g和7.12 mg/g，略高于消化前的總酚含量。XP7消化液中總酚含量顯著增加為7.57 mg/g，生物可及性高達(dá)117.03%。體外消化后總酚具有極高的生物可及性（104.80%～117.03%），可能是由于在胃腸道消化酶和膽汁鹽的作用下，導(dǎo)致壇紫菜細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，壇紫菜中一些與蛋白、多糖、纖維等物質(zhì)結(jié)合不易釋放的結(jié)合酚類物質(zhì)被釋放出來(lái)。但由于不同采收期壇紫菜間基質(zhì)的差異，導(dǎo)致在消化過(guò)程中酚類物質(zhì)的生物可及性有所差異。而Afonso等研究測(cè)定翅藻和糖海帶中總酚的生物可及性分別為24.71%和18.99%。這表明壇紫菜中多酚類物質(zhì)較為穩(wěn)定，在經(jīng)過(guò)胃腸道消化作用后仍具有極高的吸收率。

2.2 不同采收期壇紫菜總黃酮含量及體外消化后生物可及性

干壇紫菜中總黃酮含量約為1.15～1.88 mg/g（視黃醇當(dāng)量計(jì)，下同），總黃酮含量隨采收期的延伸而下降（表2），XP1和XP4中總黃酮含量分別為1.88 mg/g和1.66 mg/g，顯著高于XP7中總黃酮含量（1.15 mg/g）。陳利梅采用超聲輔助雙水相法對(duì)條斑紫菜中總黃酮的提取量為1.48 mg/g，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的壇紫菜總黃酮含量相似。經(jīng)煮制后XP4中總黃酮含量（1.24 mg/g）顯著降低，XP1和XP7中總黃酮含量有一定增加，分別為2.37 mg/g和1.26 mg/g。

表2 不同采收期壇紫菜煮制前后總黃酮含量及其消化后釋放量Table 2 Changes in contents and bioaccessibility of total flavonoids in P.haitanensis harvested at different times after cooking and digestion

體外消化后，壇紫菜中釋放的總黃酮含量顯著降低。XP1釋放的總黃酮含量最高為0.83 mg/g，XP4次之為0.74 mg/g，XP7釋放的總黃酮含量最低為0.58 mg/g，不同采收期壇紫菜基質(zhì)間存在差異，因此導(dǎo)致壇紫菜中總黃酮在消化過(guò)程中的釋放存在差異。壇紫菜中總黃酮生物可及性較低，約為35.21%～59.60%，王小超等研究測(cè)定的蜂花粉中總黃酮也表現(xiàn)出較低的生物可及性（27.32%～37.63%）。向卓亞等對(duì)藜麥中總黃酮的生物可及性研究也表明受小腸消化階段的pH值影響，導(dǎo)致總黃酮的生物可及性較低。此外總黃酮與消化過(guò)程中添加的蛋白酶或壇紫菜消化過(guò)程中釋放蛋白質(zhì)相互作用也可能導(dǎo)致總黃酮生物可及性降低。

2.3 不同采收期壇紫菜消化液抗氧化活性

自由基會(huì)對(duì)生物大分子（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核酸等）產(chǎn)生氧化修飾，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能被破壞。因此自由基的過(guò)量存在對(duì)人體健康有極大威脅，導(dǎo)致心血管、炎癥、癌癥等疾病發(fā)生概率增加，并加速人體衰老。研究認(rèn)為藻類中酚類物質(zhì)的含量與藻類的抗氧化性之間存在相關(guān)性，其在貢獻(xiàn)電子后使得自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的中間體，有效的在細(xì)胞和生理水平上防止氧化。

DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基是兩種比較穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化活性。如表3所示，隨采收期的延伸，壇紫菜消化液的DPPH自由基清除能力逐漸降低為46.70%～53.82%，XP1抗氧化能力最強(qiáng)，XP4次之為50.86%，XP7抗氧化能力最低。壇紫菜消化液的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力（30.68%～32.65%）顯著高于空白對(duì)照（16.27%），XP1的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最高為32.65%，但與XP4（30.68%）和XP7（30.99%）間無(wú)顯著差異。

表3 不同采收期壇紫菜消化液抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of digest of P.haitanensis harvested at different times %

所有樣品都表現(xiàn)出較低的鐵氰化鉀還原活性，且XP7的鐵氰化鉀還原活性（7.13%）顯著低于XP1（9.45%）和XP4（9.45%）。這可能是由于鐵氰化鉀還原能力測(cè)定的是抗氧化劑作為電子供體，減少Fe的能力。壇紫菜經(jīng)體外消化后其消化液是一個(gè)復(fù)雜的體系，消化產(chǎn)物中對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除以及Fe的還原起作用的物質(zhì)間存在差異，導(dǎo)致壇紫菜消化產(chǎn)物在不同的抗氧化模型中表現(xiàn)出的抗氧化能力存在明顯差異。

經(jīng)體外模擬消化后不同采收期壇紫菜消化液抗氧化活性均極顯著高于空白對(duì)照組。這可能是由于消化作用促進(jìn)了壇紫菜中多糖、總酚、總黃酮和氨基酸等物質(zhì)的釋放從而導(dǎo)致其抗氧化活性顯著提升。由于壇紫菜經(jīng)消化后的消化液屬于一個(gè)復(fù)雜的體系，雖然酚類物質(zhì)被認(rèn)為是其抗氧化能力的主要貢獻(xiàn)者，但其抗氧化活性可能還受到體系中其他物質(zhì)的影響，導(dǎo)致抗氧化活性變化與酚類物質(zhì)含量變化并不完全一致，但根據(jù)顯著性分析可以看出酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性均隨采收期的延伸呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，XP1消化液表現(xiàn)出最高的抗氧化活性。

2.4 結(jié)腸發(fā)酵后發(fā)酵液中總酚和總黃酮含量

壇紫菜在經(jīng)胃腸道消化后，消化殘?jiān)M(jìn)入結(jié)腸進(jìn)行發(fā)酵。如表4所示，發(fā)酵液中含有較高含量的總酚（3.67～4.81 mg/g）。同一發(fā)酵時(shí)間下，XP1發(fā)酵液中總酚含量（4.26～4.81 mg/g）顯著高于XP4（3.67～3.85 mg/g）和XP7（3.73～3.77 mg/g）發(fā)酵液，這可能是由于腸道菌群發(fā)酵促進(jìn)了壇紫菜中結(jié)合酚的釋放。但隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，壇紫菜發(fā)酵液中總酚含量雖略有變化，但在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化并不顯著。釋放的總酚似乎并不能被腸道菌群代謝，且在發(fā)酵液中并未檢測(cè)到總黃酮的存在。有研究表明發(fā)酵液中大多數(shù)可代謝的酚類物質(zhì)在開(kāi)始發(fā)酵后的5 h內(nèi)已完成代謝，但本研究并沒(méi)有測(cè)定發(fā)酵前5 h發(fā)酵液中酚類物質(zhì)的變化，因此壇紫菜中酚類物質(zhì)在結(jié)腸中的代謝還需要更多的研究。

表4 不同采收期壇紫菜發(fā)酵過(guò)程中總酚含量Table 4 Total phenolic contents in P.haitanensis harvested at different times during in vitro colonic fermentation mg/g

2.5 SCFAs分析

不同采收期的壇紫菜樣品發(fā)酵液中乙酸濃度均在結(jié)腸發(fā)酵12 h后達(dá)到最高水平，為23.93～25.54 mmol/L，在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中乙酸濃度（19.80～22.22 mmol/L）顯著下降（圖1A）。乙酸是本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液中含量最豐富的SCFAs，腸道菌群產(chǎn)生的乙酸主要是穿過(guò)腸上皮，從而進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用，且可通過(guò)中央穩(wěn)態(tài)機(jī)制穿越血腦屏障來(lái)降低食欲。

圖1 不同采收期壇紫菜發(fā)酵液SCFAs含量Fig.1 Contents of SCFAs during fermentation of P.haitanensis harvested at different times

腸道菌群產(chǎn)生的丙酸主要在肝臟中進(jìn)行代謝，經(jīng)過(guò)草酰乙酸轉(zhuǎn)化、單磷酸腺苷活化的蛋白激酶活化可促進(jìn)肝臟中脂肪酸的氧化。丁酸是腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，有助于維持腸上皮和屏障功能完整。相較于乙酸，壇紫菜的添加對(duì)丙酸和正丁酸含量的增加有明顯促進(jìn)作用。與空白對(duì)照相比，壇紫菜的添加導(dǎo)致丙酸和正丁酸含量在6 h處出現(xiàn)顯著增加，在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中其含量無(wú)明顯變化，這表明腸道菌群的初期發(fā)酵底物有助于丙酸和正丁酸的產(chǎn)生。經(jīng)體外結(jié)腸發(fā)酵6 h后，XP1中丙酸和正丁酸含量（16.20 mmol/L 和8.13 mmol/L）略高于XP4（12.30 mmol/L和6.52 mmol/L）和XP7（12.66 mmol/L和6.53 mmol/L），XP1作為發(fā)酵底物對(duì)丙酸和正丁酸的產(chǎn)生更顯著。正戊酸含量在發(fā)酵6 h處有增加，但在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中正戊酸含量和變化很小，濃度約為0.3 mmol/L，大約僅占發(fā)酵液中總SCFAs含量的1%。

2.6 BCFAs分析

BCFAs被認(rèn)為是支鏈氨基酸被腸道細(xì)菌發(fā)酵的特征產(chǎn)物。由圖2可以看出，相較于空白對(duì)照組，壇紫菜的添加對(duì)異丁酸、異戊酸的產(chǎn)生有顯著抑制作用。隨發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，XP1和XP4發(fā)酵液中BCFAs含量在24 h處出現(xiàn)顯著增加，而XP7發(fā)酵液中BCFAs含量在12 h處就發(fā)生了明顯增加。在發(fā)酵過(guò)程中，XP1和XP4可以在更長(zhǎng)時(shí)間上抑制BCFAs的產(chǎn)生。BCFAs含量的增加可能與發(fā)酵后期底物中可發(fā)酵碳水化合物含量較低有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌通過(guò)發(fā)酵蛋白質(zhì)或氨基酸獲得能量，從而導(dǎo)致BCFAs含量增加。但其濃度的增加僅是細(xì)菌蛋白發(fā)酵的標(biāo)記物，不可以作為結(jié)腸健康的標(biāo)記物。

圖2 不同采收期壇紫菜發(fā)酵液BCFAs含量Fig.2 Contents of branched chain fatty acids during fermentation of P.haitanensisharvested at different times

2.7 壇紫菜對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

由圖3 A 可以看出，腸道菌群組成主要分為Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria和Fusobacterieta 4 個(gè)門(mén)類。Bacteroidetes是人體腸道內(nèi)菌群數(shù)量最大的細(xì)菌門(mén)類之一，大約占腸道內(nèi)細(xì)菌總量的30%，其含有更多編碼多糖利用位點(diǎn)和水解酶的基因，可以降解膳食中人體胃腸道不能夠降解的多糖和纖維類物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)多糖片段的水解大多發(fā)生在Bacteroidetes的周質(zhì)空間，這一現(xiàn)象進(jìn)一步證實(shí)了Bacteroidetes對(duì)多糖的高效利用。壇紫菜的添加導(dǎo)致Bacteroidetes相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，這可能是由于壇紫菜中多糖或膳食纖維類物質(zhì)的消耗主要發(fā)生在6～24 h處。Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著增加表明其可能是壇紫菜中碳水化合物消耗的主要響應(yīng)者。壇紫菜的添加導(dǎo)致在發(fā)酵6 h內(nèi)，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度顯著增加，在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度急劇下降。本研究Firmicutes的降低主要受和主導(dǎo)。從圖3B可以看出，壇紫菜發(fā)酵6 h后，發(fā)酵液中相對(duì)豐度顯著增加，且其相對(duì)豐度與采收期呈正相關(guān)?？衫冒⒗?、葡萄糖、蔗糖等多種糖類發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸和丙酸，其相對(duì)豐度與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。相較于2型糖尿病患者或糖尿病前期人群，健康人群腸道菌群中相對(duì)豐度往往較高。發(fā)酵前期的急劇增加可能是由于壇紫菜中游離單糖等易代謝碳水化合物被消耗，且在發(fā)酵6h后可以發(fā)酵液中丙酸含量也顯著增加。在發(fā)酵6 h后，易代謝碳水化合物減少，此時(shí)發(fā)酵多糖、膳食纖維等物質(zhì)的相對(duì)豐度開(kāi)始增加。與壇紫菜組不同，INK組發(fā)酵前期（0～6 h）相對(duì)豐度顯著增加，發(fā)酵后期（12～24 h）相對(duì)豐度顯著增加。

能發(fā)酵蛋白質(zhì)產(chǎn)生乙酸和少量的琥珀酸，但不發(fā)酵碳水化合物，其相對(duì)豐度在中期和末期壇紫菜發(fā)酵24 h后顯著增加（圖3C），的相對(duì)豐度增加表明腸道菌群開(kāi)始發(fā)酵蛋白，這與發(fā)酵液中BCFAs含量在24 h處開(kāi)始顯著增加的變化一致；、隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，且其相對(duì)豐度隨采收期的延伸而逐漸降低。壇紫菜的添加導(dǎo)致相對(duì)豐度在發(fā)酵6 h后顯著增加，但在發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至12 h后，發(fā)酵液中相對(duì)豐度顯著降低。主要分解乳糖和蛋白質(zhì)，可以產(chǎn)生細(xì)菌素，抑制有害菌定植，刺激免疫球蛋白產(chǎn)生，增強(qiáng)宿主免疫力，對(duì)人體健康起著十分重要的作用。

圖3 壇紫菜體外發(fā)酵過(guò)程中微生物群落變化Fig.3 Changes in microbial community during in vitro fermentation of P.haitanensis

3 結(jié)論

通過(guò)體外模擬消化和結(jié)腸發(fā)酵探究不同采收期壇紫菜酚類物質(zhì)的含量、生物可及性和抗氧化活性間的差異，以及壇紫菜對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明短時(shí)間煮制對(duì)壇紫菜中的總酚含量無(wú)顯著影響，但中期壇紫菜經(jīng)煮制后總黃酮含量顯著降低。體外消化后，壇紫菜中總酚表現(xiàn)出極高的生物可及性，而總黃酮生物可及性較低。消化后壇紫菜消化液均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。對(duì)不同采收期壇紫菜而言，頭水壇紫菜在總酚和總黃酮含量、體外消化后的釋放量以及抗氧化能力方面均顯著高于中期和末期壇紫菜。

體外消化后的消化殘?jiān)ㄟ^(guò)接種腸道菌群模擬體外結(jié)腸發(fā)酵。乙酸是發(fā)酵液中含量最豐富的SCFAs，其在發(fā)酵12 h后達(dá)到最高水平。壇紫菜的添加對(duì)于丙酸和正丁酸含量的增加有明顯的促進(jìn)作用，且頭水壇紫菜對(duì)丙酸和正丁酸產(chǎn)生的促進(jìn)作用略高于中期和晚期壇紫菜。相較于中期和末期壇紫菜，頭水壇紫菜對(duì)BCFAs的生成具有更明顯的抑制作用。壇紫菜的添加促進(jìn)了、和等有益菌的生長(zhǎng)，對(duì)腸道菌群有明顯的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，頭水壇紫菜在酚類物質(zhì)的生物可及性、抗氧化活性、SCFAs的產(chǎn)生和腸道菌群的調(diào)節(jié)等方面均具有更優(yōu)異的表現(xiàn)。