溶劑-超聲波-酶法輔助提取桑葚果渣色素及其抗氧化活性研究

吳均，吳俊葶，黃傳書*，趙珮，劉艷，馬婧秋

（1.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700；2.中國人民解放軍陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401331）

桑葚富含多糖、脂肪酸、花色苷、鞣質(zhì)、蘆丁、維生素、蛋白質(zhì)、果膠、粗纖維等成分[1]，具有抑菌、抗氧化、抑制動脈粥樣硬化和有害物質(zhì)生成的作用[2-6]。因桑葚皮薄、易腐敗、易霉變和保質(zhì)期極短等特點(diǎn)使其工業(yè)化發(fā)展受到了極大的限制，我國桑葚種植面積大、分布廣，資源豐富，但總體利用率較低，絕大多數(shù)以采摘鮮食為主，加工產(chǎn)品主要為果干、果汁、果醋、果粉、果膏和果酒等[7-11]。加工產(chǎn)生的果渣營養(yǎng)豐富但通常被丟棄，資源浪費(fèi)十分嚴(yán)重。研究表明，桑葚果渣中富含大量有色物質(zhì)花色苷[12]，可作為理想的天然色素提取原料[13]。

近年來，人們對食品安全的重視程度越來越強(qiáng)，用天然色素代替化學(xué)合成色素已成為必然趨勢[14-15]，不僅是因?yàn)樘烊簧責(zé)o毒，更因?yàn)樗旧砭褪鞘称分芯哂猩砘钚缘囊徊糠?，且營養(yǎng)豐富[16-17]，將其添加至食品中對人體健康有益。從桑葚果渣中提取天然色素，可以拓寬天然色素的獲取渠道，滿足輕工業(yè)對天然色素日漸增長的需求，也能提高桑葚產(chǎn)品的附加值。色素提取工藝主要有溶劑提取法[18]、超聲波輔助提取法[19]、微波輔助提取法[20]、酶解法[21]、微生物發(fā)酵提取法[22]和超臨界CO2法[23]等。溶劑-超聲波-酶法輔助提取法將3種方法整合，促進(jìn)溶劑與有效成分融合，加快色素的溶解速度，提高色素的提取率，且不會造成成分的破壞，最大限度的保證產(chǎn)物的品質(zhì)。本試驗(yàn)優(yōu)化溶劑-超聲波-酶法輔助提取桑葚果渣色素的工藝條件，獲得提取液后分析其抗氧化活性，為桑葚果渣廢棄物的開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚果渣：重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院；無水檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（食品級，5萬U/g）、維生素C（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；Trolox（純度97%）：美國sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

原汁機(jī)（H-200）：上海韓惠人愛家電科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型）：北京科偉永興儀器有限公司；破壁料理機(jī)（MJ-PB80Easy215）：廣東美的生活電器制造有限公司；超聲波清洗儀（SB25-12DTD）：寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)顯全溫振蕩器（HZQ-2）：山東博科科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī)（CTFD-12S）：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；pH計(jì)（PHS-3C）：上海雷磁儀器有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)（Ultra-3600）：北京普源精電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將廢棄冷凍果渣置于搪瓷盤中，于60℃烘箱中烘干，用破壁料理機(jī)破碎成粉，過80目篩，于-4℃條件下避光保存。

1.3.2 桑葚果渣色素的最大吸收波長測定

稱取適量桑葚果渣粉末于三角瓶中，按1∶25（g/mL）料液比加入50%乙醇，置于超聲功率300 W、50℃下提取30 min，10 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液至25 mL棕色容量瓶，超純水定容，用紫外可見光分光光度計(jì)進(jìn)行400 nm～700 nm可見光波段掃描，確定最大吸收波長。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 桑葚果渣色素提取的單因素試驗(yàn)

稱取適量桑葚果渣粉末，以檸檬酸-90%乙醇（體積比1∶1）為提取溶劑提取桑葚果渣色素，考察檸檬酸濃度（6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%）、料液比[1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]、纖維素酶添加量（40、60、80、100、120 U/mL）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、超聲功率（240、300、360、420、480、540、600 W）對吸光度的影響。提取液于10 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液至10 mL棕色容量瓶，超純水定容，于最大吸收波長513 nm處測定吸光度。

1.3.4 桑葚果渣色素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選擇對結(jié)果影響較大的檸檬酸濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）為自變量，以吸光度（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，對桑葚果渣色素最佳提取工藝條件進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 桑葚果渣色素的抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測定

分別取 20、40、60、80、100、120、140、160 μL 的桑葚果渣色素提取液于試管中，用超純水補(bǔ)充至3 mL，加入3 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液搖勻，避光放置30 min，于波長513 nm處測定吸光度Ai。同時(shí)測定含有20、40、60、80、100、120、140、160 μL 的桑葚果渣色素提取液（超純水補(bǔ)充至3 mL）與無水乙醇各3 mL混合后的溶液吸光度Aj，以及無水乙醇與0.2 mmol/L DPPH溶液各3 mL混合后的溶液吸光度A0[24]；以VC和Trolox做陽性對照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率測定

分別取 10、20、30、40、50、60、70、80 μL 的粗提色素溶液于試管中，用超純水補(bǔ)充至0.2 mL，加入ABTS+工作液5.8 mL，搖勻，避光放置10 min，于波長734 nm處測定吸光度 Ai，同時(shí)測定含有 10、20、30、40、50、60、70、80 μL的桑葚果渣色素提取液（超純水補(bǔ)充至0.2 mL）與5.8mL無水乙醇混合后的溶液吸光度Aj，以及0.2mL無水乙醇與5.8 mL ABTS+工作液混合后的溶液吸光度A0[25]；以VC和Trolox做陽性對照。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及繪圖

采用 Excel、Origin 9.0和 Design Expert 8.0.6進(jìn)行繪圖和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚果渣色素最大吸收波長測定結(jié)果

桑葚果渣色素的最佳吸收光譜圖見圖1。

圖1 桑葚果渣色素的最佳吸收光譜圖Fig.1 Optimal absorption wavelength of mulberry residue pigment

由圖1可知，400 nm～700 nm可見光波全段掃描稀釋后的提取液在波長513 nm出現(xiàn)最大吸光度，吸光度為0.422 4。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 檸檬酸濃度對桑葚果渣色素提取的影響

檸檬酸濃度對桑葚果渣色素提取的影響見圖2。

圖2 檸檬酸濃度對桑葚果渣色素提取的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on pigment extraction from mulberry residue

由圖2可知，提取液的吸光度隨著檸檬酸濃度增加先升高后下降，可能是因?yàn)榛ㄉ盏拇嬖谛问诫S著檸檬酸濃度的增加由醇型假堿轉(zhuǎn)化為黃烊鹽[26]。當(dāng)檸檬酸濃度上升到7.0%時(shí)，提取液吸光度達(dá)到最大值；之后提取液的吸光度隨著檸檬酸濃度的增加而下降，可能是因?yàn)殡S著檸檬酸濃度的增加，黃烊陽離子被水的親核攻擊而水合，濃度下降，使花色苷主要以無色的甲醇假堿或淡黃色查爾酮的形式存在。因此，最佳檸檬酸濃度為7.0%。

2.2.2 料液比對桑葚果渣色素提取的影響

料液比對桑葚果渣色素提取的影響見圖3。

圖3 料液比對桑葚果渣色素提取的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on pigment extraction from mulberry residue

由圖3可知，隨著溶劑的增加，提取液的吸光度不斷增加，料液比為1∶30（g/mL）時(shí)吸光度達(dá)到最大值，隨后溶劑繼續(xù)增加，桑葚果渣色素溶液被稀釋使得溶液濃度下降，吸光度下降。因此，最佳料液比為1∶30（g/mL）。

2.2.3 纖維素酶添加量對桑葚果渣色素提取的影響

纖維素酶添加量對桑葚果渣色素提取的影響見圖4。

圖4 纖維素酶添加量對桑葚果渣色素提取的影響Fig.4 Effect of cellulase dosage on pigment extraction from mulberry residue

纖維素酶通過降解半纖維素和纖維素，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)局部變得疏松、膨脹、崩潰，細(xì)胞內(nèi)的色素不斷溶出，吸光度不斷增加[27]。由圖4可知，隨著纖維素酶添加量的增加，提取液中的色素含量不斷增加，添加量為80 U/mL時(shí)吸光度達(dá)到最大值，隨后酶添加量繼續(xù)增加，吸光度反而有所下降。因此，最佳纖維素酶添加量為80 U/mL。

2.2.4 超聲溫度對桑葚果渣色素提取的影響

超聲溫度對桑葚果渣色素提取的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對桑葚果渣色素提取的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on pigment extraction from mulberry residue

由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，提取液的吸光度不斷增大，超聲溫度為50℃時(shí)吸光度達(dá)到最大值，超聲溫度繼續(xù)增加，吸光度降低，原因可能是當(dāng)超聲溫度較低時(shí)，酶活較低，酶促反應(yīng)慢，色素溶出較少，隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)加快，色素溶出增多；而當(dāng)溫度過高時(shí)，又會抑制酶的活性或使酶失活，酶促反應(yīng)停止，且高溫也會致使桑葚果渣色素大量分解，進(jìn)一步使吸光度降低。因此，最佳超聲溫度為50℃。

2.2.5 超聲時(shí)間對桑葚果渣色素提取的影響

超聲時(shí)間對桑葚果渣色素提取的影響見圖6。

圖6 超聲時(shí)間對桑葚果渣色素提取的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on pigment extraction from mulberry residue

由圖6可知，隨著超聲時(shí)間的延長，吸光度不斷增大，這是由于超聲使得液體體系分子運(yùn)動速度加快，色素加快溶出，提取液吸光度不斷增大。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，之后超聲時(shí)間繼續(xù)延長吸光度逐漸降低，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過長導(dǎo)致桑葚果渣色素大量分解[28]。因此，最佳超聲時(shí)間為40 min。

2.2.6 超聲功率對桑葚果渣色素提取的影響

超聲功率對桑葚果渣色素提取的影響見圖7。

圖7 超聲功率對桑葚果渣色素提取的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on pigment extraction from mulberry residue

由圖7可知，超聲功率低于300 W時(shí)，吸光度隨著超聲功率的增加而增大。功率為300 W時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，可能是因?yàn)殡S著超聲功率的增加，溶液中分子之間的碰撞和摩擦頻率逐漸增大，從而使產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)相繼增加，加快桑葚色素的溶出。當(dāng)功率大于300 W時(shí)，吸光度開始減小，分析是產(chǎn)生的熱效應(yīng)使桑葚果渣色素分解，使吸光度減小[29]。因此，最佳超聲功率為300 W。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experiments design

采用Design-Expert 8.0.6分析軟件對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到預(yù)測模型回歸方程為Y=1.36+0.044A-0.14B-0.059C+0.039D-0.045AB-0.084AC-0.011AD-0.029BC-0.045BD+6.000×10-4CD-0.22A2-0.17B2-0.18C2-0.26D2。方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.832 3＞0.05），說明該模型擬合度較好，方程可以較好地預(yù)測結(jié)果[30]。A、B、C、D、AB、AC、BD、A2、B2、C2、D2對桑葚果渣色素提取效果的影響極顯著，說明它們對吸光度的影響比較復(fù)雜，不僅是簡單的線性關(guān)系。R2=0.970 4，R2adj=0.984 8，說明該模型能解釋98.48%的變化，擬合度較好，因此能用此模型對桑葚果渣色素提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。由F值大小可知，4個(gè)因素對響應(yīng)值的影響順序?yàn)槌暅囟龋–）＞檸檬酸濃度（A）＞料液比（B）＞超聲時(shí)間（D）。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用

以回歸方程為依據(jù)，繪制各因素之間交互作用的三維空間響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖8。

圖8 各因素交互作用對桑葚果渣色素提取影響的響應(yīng)面分析Fig.8 Response surface analysis of the influence of interaction of various factors on pigment extraction from mulberry residue

三維圖和等高線能夠預(yù)測和檢驗(yàn)自變量的響應(yīng)值及自變量之間的關(guān)系[31]。由圖8可以看出AB、AC和BD的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用對吸光度的影響大，達(dá)到極顯著效果，CD、AD、BC的等高線呈圓形，說明兩者的交互作用不顯著。

經(jīng)響應(yīng)面分析得到桑葚果渣色素最佳提取工藝條件為檸檬酸濃度7.09%、料液比1∶27.73（g/mL）、超聲溫度48.30℃、超聲時(shí)間41.08 min，桑葚果渣色素提取液吸光度預(yù)測值為1.403 54；為了方便操作，將以上條件調(diào)整為檸檬酸濃度7%、料液比1∶28（g/mL）、超聲溫度48℃、超聲時(shí)間41 min，在此條件下進(jìn)行桑葚果渣色素提取，得到桑葚果渣色素提取液吸光度為1.404 5，真實(shí)值與預(yù)測值相符度高，表明該提取工藝可行。

2.4 桑葚果渣色素抗氧化活性測定結(jié)果

桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除率見圖9。

圖9 桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH scavenging capacity of mulberry marc pigment solution

由圖9可知，樣品體積小于140 μL時(shí)，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的DPPH自由基清除率隨著樣品體積的增加而增加。當(dāng)樣品體積為140 μL時(shí)，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的DPPH自由基清除率分別為97.72%、97.71%和97.05%，樣品體積大于140μL時(shí)，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液對DPPH自由基清除率的增長緩慢。相同體積的桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除能力均高于VC溶液和Trolox溶液。

桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除率見圖10。

圖10 桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除率Fig.10 ABTS+scavenging capacity of mulberry marc pigment solution

由圖10可知，樣品體積小于60 μL時(shí)，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的ABTS+自由基清除率隨樣品體積的增加而增加。當(dāng)樣品體積為60 μL時(shí)，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的ABTS+自由基清除率分別為98.22%、96.68%和98.03%，樣品體積大于60 μL時(shí)，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液對ABTS+自由基清除率的增長緩慢。相同體積的桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除能力要低于Trolox溶液，但略高于VC溶液。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面分析得到桑葚果渣色素的最佳提取工藝條件：檸檬酸濃度7%、料液比1∶28（g/mL）、超聲溫度48℃、超聲時(shí)間41 min，在此條件下進(jìn)行桑葚果渣色素提取，得到桑葚果渣色素提取液吸光度為1.404 5。表明該模型擬合程度良好，能用此模型對桑葚果渣色素提取進(jìn)行分析和預(yù)測，140 μL桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除率為97.72%，60 μL的桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除率為98.22%。該提取工藝能夠提高桑葚果渣色素的提取率，對具有高活性成分天然桑葚色素的提取具有指導(dǎo)意義。