白 玫，吳 鴻

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 藥用植物研究中心, 廣東 廣州 510642)

分泌囊是柑橘屬Citrus植物普遍具有的結(jié)構(gòu)特征，除根之外，它廣泛分布于植物體的莖、葉、花和果實中[1-2]。它是柑橘屬植物黃酮類和揮發(fā)油類等重要藥用成分的合成和儲存的主要場所[3-4]。同時其起源和發(fā)育方式也是研究植物分類和演化的重要形態(tài)學(xué)特征。百年以來，研究者對柑橘屬近20種(品種)植物的分泌囊進(jìn)行了大量的研究，積累了豐富的資料，但在分泌囊起源和發(fā)生方式一直存在較大的爭議，甚至存在彼此矛盾的研究報道，矛盾焦點主要集中在分泌囊發(fā)生方式是溶生型[5-16]、裂生型[1,17-24]還是裂溶生型[3,6,16,25-29]。近20年來，細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞化學(xué)證據(jù)更加傾向于柑橘屬分泌囊的發(fā)生方式屬于裂溶生型[3,28]，并且支持分泌囊上皮細(xì)胞的破毀是典型的細(xì)胞程序化死亡(Programed cell death，PCD)過程[29-30]。近年來，有關(guān)分泌囊細(xì)胞PCD分子調(diào)控機制的研究工作更清楚地揭示了柑橘屬分泌囊發(fā)生方式的本質(zhì)[31-33]。

1 柑橘屬植物分泌囊的起源

最早Martinet[5]認(rèn)為柑橘屬分泌囊起源于表皮細(xì)胞的不斷分裂。Fohn[7]對柑橘屬植物分泌囊的起源和發(fā)生的研究認(rèn)為分泌囊是由表皮下的原始細(xì)胞團發(fā)育而來。而Bosabalidis等[15-16]對紅橘Citrus deliciosa果實分泌囊起源的研究卻發(fā)現(xiàn)分泌囊起源于1個子房外表皮細(xì)胞和與其相對的1個表皮下細(xì)胞，這2個細(xì)胞相繼進(jìn)行不同方向的分裂，發(fā)育形成具有帽區(qū)和球區(qū)的分泌囊。同樣，Bennici等[28]、Liu等[30]發(fā)現(xiàn)甜橙Citrus sinensis、檸檬Citrus limon、廣佛手Citrus medicaL. var. sarcodactylis Noot. Swingle和化橘紅Citrus grandis‘Tomentosa’果實分泌囊起源方式也相同于上述紅橘的特征。Liang等[3]認(rèn)為廣佛手果實分泌囊起源于子房壁的1個果皮細(xì)胞和1個表皮下細(xì)胞。但Knight等[22]認(rèn)為甜橙果實分泌囊起源于子房外表皮下的1組細(xì)胞，Chen等[29]則認(rèn)為這一組細(xì)胞是4～5個細(xì)胞。這些原始細(xì)胞隨后也會進(jìn)行各個方向的分裂分化形成分泌囊的球區(qū)和帽區(qū)，帽區(qū)細(xì)胞小，呈狹長形，位于球區(qū)上方，球區(qū)的中央細(xì)胞體積大，是形成囊腔的主要區(qū)域[3,29,31,33-34]。最新研究表明，化橘紅分泌囊原始細(xì)胞團由果實外果皮表皮及表皮下的7～10個細(xì)胞組成，細(xì)胞分裂頻繁，最終形成球區(qū)和帽區(qū)[33]。從研究報道來看，柑橘屬植物分泌囊的起源方式可能具有多樣性，且隨植物的種類不同而有所差異。但分泌囊的起源本身是表皮細(xì)胞或者薄壁細(xì)胞反分化的過程，似乎起源細(xì)胞數(shù)目越少越接近分泌囊發(fā)育的本質(zhì)[35]。

2 柑橘屬植物分泌囊發(fā)生方式

分泌囊的發(fā)生方式主要有3種，溶生、裂生和裂溶生[13,16,36]。溶生型主要指分泌囊的腔隙是由細(xì)胞自溶產(chǎn)生的；裂生型指分泌囊中央細(xì)胞壁分離形成細(xì)胞間隙，且間隙不斷擴大形成的囊腔；而裂溶生型是裂生和溶生相互結(jié)合的過程[21]。長期以來，關(guān)于柑橘屬植物分泌囊腔隙的發(fā)生方式存在爭議[37]。

早在1872年，Martinet[5]對柑橘屬分泌囊研究發(fā)現(xiàn)分泌囊腔是其中心細(xì)胞的自溶產(chǎn)生的，之后1875年Chatin[38]也支持這一結(jié)論。但是隨后10年中，柑橘屬分泌囊發(fā)生方式的研究結(jié)論多以裂生型為主[17]。而Haberlandt[16]，Tschirch等[17]，Sieck[25]，Buvat[26]，Sprecher[27]和Peterson等[39]則認(rèn)為分泌囊是由最初的細(xì)胞之間的壁溶解分離和隨后的細(xì)胞溶解而產(chǎn)生腔隙的，也就是裂溶生型分泌囊。關(guān)于對柑橘屬分泌囊發(fā)生方式的不同認(rèn)識，研究者們也從不同角度對其可能性進(jìn)行了探討。Carr等[40]認(rèn)為分泌囊上皮細(xì)胞在切片過程中尤其是石蠟切片過程中容易被人為破壞，不能呈現(xiàn)出更為真實的狀態(tài)。Fohn[7]用石蠟切片研究柑橘屬的分泌囊發(fā)生方式為溶生型分泌囊。隨著電子顯微技術(shù)的應(yīng)用，人們對分泌囊有了更為深入地研究，Heinrich[10]首次利用電子顯微鏡研究柑橘屬分泌囊的發(fā)育，他認(rèn)為分泌囊以溶生型發(fā)生是一種自然模式。并且認(rèn)為當(dāng)分泌囊腔形成之后圍繞囊腔的上皮細(xì)胞即無功能后發(fā)生自溶，即使是裂生形成的分泌囊的上皮細(xì)胞在分泌囊成熟之后也會死亡并且自然溶解[8,41]。然而，隨后Thomson等[18]用電子顯微鏡描述了柑橘Citrus sinensis葉片分泌腔的裂生形成過程，認(rèn)為柑橘屬分泌囊上皮細(xì)胞的破毀形成的腔隙的溶生式的發(fā)生方式不排除是在制片過程中造成的細(xì)胞破毀。這與Heinrich[10-12]對于柑橘的分泌囊溶生型形成的報道相矛盾。然而，Thomson等[18]發(fā)現(xiàn)在較老的分泌囊中，圍繞囊腔的上皮細(xì)胞會發(fā)生明顯的自然降解，這被認(rèn)為是上皮細(xì)胞在分泌囊發(fā)育的后期發(fā)生的自溶。Bosabalidis等[15-16]對紅橘的研究結(jié)果支持柑橘屬分泌囊以溶生型方式發(fā)生，并且發(fā)現(xiàn)是分泌囊中央細(xì)胞開始發(fā)生自溶。胡正海等[42]通過比較石蠟包埋和樹脂包埋的分泌囊，他們得出與Carr等[40]一樣的結(jié)論，石蠟法導(dǎo)致了對分泌囊溶生型發(fā)生方式的誤判，而柑橘屬分泌囊是以裂生方式發(fā)生的。此外，Turner等[20-21]在比較了幾種試驗方法后認(rèn)為溶生型發(fā)生方式的判斷可能是一個錯誤的結(jié)論，這或許是人為制樣導(dǎo)致的。這一觀點也得到了Knight等[22-23]的支持。Bennici等[28]通過研究甜橙和檸檬的分泌囊發(fā)育，表明2種柑橘屬植物分泌囊囊腔的發(fā)生和擴大都是通過裂生和溶生共同發(fā)生的，并且這2個過程是相互重疊的，分泌囊細(xì)胞壁分離的時候伴隨著細(xì)胞的自溶即細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)的紊亂、細(xì)胞核的缺失、質(zhì)壁分離等。隨后，Liang等[3]通過對廣佛手的分泌囊研究揭示出廣佛手果實分泌囊是裂溶生型發(fā)生方式，且裂生和溶生是依次發(fā)生的，首先在分泌囊發(fā)育早期分泌囊中央的幾個細(xì)胞先出現(xiàn)細(xì)胞壁之間的開裂形成裂隙，隨后圍繞著裂隙的上皮細(xì)胞開始發(fā)生溶解，隨著上皮細(xì)胞的切向延長囊腔逐漸擴大，最終形成成熟的分泌囊。在此基礎(chǔ)上 Liang等[43]進(jìn)一步運用纖維素酶和果膠酶細(xì)胞化學(xué)定位方法研究表明，果膠酶反應(yīng)產(chǎn)物首先出現(xiàn)在分泌囊原始細(xì)胞的中間層，在分泌囊間隙形成期達(dá)到高峰，后期逐漸減少；纖維素酶反應(yīng)產(chǎn)物在分泌囊空腔擴大早期在上皮細(xì)胞的細(xì)胞壁初生壁中積累，在上皮細(xì)胞開始破毀的時候達(dá)到高峰。該研究首次從酶細(xì)胞化學(xué)層面提供了柑橘屬果實分泌囊的裂生與溶生重疊的裂溶生發(fā)生方式的證據(jù)。

3 細(xì)胞程序化死亡參與柑橘屬植物分泌囊的發(fā)育過程

經(jīng)過一個多世紀(jì)對柑橘屬分泌囊發(fā)生發(fā)育的研究，逐漸確定柑橘屬分泌囊以裂溶生的方式發(fā)生。其中細(xì)胞的溶解過程是否屬于程序化死亡？這個問題吸引了廣泛的關(guān)注。在植物中，植物發(fā)育過程中的細(xì)胞死亡通常涉及PCD[44-46]，而植物細(xì)胞分化中發(fā)生的細(xì)胞死亡是發(fā)育性PCD[46-52]。

3.1 柑橘屬植物分泌囊分泌細(xì)胞發(fā)育呈現(xiàn)典型的程序化死亡特征

Chen等[29]對甜橙果實分泌囊發(fā)育過程中的顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，分泌囊形成過程中細(xì)胞的破毀表現(xiàn)出典型的程序化死亡特征如細(xì)胞核中染色質(zhì)的凝集、邊緣化，細(xì)胞核仁和核膜的降解等，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated biotinylated dUTP nick end-labeling，TUNEL)檢測的信號出現(xiàn)于分泌囊原始細(xì)胞階段，在上皮細(xì)胞核降解的空腔擴大階段最為明顯。

Caspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，對染色質(zhì)凝集和DNA斷裂至關(guān)重要[53-54]。隨后，在以柑橘屬植物化橘紅為材料的研究顯示Caspase-3-like參與了分泌囊分泌細(xì)胞的PCD過程，Caspase-3-like可能只在一定程度上影響核膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而間接促進(jìn)凋亡細(xì)胞中染色質(zhì)的凝集和核膜的降解[27]。雖然植物沒有Caspase-3同源物，但PBA1在植物PCD過程中扮演植物Caspase-3樣酶的角色[32,54-58]。最新的研究顯示，在化橘紅果實分泌囊發(fā)育過程中，CgPBA1參與了分泌囊PCD過程中細(xì)胞的核降解[32]。

植物PCD發(fā)生過程中，細(xì)胞核的降解是一個由多種核酸酶協(xié)同參與的過程，Sugiyama等[59]基于生化研究推測，在植物細(xì)胞PCD中，Ca2+或Mg2+依賴的中性核酸酶先靶向到核中，隨后Zn2+依賴的酸性核酸酶在液泡膜裂解后被激活發(fā)揮作用。的確，Zheng等[60]通過細(xì)胞化學(xué)定位技術(shù)證實了Ca2+參與了甜橙果實分泌囊細(xì)胞凋亡過程，Ca2+的時空定位與細(xì)胞核在PCD過程中的形態(tài)變化密切相關(guān)，在分泌囊細(xì)胞凋亡過程中參與了細(xì)胞核染色質(zhì)和核仁降解的調(diào)控。隨后，Bai等[31]在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實Ca2+依賴的核酸酶CgCaN直接參與了化橘紅果實分泌細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核DNA的降解。最新的研究也證實化橘紅果實分泌囊發(fā)育過程中Zn2+及Zn2+依賴的核酸酶CgENDO1在分泌囊細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化與細(xì)胞核的降解具有密切的時空相關(guān)性，Zn2+與CgENDO1協(xié)同參與了分泌細(xì)胞PCD中的細(xì)胞核降解的后期過程，其參與的方式是在細(xì)胞核降解后期到基本完全降解的階段，通過在核區(qū)域Zn2+的異常募集來激活CgENDO1發(fā)揮作用[33]。上述工作為Sugiyama等[59]的前瞻性推測提供了重要的細(xì)胞學(xué)支撐資料，也為研究植物細(xì)胞PCD過程中核酸酶的作用提供了模板。

植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁，發(fā)生PCD的細(xì)胞分為2類：一類是僅需要降解原生質(zhì)體形成特殊功能的結(jié)構(gòu)，如導(dǎo)管；另一類是細(xì)胞壁和原生質(zhì)體同時降解消失，如助細(xì)胞。而分泌囊分泌細(xì)胞的降解就屬于后者，需要發(fā)生細(xì)胞壁的降解。Liang等[43]證實纖維素酶和果膠酶參與了柑橘屬果實分泌腔細(xì)胞壁的降解。近來，Tong等[34]在以甜橙為研究對象的最新研究中發(fā)現(xiàn)果膠酶基因CisPG21和纖維素酶基因CisCEL16參與調(diào)控柑橘屬果實分泌腔PCD過程中細(xì)胞壁的降解。

3.2 柑橘屬植物分泌囊發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)特征

目前，柑橘屬分泌囊發(fā)生發(fā)育過程分為原始細(xì)胞早期、原始細(xì)胞中期、原始細(xì)胞晚期、腔隙形成期、空腔擴大期和成熟期。柑橘屬分泌囊起源于子房壁表皮及表皮下幾個細(xì)胞[3,29,33]，細(xì)胞大小不等，排列緊密，進(jìn)行各個方向的分裂形成分泌囊原始細(xì)胞團，此時為原始細(xì)胞早期，分泌細(xì)胞細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，核膜、核仁清晰，核質(zhì)濃厚，僅具有小液泡，個別細(xì)胞的細(xì)胞壁發(fā)生膨脹，開始積累果膠酶，該時期有少量的Ca2+依賴的核酸酶和極少量的Zn2+依賴的核酸酶聚集在細(xì)胞內(nèi)[31,33-34]。隨著原始細(xì)胞團的進(jìn)一步分化，形成由帽區(qū)和球區(qū)組成的分泌囊的典型結(jié)構(gòu)，即為分泌囊原始細(xì)胞中期[31,33-34]。帽區(qū)近外表皮，細(xì)胞狹長且較小，球區(qū)是形成囊腔的區(qū)域，中央幾個細(xì)胞體積較大且為多角形，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁膨脹加劇，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核清晰，但出現(xiàn)染色質(zhì)凝集，該時期有大量的Ca2+依賴的核酸酶和少量的Zn2+依賴的核酸酶聚集在細(xì)胞內(nèi)，尤其是凝集的染色質(zhì)和核仁上[31,33-34]。隨著分泌囊的繼續(xù)發(fā)育，帽區(qū)和球區(qū)結(jié)構(gòu)分化更為明顯，但組成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并沒有可見的變化，此時分泌囊進(jìn)入原始細(xì)胞后期。分泌囊球區(qū)中央細(xì)胞的細(xì)胞核邊界模糊不清，核仁模糊、形狀不規(guī)則，核膜出現(xiàn)部分區(qū)域模糊不清甚至降解狀，染色質(zhì)凝集邊緣化加劇，細(xì)胞核中Ca2+依賴的核酸酶急劇減少，但是卻聚集了大量的Zn2+依賴的核酸酶[31,33-34]。到腔隙形成期，此時最大的特征是分泌囊球區(qū)中央的幾個細(xì)胞相鄰的角隅處出現(xiàn)小腔隙，圍繞囊腔的最內(nèi)層上皮細(xì)胞的核已基本呈降解狀態(tài)，染色體、核仁、核膜消失，殘留的細(xì)胞核區(qū)域內(nèi)無Ca2+依賴的核酸酶，而積累大量的Zn2+依賴的核酸酶[31,33-34]。該時細(xì)胞壁中層沉積大量的果膠酶，纖維素酶物質(zhì)也開始出現(xiàn)在上皮細(xì)胞的細(xì)胞壁中[41]。隨著分泌囊腔不斷變大，分泌囊發(fā)育進(jìn)入到空腔擴大期。該時腔隙周圍上皮細(xì)胞形成明顯的大液泡，其細(xì)胞形態(tài)也變得不規(guī)則，在圍繞囊腔的最內(nèi)層上皮細(xì)胞中，細(xì)胞核已完全降解，胞內(nèi)有大量小泡，細(xì)胞壁膨大形成泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)外及細(xì)胞壁處均無Ca2+依賴的核酸酶和Zn2+依賴的核酸酶[31,33-34]。果膠酶繼續(xù)積累于細(xì)胞壁中層以降解中層，同時纖維素酶開始大量地聚集于細(xì)胞壁中降解細(xì)胞壁[41]，最終細(xì)胞發(fā)生破毀，腔隙進(jìn)一步擴大形成20～30個細(xì)胞圍繞的腔，進(jìn)而發(fā)育為成熟的分泌囊(圖1)。

圖1 柑橘屬分泌囊發(fā)育過程模式圖Fig. 1 Secretory cavity development model in Citrus

上述研究清楚表明，在分泌囊細(xì)胞凋亡的過程中，DNA斷裂與細(xì)胞壁降解都是PCD過程中的重要事件。兩者精細(xì)協(xié)調(diào)的生物學(xué)機制值得深入研究。

4 結(jié)論與展望

目前的研究表明，柑橘屬分泌囊以裂溶生方式發(fā)生，其中球區(qū)中央細(xì)胞以及形成囊腔后的上皮細(xì)胞的降解屬于典型的PCD過程。目前研究顯示許多植物蛋白酶參與了細(xì)胞凋亡過程，但是由于體內(nèi)的具體作用位點并不清楚，真正的作用機制難于掌握[44]，植物發(fā)育性PCD研究的機制還不完全清楚。由此看來分泌囊發(fā)育過程中的PCD研究或許可以作為研究植物發(fā)育性PCD的模板，如多種核酸酶如何在時空上相互協(xié)同參與植物發(fā)育PCD，有何調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與其中；PCD過程中類Caspase蛋白酶如何發(fā)揮作用參與細(xì)胞核的降解和核膜的破毀；分別參與細(xì)胞質(zhì)降解和細(xì)胞壁降解的水解酶在分泌囊PCD過程中如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的等等。相信隨著技術(shù)和方法的發(fā)展，人們將逐漸完善植物分泌囊發(fā)育的PCD過程的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也將為全面解析植物發(fā)育性PCD機制提供更豐富的科學(xué)試驗數(shù)據(jù)。