細菌3-酮脂酰ACP還原酶的研究現(xiàn)狀與展望

王海洪，胡 喆

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室, 廣東 廣州 510642)

脂肪酸是細胞生物主要的組成成分之一，是細胞膜磷脂、三酰甘油酯(脂肪)和糖脂的重要組分[1]。按碳鏈?zhǔn)欠裼兄ф溈煞譃橹辨溨舅岷椭ф溨舅醄2]；按照主碳鏈的碳原子數(shù)目，可以分為偶數(shù)脂肪酸和奇數(shù)脂肪酸，其中細胞膜的主要成分多為偶數(shù)脂肪酸[3]；按照含不飽和碳碳雙鍵的數(shù)目，可以分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，生物體中單不飽和脂肪酸居多[4]，按照雙鍵構(gòu)型，不飽和脂肪酸又可分為順式脂肪酸和反式脂肪酸，生物體的不飽和脂肪酸主要為順式不飽和脂肪酸[5]。

細菌通過調(diào)節(jié)脂肪酸的種類和組成，調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，適應(yīng)不同的生長環(huán)境[6-7]。此外脂肪酸還可以通過β-氧化途徑為細菌提供大量的能量，是一種重要的儲能物質(zhì)[8-9]。

細菌能夠從頭合成脂肪酸，除了為膜磷脂和糖脂的合成提供底物外，還可為硫辛酸、生物素、鼠李糖脂、聚羥基脂肪酸(PHA/PHB)、類脂A、N-脂酰高絲氨酸內(nèi)酯類(AHLs)和可擴散信號分子(Diffusible signal factor, DSF)等的合成提供前體[3,10-14]。

目前對細菌脂肪酸合成系統(tǒng)已經(jīng)進行了深入的研究，對一些關(guān)鍵酶的催化機理、生物學(xué)功能及其多樣性也有眾多的綜合性論述，但鮮見3-酮脂酰ACP還原酶(3-oxoacyl-ACP-reductase，OAR)的系統(tǒng)性總結(jié)。本文對細菌3-酮脂酰ACP還原酶的研究進行系統(tǒng)性總結(jié)，以便為今后的科學(xué)研究提供參考。

1 脂肪酸合成系統(tǒng)

細胞生物有2種類型的脂肪酸合成系統(tǒng)。哺乳動物、真菌以及分枝桿菌采用I型脂肪酸合成系統(tǒng)(Fatty acid synthesis I, FAS I)，特點為脂肪酸的合成由1個多結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜脂肪酸合酶催化，其中每個結(jié)構(gòu)域催化1個特定的生化反應(yīng)，而脂?；鶊F由?；d體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)結(jié)構(gòu)域攜帶，在各結(jié)構(gòu)域間傳遞脂?；鶊F[15-16]。FAS I的最終產(chǎn)物一般為棕櫚酸。另外，該系統(tǒng)不合成不飽和脂肪酸[17]。

細菌和植物采用II型脂肪酸合成系統(tǒng)(Fatty acid synthesis II, FAS II)合成脂肪酸(圖1A)[18]。FAS II的每一步反應(yīng)均由獨立的酶催化完成，脂?；鶊F由?；d體蛋白ACP攜帶，可產(chǎn)生各種類型的脂酰ACP，為不同的最終產(chǎn)物提供前體[19-20]。同時，F(xiàn)AS II也可產(chǎn)生順-3烯脂酰ACP，合成不飽和脂肪酸[5,21-22]。因此，雖然I型和II型脂肪酸合成系統(tǒng)的生化反應(yīng)相似，但參與催化的酶在結(jié)構(gòu)和組成上有很大差異，這使得細菌脂肪酸合成途徑成為開發(fā)新型抗菌藥物的熱門靶點[23-24]。

圖1 細菌脂肪酸合成途徑(A)與OAR催化反應(yīng)機制(B)Fig. 1 The pathway of fatty acid biosynthesis in bacterial (A) and the reduction of 3-oxoacyl-ACP catalyzed by 3-oxoacyl-ACP reductase (B)

FAS II可分為起始反應(yīng)和循環(huán)反應(yīng)2部分(圖1A)[18]。以大腸埃希菌Escherichia coli脂肪酸合成途徑為例，起始反應(yīng)的底物為乙酰-CoA，由乙酰輔酶A羧化酶(AccABCD)將其轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰-CoA，接著在丙二酸單酰輔酶A:ACP?；D(zhuǎn)移酶(FabD)的催化下生產(chǎn)丙二酸單酰ACP，完成脂肪酸合成的起始反應(yīng)[25]。循環(huán)反應(yīng)的第1次循環(huán)由3-酮脂酰ACP合成酶III(FabH)將丙二酸單酰ACP和乙酰-CoA縮合，生成3-酮基丁酰ACP開始[26]；接下來由3-酮脂酰ACP還原酶(FabG)催化，將3-酮基丁酰ACP還原為3-羥基丁酰ACP；然后由3-羥脂酰ACP脫水酶(FabA或FabZ)催化3-羥基丁酰ACP生成反-2-丁烯酰ACP[27-28]；最后由烯脂酰ACP還原酶(FabI)催化反-2-丁烯酰ACP，生成丁酰ACP，至此完成第1次循環(huán)[29-30]。接下來的循環(huán)反應(yīng)，由3-酮脂酰ACP合成酶I或II(FabB或FabF)催化脂酰ACP與丙二酸單酰ACP縮合開始，之后經(jīng)FabG還原，F(xiàn)abA或FabZ脫水和FabI再次還原完成[31-32]。每一輪循環(huán)增加2個碳原子，直到合成棕櫚酰ACP(C16-ACP)或硬脂酰ACP(C18-ACP)[33]。在大腸埃希菌中不飽和脂肪酸也可由FAS II酶催化合成。當(dāng)碳鏈延伸到反-2-癸烯酰ACP時，雙功能酶FabA行使其癸烯酰ACP異構(gòu)酶的功能將反-2-癸烯酰ACP異構(gòu)為順-3-癸烯酰ACP，順3-癸烯酰ACP不能被FabI催化，而是被FabB縮合進入下個循環(huán)反應(yīng)，最終保留雙鍵形成棕櫚油酰ACP(C16:1)或異油酰ACP(C18:1)[34-35]。

2 細菌脂肪酸合成中的3-酮脂酰ACP還原酶

細菌脂肪酸合成反應(yīng)中，3-酮脂酰ACP還原酶(OAR)催化3-酮基脂酰ACP還原為3-羥基脂酰ACP。OAR是氧化還原酶，以NADPH為輔因子，極少數(shù)的OAR也可以利用NADH[23，36-37]。與參與細菌脂肪酸合成的其他酶不同，細菌OAR較為保守，目前已經(jīng)報道的參與細菌脂肪酸合成的OAR均為大腸埃希菌FabG的同源蛋白，且編碼基因均處在脂肪酸合成簇中。

大腸埃希菌FabG是首個報道的OAR，也是研究最為透徹的OAR。fabG基因位于脂肪酸合成基因簇plsX-fabH-fabD-fabG-acpP-fabF中。Zhang等[38]證明，fabG與上游的fabD基因共轉(zhuǎn)錄，在fabD與fabG的間隔序列中插入轉(zhuǎn)錄終止元件可使fabG無法轉(zhuǎn)錄。此外，轉(zhuǎn)錄終止元件的插入對大腸埃希菌是致死的，也證明了fabG是必需基因[39]。Lai等[40]構(gòu)建了大腸埃希菌fabG的溫度敏感突變菌株CL104。CL104在30 ℃時能夠正常生長，在42 ℃時，由于FabG蛋白穩(wěn)定性降低，菌體不能生長，這再次證明FabG是大腸埃希菌唯一參與脂肪酸合成的OAR。

類似的脂肪酸合成基因簇在細菌中廣泛存在。王海洪課題組先后對乳酸乳球菌Lactococcus lactis、茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum、苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobium meliloti、野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestrispv.campestris和銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa脂肪酸合成基因簇中的fabG基因開展研究，結(jié)果證明這些fabG均為必需基因，且參與脂肪酸合成(圖2)[41-45]。

圖2 不同細菌中的脂肪酸合成基因簇與OAR編碼基因Fig. 2 The fatty acid biosynthesis gene cluster and gene enconding 3-oxoacyl-ACP reductase in different bacteria

除脂肪酸合成基因簇中的fabG被注釋為OAR編碼基因外，細菌基因組還有多個基因被注釋為OAR編碼基因。例如乳酸乳球菌基因組中有2個OAR編碼基因：fabG1位于脂肪酸合成基因簇，fabG2所處的基因簇也與脂肪酸合成相關(guān)。但是研究表明只有fabG1編碼的蛋白參與脂肪酸合成。茄科雷爾氏菌基因組包含1條染色體和1個巨質(zhì)粒，生物信息學(xué)分析至少有4個基因被注釋為OAR編碼基因。fabG1(RSc1052)、fabG3(RSc0435)、fabG4(RSc05 36)位于染色體上，而fabG2(RSp0359)位于巨質(zhì)粒上。Feng等[42]研究表明，fabG2雖然能被敲除，突變菌株的脂肪酸組成顯著改變，3-羥基脂肪酸合成量減少，而不飽和脂肪酸合成量增加，但是發(fā)現(xiàn)只有fabG1是必需基因，不能被敲除。在野油菜黃單胞菌基因組有4個被標(biāo)注為OAR家族的編碼基因：fabG1(XCC1018)、fabG 2(XCC0416)、fabG3(XCC4003)和fabG4(XCC0384)。研究顯示FabG1是一個典型的OAR，與大腸埃希菌FabG的序列一致性達到69.1%。FabG1在體內(nèi)和體外均能夠?qū)?-酮脂酰ACP還原為3-羥脂酰ACP，fabG1是必需基因，只有在過表達其他OAR時才能將其敲除[44]。同樣，銅綠假單胞菌中有12個基因被標(biāo)注為OAR家族基因，然而只有位于脂肪酸合成基因簇的PA2967(fabG)參與脂肪酸合成[45]；Cukier等[46]也通過構(gòu)建條件突變菌株證明fabG是銅綠假單胞菌的必需基因。

2.1 細菌3-酮脂酰ACP還原酶結(jié)構(gòu)特點

細菌脂肪酸合成中的OAR屬于短鏈醇脫氫酶/還原酶(Short chain dehydrogenase/reductase,SDR)超家族[47]。SDR超家族是最大的蛋白質(zhì)超家族之一，至少有160000的蛋白屬于此家族[48]。根據(jù)催化底物和關(guān)鍵活性殘基的不同，SDR超家族可分為7個大類，464個家族。SDR超家族蛋白一級結(jié)構(gòu)的序列一致性僅為15%～30%，但在序列和結(jié)構(gòu)上有一些共同的特征。SDR超家族蛋白具有典型的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)，中心為6～7個β折疊，兩側(cè)各有3～4個α螺旋[49]；催化活性殘基為Tyr、Lys、Ser和Asn；輔因子為NADH或NADPH，輔因子結(jié)合位點位于N端[50]。與中鏈醇脫氫酶/還原酶(Medium chain dehydrogenase/reductase, MDR)超家族蛋白催化需要金屬離子作為輔因子不同，SDR超家族蛋白催化不需要金屬離子[51]。

OAR單體含有1個典型的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)，核心為7～8個β鏈構(gòu)成的扭曲、平行的β折疊，8個α螺旋依附于兩側(cè)。OAR的輔酶結(jié)合位點Gly-Xaa3-Gly-Xaa-Gly位于N端，中部含有Ser-Xaa12-Tyr-Xaa3-Lys催化基序。以上信息表明，OAR的序列和結(jié)構(gòu)符合SDR超家族蛋白典型特征，屬SDR家族中的129C亞家族[48]。

科學(xué)家們已經(jīng)對大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella entericaserovar Typhimurium、炭疽桿菌Bacillus anthracis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii、結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis等超過20個細菌的OAR進行了結(jié)構(gòu)分析，所有的OAR都有著類似的三級結(jié)構(gòu)[50,52-56]。OAR一般為D2對稱性的四聚體，即2個單體首先形成二聚體，2個二聚體再形成對稱的四聚體。OAR結(jié)合NADPH后，形成3-酮基脂酰ACP-OAR-NADPH的復(fù)合體，OAR的構(gòu)象發(fā)生改變，以容納底物和輔因子，并傳遞電子[57]。

大腸埃希菌FabG是研究最為透徹的OAR，OAR的眾多關(guān)鍵活性位點均是在FabG中報道的。Price等[54]首先解析了大腸埃希菌FabG的蛋白結(jié)構(gòu)，F(xiàn)abG是典型的四聚體結(jié)構(gòu)，4個單體形成2個二聚體界面，進而形成四聚體。FabG單體含有1個典型的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)，核心為7個β鏈構(gòu)成的扭曲、平行的β折疊，通過8個α螺旋依附于亞基的兩側(cè)。2個單體的α4，α5螺旋和α4′，α5′螺旋形成疏水口袋，容納3-酮基脂酰ACP的脂酰鏈。2個單體的β7折疊和α6/α7螺旋形成親水的口袋，在結(jié)合NADPH及后續(xù)的構(gòu)象改變中起著非常重要的作用(圖3)。

圖3 大腸埃希菌FabG的單體(A)和四聚體(B)晶體結(jié)構(gòu)Fig. 3 The crystal structures of Escherichia coli FabG monomer (A) and tetramer (B)

Price等[54]進一步解析了FabG的活性位點，Tyr229在空間上位于α6/α7螺旋相對的親水口袋中，參與了氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成，Arg129和Arg172在脂酰ACP和FabG的相互作用上起著重要作用。Price等[54]證明 Ser138、Tyr151和Lys155的突變體蛋白與NADPH的結(jié)合能力減弱、對乙酰乙酰輔酶A的催化活性急劇降低。保守基序Ser 138，Tyr151和Lys155是必需氨基酸，均集中在α5/β5催化口袋附近，在NADPH結(jié)合和電子傳遞中起著重要的作用。NADPH的結(jié)合會增強FabG對脂酰ACP的親和力，降低最大結(jié)合濃度，引起蛋白構(gòu)象的變化，導(dǎo)致Ser138、Tyr151和Lys155的重排。NADPH中核糖結(jié)構(gòu)上的羥基、Ser-Tyr-Lys基序和四分子水形成質(zhì)子傳遞通路。質(zhì)子由NADPH提供，Tyr151羥基介導(dǎo)，最終完成3-酮脂酰ACP還原(圖4A)[58]。

Ser138、Tyr151和Lys155突變體蛋白雖然對乙酰乙酰輔酶A的催化活性急劇降低，但FabG的天然底物是3-酮脂酰ACP而非脂酰輔酶A[59]。對茄科雷爾氏菌FabG1的研究表明突變Ser-Tyr-Lys任意殘基并不會喪失OAR的功能，在42 ℃依然能夠恢復(fù)大腸埃希菌CL104生長[42]。Hu等[60]對大腸埃希菌FabG催化活性位點展開研究，發(fā)現(xiàn)Ser138Ala、Tyr151Phe和Lys155Ala突變體蛋白在體外和體內(nèi)都保有足夠的OAR催化活性(圖4B)。突變體蛋白不僅能互補大腸埃希菌CL104菌株，而且能互補鼠傷寒沙門氏菌溫度敏感突變菌株CL65。在CL65中純化表達突變體蛋白，突變體蛋白在體外能夠在起始反應(yīng)和延伸反應(yīng)中完成脂肪酸合成。進一步以3-酮脂酰ACP為底物測定突變體蛋白活性，發(fā)現(xiàn)相對于野生型FabG，Ser138Ala、Tyr151Phe和Lys155Ala分別有82%、59%和50%的活力。這表明Ser138、Tyr151和Lys155并不是EcFabG的催化活性中心，更可能是作為維持催化中心結(jié)構(gòu)的氨基酸存在。以上研究結(jié)果表明，OAR可能存在不同于典型SDR超家族蛋白的電子傳遞機制和保守催化活性中心。

圖4 大腸埃希菌FabG假定催化機制(A)與突變體蛋白重建脂肪酸合成反應(yīng)(B)Fig. 4 The postulated catalytic mechanism of Escherichia coli FabG (A) and reconstruction of fatty acid by mutant protein (B)

2.2 細菌3-酮脂酰ACP還原酶的抑制劑研究

相比于細菌脂肪酸合成系統(tǒng)的其他成員，OAR在不同細菌間較為保守，是非常優(yōu)良的廣譜抗生素開發(fā)靶位點[61]。有關(guān)篩選細菌OAR抑制劑的工作也取得積極進展[62-63]。

植物多酚類物質(zhì)，尤其是黃酮類化合物對O A R具有抑制效果，如綠茶中的焙兒茶素(Epigallocatechin gallate，EGCG)及兒茶素是優(yōu)良的抑菌劑。EGCG及兒茶素以FAS II系統(tǒng)作為抑制靶點，有效地抑制了脂肪酸延伸過程中FabG和FabI所催化的還原反應(yīng)[64]。單寧酸及楓葉提取物革蘭陽性菌的抗菌活性也來自對OAR的抑制[65]。有研究表明，類黃酮和大環(huán)內(nèi)酰亞胺對FabG有抑制作用，且為非特異性抑制，所以不能應(yīng)用于臨床[66]；鱟素能夠抑制4種革蘭陰性細菌的OAR，但存在細胞毒性和溶血作用[67]。反式肉桂酸及其衍生物也有很顯著的OAR抑制能力，這些化合物不僅能阻遏NADPH結(jié)合，還能夠與多個重要的氨基酸活性殘基結(jié)合，阻止底物的靠近[68]。

Cukier等[46]篩選到16個銅綠假單胞菌FabG蛋白抑制物，其IC50僅為nmol級，是極具潛力的銅綠假單胞菌抗菌藥物，對這些抑制物的結(jié)合位點進行分析，發(fā)現(xiàn)抑制劑均結(jié)合在FabG亞基相鄰界面的變構(gòu)位點；此外他們還發(fā)現(xiàn)抑制劑在FabG的結(jié)合主要依賴于疏水相互作用，但也有抑制劑依賴于特定的氫鍵與FabG結(jié)合。抑制劑一旦與FabG結(jié)合，蛋白-抑制劑復(fù)合物的構(gòu)象發(fā)生改變，無法與NADPH結(jié)合[24]。然而這些化合物對其他OAR的抑制效果并不好。

Vella等[56]篩選出一系列IC50在μmol級的抑制物，并且證明了這些抑制物與銅綠假單胞菌篩選到的抑制物一樣，結(jié)合在亞基界面的變構(gòu)位點上，尤其是α4/α5螺旋；通過對變構(gòu)位點的研究證明Asn86羰基、側(cè)鏈基團Tyr151和Lys155參與結(jié)合NAPDH的氫鍵形成，而多肽鏈骨架上的Gly182和Ile184也可能參與；抑制劑的結(jié)合位點主要由疏水殘基組成，通過一個額外的極性相互作用作用于亞基表面，抑制物主要阻遏NADPH和OAR的相互作用。

Varakala等[67]通過高通量從細菌中篩選出43個可以抑制多個FabG的合成物，其中14個為吲哚類，29個為酰胺類；對藥物動力學(xué)的研究表明，其中7個可以在μmol級抑制多個FabG的活性；5-溴-2-(噻吩-2-甲酰胺)苯甲酸和6-溴-2-(二甲氨基)甲基)-5-羥基-1-苯基-1H-吲哚-3-甲酸乙酯能夠抑制6個FabG，且IC50為7～70 μmol/L，2-(2,6-二氯芐基)硫代)吡唑[1,5-a][1,3,5]三嗪-4(3H)-酮能夠抑制4個FabG。

3 其他類型的3-酮脂酰ACP還原酶

許多細菌基因組中，除了fab基因簇的fabG基因外，還有多個基因被標(biāo)注為OAR編碼基因。這些基因大體可分為2類：一類編碼的蛋白在體外和體內(nèi)均具有OAR活性，但它們不參與脂肪酸合成，而是專一地參與一些次生代謝物的合成，執(zhí)行特殊的生物學(xué)功能；另一類編碼的蛋白沒有OAR活性，具體的生物學(xué)功能有待深入研究。

3.1 分枝桿菌的MabA參與分枝酸的合成

分枝酸是分枝桿菌屬細菌細胞壁的特殊成分，是一類含60～90個碳原子的長鏈3-羥基脂肪酸。研究證明分枝桿菌的膜磷脂脂肪酸由I型脂肪酸合成系統(tǒng)(FAS I)生成，而分枝酸的合成則由FAS II催化。分枝桿菌首先通過FAS I以乙酰-CoA為底物合成16～26碳的脂肪酸鏈，接下來利用FAS II將碳鏈進一步延伸到48～60個碳，進而形成分枝酸。分枝桿菌的FAS II 相關(guān)基因包括fabD-acpMkasA-kasB-accA基因簇和mabA-inhA基因簇。

Banerjee等[69]克隆了結(jié)核分枝桿菌的mabA(Rv1483，MtFabG1)，并純化得到MabA蛋白，MabA蛋白能夠消耗NADPH，并還原乙酰乙酰輔酶A。這表明MabA蛋白具有O A R活性。Marrakchi等[70]證實MabA參與結(jié)核分枝桿菌的分枝酸合成，對短鏈的3-酮脂酰脂肪酸的親和力很低，而對長鏈(C8～C16)的3-酮脂酰脂肪酸的親和力較高。Parish等[71]證實inhA與mabA共轉(zhuǎn)錄；且只有在外源攜帶有編碼mabA-inhA基因簇的質(zhì)粒存在時才能將染色體上的mabA敲除，這表明mabA是必需基因。此外Parish等[71]也發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌fabG并不能替換結(jié)核分枝桿菌的mabA，而恥垢分枝桿菌Mycobacterium smegmatis的mabA可以替換結(jié)核分枝桿菌mabA，并且替換菌株的分枝酸和細胞通透性沒有改變。這表明分枝桿菌FAS II系統(tǒng)有獨特的OAR，參與分枝酸的合成。

3.2 苜蓿中華根瘤菌NodG參與結(jié)瘤因子合成

除染色體外，苜蓿中華根瘤菌還有1個巨質(zhì)粒SymA，與共生結(jié)瘤相關(guān)的nod基因簇位于該巨質(zhì)粒上。nod基因簇中的nodG被標(biāo)注為OAR，其編碼的蛋白與大腸埃希菌FabG的序列一致性達到53%。nodG不是苜蓿中華根瘤生長的必需基因，敲除后并不影響菌體脂肪酸生成。但是體外和體內(nèi)試驗顯示NodG具有OAR活性(圖5A)。同時證明，在過表達nodG的情況下可以敲除fabG，且突變菌株的脂肪酸組成與野生菌株一致。這表明nodG在苜蓿中華根瘤菌中行使與fabG相似的功能。然而遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)nodG缺失會導(dǎo)致苜蓿結(jié)瘤效率降低，并證明其專一性地參與結(jié)瘤因子的合成(圖5B)[43]。

圖5 苜蓿中華根瘤菌NodG具有OAR活性并參與苜蓿結(jié)瘤Fig. 5 The Sinorhizobium meliloti NodG maintains OAR activity and involves in alfalfa nodulation

3.3 野油菜黃單胞菌FabG2是一種新型OAR

可擴散信號分子DSF介導(dǎo)黃單胞菌的群體感應(yīng)調(diào)控，目前在黃單胞菌中已經(jīng)鑒定到4種DSF類信號，它們的化學(xué)本質(zhì)是主碳鏈含12個碳原子的順-2-不飽和烯酸[72-73]。Yu等[13]研究表明野油菜黃單胞菌的3-酮脂酰ACP合成酶III能以支鏈CoA為底物合成支鏈脂肪酸，同時決定了野油菜黃單胞菌產(chǎn)生多種類型的DSF類信號。

在野油菜黃單胞菌中，與fabG1不同，fabG2是1個獨立基因，其編碼的蛋白與大腸埃希菌FabG的序列一致性僅為32.4%。Hu等[44]的研究發(fā)現(xiàn)FabG2對短鏈3-酮脂酰ACP的催化活性低，單獨fabG2不能恢復(fù)大腸埃希菌fabG溫度敏感突變菌CL104的生長，也不參與野油菜黃單胞菌脂肪酸的從頭合成。然而在與哈氏弧菌Vibrio harveyi脂酰ACP合成酶基因(aasS)共轉(zhuǎn)錄，并外源添加辛酸后，fabG2可以使CL104在非許可溫度生長，表明FabG2對中長鏈的3-酮脂酰ACP具有較強的催化活性(圖6A)。另外研究發(fā)現(xiàn)，在添加有辛酸時，過表達fabG2能夠獲得fabG1敲除突變菌株(圖6B)。更為重要的是敲除XccfabG2導(dǎo)致野油菜黃單胞菌的DSF類信號合成量顯著降低(圖6C)。這表明FabG2是1個專一性參與DSF類信號合成調(diào)控的新型OAR。

圖6 XccfabG2互補OAR突變菌株及參與Xcc DSF類信號分子合成Fig. 6 XccfabG2 complements OAR mutant strain and invovles in DSF signal synthesis in Xcc

3.4 野油菜黃單胞菌FabG3參與菌黃素合成

在野油菜黃單胞菌野油菜致病變種中，已經(jīng)鑒定了3個OAR的生物學(xué)功能。FabG1參與脂肪酸合成，F(xiàn)abG2參與DSF類信號分子合成調(diào)控，而fabG3位于菌黃素合成基因簇中。Yu等[74]的研究結(jié)果表明，F(xiàn)abG3在體外和體內(nèi)均能行使OAR的功能(圖7A)，但fabG3的缺失并不會導(dǎo)致Xcc的生長或脂肪酸組成發(fā)生改變；然而突變菌株菌黃素合成受阻，同時證明這一性狀不能由其他OAR編碼基因互補恢復(fù)，只能由fabG3互補恢復(fù)(圖7B)。這些研究結(jié)果表明，F(xiàn)abG3是一種專一性參與菌黃素合成的OAR。

圖7 XccfabG3互補CL104并參與菌黃素合成Fig. 7 XccfabG3 complements CL104 and invovles in xanthomonadin synthesis in Xcc

3.5 其他OAR編碼基因功能

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，脂肪酸合成系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的多種致病過程中起重要作用。在PAO1的基因組中，有42個SDR超家族基因，12個標(biāo)注為OAR家族基因。Guo等[45]對銅綠假單胞菌基因組中的候選基因進行了系統(tǒng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除fabG外，只有PA4389和PA4786具有OAR的活性；PA4389和PA4786在體內(nèi)和體外均能行使OAR功能。然而，PA4389和PA4786并不參與銅綠假單胞菌的脂肪酸合成，這2個基因突變后，銅綠假單胞菌的脂肪酸組成并沒有顯著改變，但信號分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮類(PQS)合成量減少50%以上。這表明PA4389和PA4786雖然不直接參與銅綠假單胞菌的脂肪酸合成，卻影響其信號分子的合成。

Guo等[45]研究表明其他的OAR家族候選基因雖然不具備OAR活性，但在其他代謝途徑中發(fā)揮作用。PA3128與苜蓿中華根瘤菌參與TCA循環(huán)的關(guān)鍵基因SMc02486的氨基酸序列有60%的一致性。PA3128被敲除后，突變菌株的PQS合成量提高了20%，彈性蛋白酶水解酶LasB的活性降低20%。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，以L-丙氨酸或D-海藻糖為碳源時，PA3128的突變菌株生長緩慢，最終得到的生物量僅為野生型的20%～40%，而以D-天冬氨酸為唯一碳源時，PA3128的突變菌株完全不能生長。以上結(jié)果表明PA3128可能也參與銅綠假單胞菌的TCA循環(huán)。而PA0182和PA1470在銅綠假單胞菌利用L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和L-組氨酸時發(fā)揮重要作用，任何單突變菌株均不能利用以上氨基酸。PA3387(RhlG)曾認為參與銅綠假單胞菌重要致病因子鼠李糖脂的合成，然而Zhu等[33]的研究表明無論在體外還是體內(nèi)RhlG都不能催化3-酮基癸酰ACP還原為3-羥基癸酰ACP，并不參與鼠李糖脂的合成。

在天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor中，脂肪酸可以用于次級代謝產(chǎn)物十二烷基二苷酸的生物合成。天藍色鏈霉菌基因組的3個OAR候選基因編碼的蛋白均能夠催化β-酮脂酰-N-乙酰半胱氨酸。其中SOC1815是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶；而SOC1345能夠區(qū)分β-酮脂酰-N-乙酰半胱氨酸-ACP和β-酮脂酰-ACP；SOC1846的生物學(xué)功能尚不清楚[75]。

4 總結(jié)與展望

細菌脂肪酸合成機制高度保守，這不僅表現(xiàn)在不同細菌脂肪酸合成相關(guān)酶的蛋白序列高度相似，而且相關(guān)編碼基因在染色體上的排列順序也非常相似。但是研究發(fā)現(xiàn)不同細菌的脂肪酸合成機制存在差異，主要體現(xiàn)在：1)同種細菌中催化同一生化反應(yīng)的酶有多種；2)不同細菌催化同一生化反應(yīng)的酶的結(jié)構(gòu)不同；3)不同細菌合成同樣產(chǎn)物的方式和機制不同。

生物信息學(xué)分析顯示細菌基因組中有許多注釋為OAR的編碼基因，這些基因編碼的蛋白有些具有OAR活性，且能夠遺傳互補大腸埃希菌fabG溫敏突變菌株，但是研究證明真正參與細菌脂肪酸合成的OAR由位于脂肪酸合成基因簇(fab)中的fabG編碼。fabG是細菌的必需基因，突變該基因致死細菌。雖然有些OAR的編碼基因，例如中華苜蓿根瘤菌nodG和野油菜黃單胞菌fabG2，在某些特殊條件下能夠替代fabG，合成脂肪酸，維持菌體生長，但是NodG和FabG2不是FabG的同工酶，它們各自有自己的生物功能，催化不同物質(zhì)的合成。因此，與參與細菌脂肪酸合成的其他酶不同，OAR只有FabG類同工酶，因此，F(xiàn)abG是一個理想的抗菌藥物篩選靶標(biāo)，可用于廣譜抗菌藥物的篩選。

除了參與細菌脂肪酸合成的FabG外，細菌中還有一些具有OAR活性的蛋白，目前研究證明這些OAR往往專一地參與脂肪酸相關(guān)物質(zhì)的合成，如分枝酸、結(jié)瘤因子、菌黃素等。這表明這些酶對3-酮基脂酰基團具有還原能力。因此，對這些OAR功能的鑒定將有助于研究一些與脂肪酸相關(guān)物質(zhì)合成，至少可以推測這些物質(zhì)合成中可能有3-酮基脂?；鶊F的還原反應(yīng)。

FabG作為一個潛在的優(yōu)良廣譜抗菌藥物的開發(fā)靶點，雖然引起了科學(xué)家們的高度關(guān)注，并據(jù)此篩選或設(shè)計了一些藥物，但目前鮮見臨床應(yīng)用或工業(yè)化生產(chǎn)的報道。Ser-Tyr-Lys基序是SDR超家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征之一，也是該類蛋白的催化活性中心，然而大腸埃希菌FabG催化機制研究證明，Ser-Tyr-Lys基序在FabG催化3-酮基脂酰ACP還原中并不起關(guān)鍵作用，這表明FabG可能采用有別于一般S D R家族蛋白的催化機制。這也要求對FabG更深入地研究，進一步解析FabG的結(jié)構(gòu)特點和催化特性，為以FabG為靶點開展藥物設(shè)計奠定基礎(chǔ)。