汪芬芬,姚軒,王靜,周中凱
(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)
淀粉是一種植物多糖,來源廣泛,通常存在于谷物(如小麥淀粉、玉米淀粉)、塊莖(如木薯淀粉、馬鈴薯淀粉)以及根、果實(如葛根淀粉、豆類淀粉、香蕉淀粉)中,是地球上豐富的可再生生物資源之一[1]。淀粉作為人們?nèi)粘o嬍车闹饕妓衔铮彩侨梭w能量供給的主要來源[2],根據(jù)營養(yǎng)片段,可以劃分為快速消化淀粉(readily digestible starch,RDS)、慢速消化淀粉(slowly digestible starch,SDS)以及抗消化淀粉(resistant,RS)[3]。由于淀粉具有成本低、資源豐富、可生物降解等特點,因此常被用于食品和非食品工業(yè)中,生產(chǎn)出來的淀粉中約57%用于食品消費,43%用于非食品工業(yè)[4]。在食品工業(yè)中,淀粉可用于增稠、成膜、封裝、保濕和延長貨架期等;在非食品工業(yè)中,淀粉可用于造紙、黏合劑、鉆井液黏度改性劑、生物可降解塑料、紗線上漿劑、藥物載體等[5]。然而天然淀粉的一些物理特性,如親水性強、機械性能差[6]、保質(zhì)期短、穩(wěn)定性差[4]、成膜性能差[5]等限制了其在某些領(lǐng)域的應(yīng)用。淀粉改性是克服這些特性的有效途徑,主要包括:化學(xué)改性、物理改性、酶修飾以及基因改造[7],化學(xué)改性應(yīng)用最為普遍。化學(xué)改性是將新的官能團引入淀粉分子,取代無水葡萄糖單元上的羥基,從而改變其物理化學(xué)性質(zhì)[7],主要包括酯化反應(yīng)、醚化反應(yīng)、氧化反應(yīng)、交聯(lián)反應(yīng)[8],其中酯化反應(yīng)是一類重要的化學(xué)改性手段[9]。與天然淀粉相比,酯化淀粉具有良好的耐熱性、疏水性、成膜性,可用于乳液、藥物輔料、疏水性材料等,如辛烯基琥珀酸酐酯化淀粉可用于藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的包封、生物活性食品成分的載體和食品乳液穩(wěn)定劑[10]。低取代度(degree of substitution,DS)的乙?;矸郾忍烊坏矸鄹m合作為增稠劑和穩(wěn)定劑,而高取代度的乙?;矸鄹拖?,可以作為口服結(jié)腸劑靶向藥物載體材料[11]。?;矸壑?,丙酰化淀粉因其良好的抗消化性而備受關(guān)注,但對其研究較少??剐缘矸墼谛∧c中不被消化,在大腸中被微生物分解產(chǎn)生短鏈脂肪酸,丙酸是短鏈脂肪酸的關(guān)鍵成分之一。
研究表明,長期補充丙酸可以降低血糖,丙?;矸劭赡転楸徇M入腸道提供一種新的載體[12]。因此本文制備3種取代度丙酰化淀粉,采用傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)、核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum,1HNMR)、X 射線衍射(X-ray diffraction,XRD)等技術(shù)對丙酰化淀粉進行結(jié)構(gòu)表征,利用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察淀粉外觀形態(tài)的變化,并對其熱穩(wěn)定性、疏水性和消化特性進行探討,為丙?;矸圻M一步研究與開發(fā)提供參考。
木薯淀粉(食品級):天津文星淀粉有限公司;丙酸酐、對甲基苯磺酸(均為分析純):天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司;胃蛋白酶P110928(≥15 000 NFU/mg)、α-淀粉酶 A109181(≥500 KNU-B/g)、葡萄糖淀粉酶 A107823(1×105U/mL)、中溫淀粉酶A109181(1×104U/mL):阿拉丁試劑有限公司;葡萄糖試劑盒:長春匯利生物科技有限公司。
掃描電鏡(JSM-IT500HR):日本株式會社;傅里葉紅外光譜(Is50):賽默飛世爾科技公司;粒度分布儀(Better2600):丹東百特儀器有限公司;接觸角(PGX):德國FIBRO公司;熱重分析儀(Q50):美國熱分析儀器公司;X射線衍射儀(X-ray-6100):日本島津公司;烘箱(GZX-9146MBE):上海博訊實業(yè)有限公司。
1.3.1 丙?;矸鄣闹苽?/p>
參考Filippo等[5]的方法并稍加修改制備丙?;矸邸⑼耆稍锏?0 g木薯淀粉與30 mL丙酸酐混合,置于智能磁力攪拌器加熱,然后將用丙酸酐完全溶解的對甲基苯磺酸加入溶液,分別在90、100、120℃下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后,待反應(yīng)溶液冷卻至室溫25℃,用4℃蒸餾水反復(fù)洗滌,除去多余的酸酐和催化劑,并通過布氏漏斗真空過濾分離得到固體產(chǎn)物。固體產(chǎn)物于45℃烘箱中干燥24 h、粉碎、過100目篩,即可得丙?;臼淼矸郏⒚麨镹TS(天然淀粉)、PTS-1(取代度為0.81的丙?;矸郏?、PTS-2(取代度為1.53的丙?;矸郏TS-3(取代度為2.67的丙?;矸郏?/p>
1.3.2 丙?;亢腿〈鹊臏y定
丙?;亢腿〈雀鶕?jù)Tupa等[13]的方法測定。稱取1 g淀粉置于250 mL錐形瓶中,加入30 mL 75%乙醇,然后置于50℃、150 r/min搖床上預(yù)熱30 min。依次加入3滴酚酞和0.02 moL/L NaOH,使溶液呈微堿性,然后加入30 mL 0.05 moL/L NaOH,于25℃、150 r/min條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,以酚酞作為指示終點,用0.05 moL/L HCl滴定剩余的堿,并記使用的HCl體積為VS。天然淀粉作為空白對照,所用HCl體積為VB。丙?;亢腿〈鹊挠嬎愎饺缦?。
式中:Pc和DS分別為丙?;亢腿〈龋籱為樣品質(zhì)量,g;36.5、57和162分別為鹽酸、丙?;推咸烟堑南鄬Ψ肿淤|(zhì)量。
1.3.3 淀粉的形態(tài)觀察
淀粉顆粒的表面形貌通過掃描電鏡觀察。干燥的天然淀粉和丙酰化淀粉用導(dǎo)電膠帶固定在圓形鋁板上,并涂上一層薄薄的金箔,以避免成像過程中靜電積聚。將鍍金后的樣品放在顯微觀察室中,對其觀察并拍照。
1.3.4 紅外光譜分析
將干燥的天然淀粉和丙?;矸鄯謩e與KBr按1∶150(質(zhì)量比)混合并壓片1 min。在波長范圍為4 000 cm-1~400 cm-1、分辨率為 4 cm-1條件下進行 32 次掃描,采集所得光譜即樣品的光譜圖。
1.3.5 X射線衍射分析
天然淀粉和丙酰化淀粉的X射線衍射譜圖可通過X射線衍射儀分析獲得。掃描范圍為5°~45°、掃描速度為 2°/min。
1.3.6 核磁共振氫譜分析
稱取天然淀粉和丙?;矸鄹?0 mg于1.5 mL離心管中并加入0.5 mL二甲基亞砜,在85℃下水浴10 min使其充分溶解。然后將溶液全部轉(zhuǎn)移到核磁管中,在25℃下進行32次掃描。
1.3.7 消化特性測定
稱取天然淀粉和丙?;矸鄹?00 mg與300 μL唾液淀粉酶(60 μL α-淀粉酶溶解于 5 mL CH3COOHCH3COONa緩沖溶液,pH5.0)混合,在 37℃、100 r/min條件下攪拌反應(yīng)5 min,模擬口腔消化;然后加入15 mL胃蛋白酶(胃蛋白酶溶解于0.02 moL/L HCl,濃度為1 mg/mL)持續(xù)反應(yīng)30 min,模擬胃液消化;之后再加入15 mL 0.02 moL/L NaOH、25 mL CH3COOH-CH3COONa緩沖溶液和10mL復(fù)合酶(由2 400 μL中溫α-淀粉酶、400 μL 葡萄糖淀粉酶組成,CH3COOH-CH3COONa緩沖溶液定容至200 mL)繼續(xù)反應(yīng)。在0、20、120min分別取1 mL水解液,煮沸10 min使酶滅活。在10 000 r/min、4℃條件下離心10 min,用葡萄糖試劑盒測定上清液中的葡萄糖含量,計算RDS、SDS和RS含量公式如下。
式中:FG為游離葡萄糖含量,mg;G20和G120分別為水解20 min和120 min后的葡萄糖含量,mg;TS為樣品的總淀粉含量,mg;0.9為淀粉與葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。
1.3.8 熱穩(wěn)定性分析
天然淀粉和丙?;矸鄣臒岱€(wěn)定性通過熱重分析儀測定。稱取5 mg樣品放置在已去皮的鋁盤上,在25℃~600℃、加熱速度20℃/min、氮氣加熱速度30 mL/min程序下進行測定。
1.3.9 疏水性分析
天然淀粉和丙?;矸墼?0 MPa壓力作用下形成直徑約1.5 cm的圓形壓片,通過動態(tài)接觸角測試儀測量接觸角。在壓片表面注入3 μL蒸餾水,形成的液滴不再擴散即可通過計算機軟件確定接觸角。
所有試驗均進行3次,結(jié)果表示為平均值±標準差。使用Origin 9.0和SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析。
丙?;矸鄣谋;亢腿〈纫姳?。
表1 丙?;矸鄣谋;亢腿〈萒able 1 The propionyl contents and degree of substitution of propionylated starch
如表1所示,丙?;亢腿〈入S著溫度的升高而增大,丙?;繌?2.36%增加到48.88%,取代度從0.81增加到2.67。這是由于高溫加速了淀粉分子與丙酸酐的擴散速度,促使葡萄糖單元羥基不斷與丙酸酐結(jié)合,導(dǎo)致取代度增大[13]。在丙?;^程中,淀粉葡萄糖單元上的3個游離羥基被取代,因此理論上取代度最大值為3[5]。由于3種游離羥基的反應(yīng)活性不同,與C2和C3上羥基相比,C6上的羥基更活潑,更容易丙?;痆14];丙?;磻?yīng)是不均一的,導(dǎo)致某些葡萄糖單元不能完全接觸到丙酸酐[15],因此取代度小于3。
天然淀粉及丙?;矸鄣碾婄R圖見圖1。
圖1 天然淀粉及丙酰化淀粉的電鏡Fig.1 Scanning electron microscope of native and propionylated starches
由圖1可知,天然淀粉的表面光滑飽滿,顆粒尺寸大小不一,大顆粒主要呈現(xiàn)為圓球形,一些小顆粒相互簇擁主要表現(xiàn)為不規(guī)則的多邊體。經(jīng)過丙?;幚?,淀粉顆粒形態(tài)被破壞,并且隨著取代度的增加,其被破壞程度加劇。PTS-1表面開始變得粗糙,這是由于丙?;吭黾覽11],進一步反應(yīng)使得淀粉顆粒出現(xiàn)凹坑、聚集、破碎現(xiàn)象,PTS-3的淀粉顆粒完全被破壞。研究表明,分子間氫鍵相互作用的減少和加熱作用破壞了樣品的結(jié)晶度,導(dǎo)致淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生改變[8]。
2.3.1 紅外光譜分析
天然淀粉及丙?;矸鄣募t外光譜圖見圖2。
圖2 天然淀粉及丙?;矸鄣募t外光譜Fig.2 Fourier Infrared spectroscopy of native and propionylated starch
由圖2可知,天然淀粉表現(xiàn)出典型的多糖結(jié)構(gòu),即在3 416、2 932 cm-1和1 647 cm-1處存在吸收峰,分別代表淀粉分子的O-H拉伸振動、C-H不對稱拉伸振動和水分子中O-H彎曲振動吸附[5]。與天然淀粉相比,丙?;矸墼? 984、1 740 cm-1出現(xiàn)新的吸收峰,分別歸因于丙?;膩喖谆–-H)拉伸和酯羰基(C=O)的延伸,證明發(fā)生了丙?;磻?yīng)。此外,從圖2可以觀察到隨著取代度的增大,丙?;卣鞣宓膹姸纫苍谠龃螅? 416 cm-1處的羥基峰值強度下降,這表明淀粉分子中的羥基逐漸被取代,使得分子間或內(nèi)氫鍵減弱[16]。
2.3.2 晶體結(jié)構(gòu)分析
天然淀粉及丙?;矸鄣腦射線衍射圖見圖3。
圖3 天然淀粉及丙?;矸鄣腦射線衍射Fig.3 X-ray diffraction patterns of native and propionylated starches
淀粉顆粒具有獨特的半結(jié)晶體系,由非結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)交替組成[17]。根據(jù)X射線衍射圖中不同衍射峰的強度和位置,淀粉的結(jié)晶類型可分為A型、B型、C型和V型[1]。天然淀粉表現(xiàn)為典型的A型晶體結(jié)構(gòu),衍射峰在 15.23°、17.08°、17.96°和 23.17°左右,其中 17.08°和17.96°為未接受的雙峰[8];與天然淀粉相比,丙?;苌浞宓南鄬姸入S著取代度的增加而逐漸減小,相對結(jié)晶度也逐漸減小。當取代度增加到2.67時,其X射線圖在20°附近顯示典型的寬峰,說明丙?;茐牧颂烊坏矸鄣挠行蚪Y(jié)晶結(jié)構(gòu)[15],這是因為丙?;囊霑拗频矸鄯肿拥幕钚裕茐奶烊坏矸鄯肿渔湹囊?guī)律性,從而削弱了分子間的氫鍵作用,導(dǎo)致晶體結(jié)構(gòu)被破壞[11],而在低 2θ 范圍(6°~8°)內(nèi)出現(xiàn)新的衍射峰則表明取代度為2.67的丙?;矸塾行碌木w結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,這與Xu等[18]的研究結(jié)果一致。Filippo等[5]的研究也提到?;磻?yīng)先發(fā)生在非結(jié)晶區(qū)域,然后繼續(xù)發(fā)生在結(jié)晶度較高的區(qū)域。
2.3.3 核磁共振氫譜分析
天然淀粉及丙?;矸鄣暮舜殴舱駳渥V圖見圖4。
圖4 天然淀粉及丙?;矸鄣暮舜殴舱駳渥VFig.4 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum of native and propionylated starches
2.5 ppm和3.3 ppm處對應(yīng)的化學(xué)信號分別是溶劑DMSO-d6和水分子的質(zhì)子吸收峰[9]。由圖4可知,位于5.50、5.40、4.58 ppm的化學(xué)信號分別代表淀粉中無水葡萄糖單位上C3、C2和C6的羥基質(zhì)子峰,5.10 ppm、3.3 ppm~3.8 ppm 處的化學(xué)信號是 C1、C2~C6的質(zhì)子峰。而在丙酰化淀粉光譜中,取代度為0.81時,在3.29 ppm~3.65 ppm范圍內(nèi)的信號顯示,由于只有部分羥基參與了修飾,仍能觀察到葡萄糖無水單元的峰特征,在5.44 ppm、4.58 ppm時,羥基的質(zhì)子比與天然淀粉相似;DS為1.53和2.67時,無水葡萄糖單元中羥基的信號消失,質(zhì)子的化學(xué)環(huán)境與天然淀粉完全不同且丙?;矸墼?.2 ppm和1.0 ppm處出現(xiàn)了新的質(zhì)子吸收峰,分別是新引入的亞甲基和甲基,證明丙酰化是成功的[18],并且隨著取代度的增加,甲基峰和亞甲基峰的強度增加。
天然淀粉及丙?;矸鄣南匦砸姳?。
表2 天然淀粉及丙?;矸鄣南匦訲able 2 Digestion characteristics of native and propionylated starches
由表2可知,天然淀粉的RDS、SDS、RS含量分別為70.37%、16.38%、13.25%。隨著取代度的增加,丙?;矸鄣腞DS含量逐漸降低,RS含量逐漸增加,與天然淀粉相比,其RS含量分別提高了4.07%(PTS-1)、19.18%(PTS-2)、69.06%(PTS-3),表明高取代度的丙?;矸蹖γ傅目剐愿鼜?,這可能是因為丙?;囊雽?dǎo)致空間位阻增加,延遲了酶與淀粉分子的接觸[19]。
天然淀粉及丙?;矸鄣臒嶂胤治鰣D見圖5。
圖5 天然淀粉及丙?;矸鄣臒嶂胤治鯢ig.5 Thermogravimetric analysis of native and propionylated starches
熱重分析常用來評價淀粉的熱穩(wěn)定性[20]。由圖5可知,第一個階段(30℃~125℃),天然淀粉(8.58%)和丙?;矸郏≒TS-1:8.97%,PTS-2:3.71%,PTS-3:3.73%)的失重主要是由于水分蒸發(fā)[20]。對于天然淀粉,330℃~360℃觀察到第二次失重,并將其歸因于淀粉熱分解[21]。而丙酰化淀粉在第二階段出現(xiàn)了兩個峰,分別是由羥基未被取代的天然淀粉分子(210℃~380℃)和丙酰化淀粉分子(390℃~430℃)的熱分解形成,并且隨著取代度的增加,第一個峰的強度減小,第二個峰強度增加。丙酰化淀粉比天然淀粉熱穩(wěn)定性更強,這主要是因為丙酰化后剩余的羥基數(shù)量更少[22]。
天然淀粉及丙酰化淀粉的接觸角測量圖見圖6。
圖6 天然淀粉及丙?;矸鄣慕佑|角Fig.6 Contact angle of native and propionylated starches
接觸角是測量液體在材料表面潤濕性的重要參數(shù)[23]。由圖6可知,當水滴加到天然淀粉壓片表面時,立馬吸水膨脹裂解,測得接觸角為5.33°,說明天然淀粉親水性很強。當取代度為0.83、1.54和2.73時,丙?;矸鄣慕佑|角分別為 75.97°、81.67°和 65.53°,結(jié)合紅外光譜結(jié)果分析,表明在丙酰化反應(yīng)中,疏水性酯羰基通過取代部分親水性羥基而連接在淀粉分子上,從而導(dǎo)致接觸角增加。此外,隨著取代度的增加,接觸角呈先升高后降低的趨勢。這是因為當取代度為0.81和1.53時,丙酰基和羥基會形成分子內(nèi)氫鍵,此時甲基和亞甲基在疏水界面的生成中起重要作用。而當取代度為2.67時,羰基化合物會和水分子形成分子間氫鍵,導(dǎo)致疏水性減小,因此這個樣品的接觸角小于取代度較低的樣品[18]。
本文以木薯淀粉為原料,丙酸酐為酯化劑,對甲基苯磺酸為催化劑,反應(yīng)溫度為變量制備了取代度分別為0.81、1.53、2.67的丙?;臼淼矸?,同時對這些淀粉進行了結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果顯示,經(jīng)過丙酰化反應(yīng),F(xiàn)TIR中1 746 cm-1處出現(xiàn)的酯羰基及1HNMR中1.0 ppm和2.2 ppm處出現(xiàn)的甲基和亞甲基吸收峰,證實了淀粉分子上成功引入丙酰基,且隨著取代度的增大,丙?;奶卣鞣鍙姸仍鰪姟A硗?,位于3 416 cm-1處的葡萄糖單元上的羥基峰減弱,表明了羥基被丙酰基取代,分子間或內(nèi)氫鍵相互作用減弱,從而導(dǎo)致淀粉熱穩(wěn)定性和疏水性的提高。XRD的結(jié)果顯示,木薯淀粉的結(jié)晶類型為A型,經(jīng)過丙?;磻?yīng),隨著取代度的增大,結(jié)晶度逐漸減小,A型晶體結(jié)構(gòu)也逐漸被破壞。從SEM中也觀察到隨著DS的增大,淀粉顆粒表面變得粗糙并出現(xiàn)破碎現(xiàn)象。此外,淀粉經(jīng)丙?;幚砗?,抗消化特性顯著增強。以上結(jié)果說明此方案設(shè)計合理,可以準確評價丙?;矸鄣挠行?,不僅為將來開發(fā)新型變性淀粉提供了理論依據(jù),也為淀粉的應(yīng)用提供了充分的參數(shù)和新途徑。