張 申, 陳 坤, 趙丹鵬, 張紅霞, 徐國衛(wèi)△
(1鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)電生理科,河南 鄭州 450000;2鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 鄭州 450000)
帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病,多發(fā)于老年人群,其典型臨床癥狀包括肌肉僵直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢反射障礙等,其主要神經(jīng)病理學(xué)特征為腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失[1-2]。近年來,帕金森病發(fā)病率不斷上升,但目前的治療手段只能部分緩解疾病癥狀,缺乏足夠有效、成熟的藥物阻止或逆轉(zhuǎn)帕金森病情進(jìn)展[3]。因此,尋找有效的藥物減少腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失,仍是帕金森病治療的重要挑戰(zhàn)。和厚樸酚是中藥厚樸中的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗菌、抗氧化等多重效用[4]。研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚能減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷,具有發(fā)展為抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的潛力[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),退行性疾病的發(fā)生與自噬缺陷有關(guān),誘導(dǎo)自噬能減少帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失、凋亡[6-7]。而和厚樸酚在肺癌中被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)肺癌A549 細(xì)胞自噬,但其對(duì)抗帕金森病模型小鼠神經(jīng)損傷的機(jī)制是否涉及自噬尚不清楚[8-9]。AMP 活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)通路是常見的自噬通路[10]?;诖?,本研究將探討和厚樸酚調(diào)控自噬通路對(duì)帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響。
雄性C57BL/6小鼠共80只,10周齡,購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SCXK(豫)2017-0001。飼養(yǎng)條件:室溫(24~26)℃,濕度45%~55%,自由飲食進(jìn)水,晝夜12 h交替循環(huán)。
1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)購自Med-ChemExpress;和厚樸酚購自上海寶曼生物科技有限公司;氯喹購自TargetMol;TUNEL 試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司;beclin-1 免疫組化染色試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司;兔抗p-AMPK、兔抗AMPK、兔抗SIRT1、兔抗beclin-1、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、兔抗胱天蛋白酶3(caspase-3)、兔抗GAPDH 和山羊抗兔Ⅱ抗均購自Abcam;兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)購自北京博奧森生物科技有限公司。SA102型Rotarod疲勞轉(zhuǎn)棒儀購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司;DM3000型熒光顯微鏡購自Leica;Ti-S型顯微鏡購自Nikon;GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。
3.1 帕金森病小鼠模型制備 采用MPTP注射法建立帕金森病小鼠模型。用生理鹽水將MPTP 稀釋為1 g/L,向小鼠腹腔注射30 mg/kg,每日1次,連續(xù)注射7 d,觀察到小鼠自發(fā)性活動(dòng)減少,爬行、逃避反應(yīng)減慢,靜息時(shí)全身明顯震顫,表明帕金森病小鼠模型構(gòu)建成功。
3.2 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)給藥 將本實(shí)驗(yàn)?zāi)P蜆?gòu)建成功的64 只小鼠分為模型組、低劑量和厚樸酚組、高劑量和厚樸酚組及自噬抑制組,每組16 只,另取同期連續(xù)腹腔注射7 d 等體積生理鹽水的16 只小鼠為對(duì)照組。低、高劑量和厚樸酚組小鼠分別灌胃20 和60 mg/kg 和厚樸酚(用乙醇溶解后,用生理鹽水分別配制成 2 和 6 g/L,分別灌胃 10 mL/kg)[9],自噬抑制組小鼠灌胃60 mg/kg 和厚樸酚和20 mg/kg 氯喹(用生理鹽水分別配制成2 g/L,灌胃10 mL/kg),對(duì)照組及模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水(灌胃10 mL/kg),連續(xù)灌胃14 d,每日1次。
3.3 小鼠行為學(xué)功能測試 末次給藥后,采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)及爬桿實(shí)驗(yàn)測試所有小鼠的行為學(xué)功能。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn):小鼠置于疲勞轉(zhuǎn)棒儀的30 mm 轉(zhuǎn)棒上,設(shè)置轉(zhuǎn)速為30 r/min,記錄從轉(zhuǎn)棒開始旋轉(zhuǎn)到小鼠掉落的時(shí)間(跌落潛伏期),每只小鼠連測3 次,每次間隔1 min,取3 次結(jié)果的均值為最終結(jié)果,所有小鼠在正式測試之前適應(yīng)性測試3 次。爬桿實(shí)驗(yàn):長50 cm、直徑1 cm 的木桿上端固定直徑25 cm 的軟木球,木桿上纏紗布防滑,將小鼠置于軟木球上,記錄小鼠爬至桿底所需時(shí)間(爬桿時(shí)間),所有小鼠在正式測試之前引導(dǎo)自桿頂爬下至桿底3次。
3.4 TUNEL 染色檢測黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡 進(jìn)行行為學(xué)功能測試后,每組取8 只小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉斷頭處死,分離腦部黑質(zhì),甲醛固定、乙醇脫水、透明后石蠟包埋、切片。黑質(zhì)石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化等處理后,滴加不含DNase 的蛋白酶K,并在37 ℃下作用15 min,PBS 洗滌。于冰上制備TUNEL反應(yīng)混合液,滴加在標(biāo)本上50 μL,于暗濕盒中37 ℃反應(yīng)1 h,PBS 洗滌,用含DAPI 的抗熒光淬滅封片液封片,在熒光顯微鏡下觀察,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
3.5 免疫組化染色檢測黑質(zhì)中beclin-1表達(dá) 黑質(zhì)石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化等常規(guī)操作脫蠟至水,用 0.2%Triton X-100 室溫孵育 10 min,用 3%H2O2溶液室溫下孵育10 min,浸入枸櫞酸鈉緩沖溶液中用微波爐加熱修復(fù)抗原,常溫冷卻,用5%脫脂奶粉室溫孵育0.5 h,加入I抗(兔抗beclin-1)4 ℃孵育過夜,加入II抗(羊抗兔IgG)室溫孵育0.5 h,滴加SABC 室溫反應(yīng)20 min,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片,顯微鏡觀察,低倍鏡下選beclin-1 陽性細(xì)胞密集區(qū),高倍鏡下選5 個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),取均值。
3.6 Western blot 法檢測黑質(zhì)中AMPK/SIRT1 自噬通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 每組剩余8只小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉,斷頭處死,分離腦部黑質(zhì),于冰上加入含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液,置于搖床上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min 離心30 min 分離上清,BCA 法測定總蛋白濃度。各個(gè)蛋白標(biāo)本取40 μg,采用SDS-PAGE分離蛋白,結(jié)束后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上,放在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,分別放入不同I 抗(兔抗AMPK、兔抗p-AMPK、兔抗 SIRT1、兔抗 LC3、兔抗 beclin-1、兔抗Bax、兔抗 caspase-3 和兔抗 GAPDH)孵育液(均 1∶1 200稀釋)中4℃孵育過夜,PBS洗膜,放入山羊抗兔Ⅱ抗孵育液(1∶2 000 稀釋)中室溫孵育1 h,PBS 洗膜,加ECL 發(fā)光液顯色,在凝膠成像系統(tǒng)中掃描圖像,用ImageJ軟件分析圖像中各條帶灰度。
本研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,使用GraphPad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與對(duì)照組相比,模型組小鼠的跌落潛伏期顯著縮短,爬桿時(shí)間顯著延長(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量和厚樸酚組小鼠的跌落潛伏期顯著延長,爬桿時(shí)間顯著縮短(P<0.05);隨著和厚樸酚劑量的升高,小鼠的跌落潛伏期延長,爬桿時(shí)間縮短(P<0.05);與高劑量和厚樸酚組相比,自噬抑制組小鼠的跌落潛伏期顯著縮短,爬桿時(shí)間顯著延長(P<0.05),見圖1。
與對(duì)照組相比,模型組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05);隨著和厚樸酚劑量的升高,小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率降低(P<0.05);與酚高劑量和厚樸酚組相比,自噬抑制組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖2。
與對(duì)照組相比,模型組小鼠黑質(zhì)中beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)中beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05);隨著和厚樸酚劑量的升高,小鼠黑質(zhì)中beclin-1陽性細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05);與高劑量和厚樸酚組相比,自噬抑制組小鼠黑質(zhì)中beclin-1陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05),見圖3。
與對(duì)照組相比,模型組小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);隨著和厚樸酚劑量的升高,小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與高劑量和厚樸酚組相比,自噬抑制組小鼠黑質(zhì)中 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和 beclin-1 蛋白表達(dá)水平 顯 著 降 低(P<0.05),見圖4。
Figure 1. Fall latency(A)and pole climbing time(B)of the mice in each group. Mean±SD. n=16.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose honokiol group;▲P<0.05 vs high-dose honokiol group.圖1 各組小鼠跌落潛伏期和爬桿時(shí)間
與對(duì)照組相比,模型組小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);隨著和厚樸酚劑量的升高,小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與高劑量和厚樸酚組相比,自噬抑制組小鼠黑質(zhì)中Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖5。
Figure 3. The positive expression of beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose honokiol group;▲P<0.05 vs high-dose honokiol group.圖3 各組小鼠黑質(zhì)中beclin-1陽性表達(dá)情況
帕金森病是全球僅次于阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性疾病,影響約1%的60 歲以上人群的健康[11]。帕金森病的發(fā)生可導(dǎo)致患者生活不能自理,嚴(yán)重降低生活質(zhì)量,還會(huì)引起多種并發(fā)癥,然而目前無法根治[12]。因此,探索更有效的藥物改善帕金森病癥狀并明確其相關(guān)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失是帕金森病最主要的病理改變,目前研究通常通過使用神經(jīng)毒素特異性損傷腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元,模擬相應(yīng)病理改變,構(gòu)建帕金森病動(dòng)物模型[13]。本研究使用可透過血腦屏障的神經(jīng)毒素MPTP 構(gòu)建帕金森病小鼠模型,可見小鼠的跌落潛伏期顯著縮短,爬桿時(shí)間顯著延長,表明小鼠姿勢調(diào)整及平衡協(xié)調(diào)能力減弱,在行為學(xué)上已出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢協(xié)調(diào)障礙,帕金森病造模成功。同時(shí),MPTP誘導(dǎo)建模后,小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及凋亡蛋白Bax和caspase-3 水平顯著升高,表明MPTP 已損傷小鼠的腦黑質(zhì),導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失。
和厚樸酚是中藥厚樸中最主要的兩個(gè)活性成分之一,具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及保護(hù)心腦血管等,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤其顯著,已被發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁、抗癲癇、抗焦慮、抗凝血、抗老年癡呆及抗帕金森病神經(jīng)損傷等作用[14]。徐瑩等[9]發(fā)現(xiàn),和厚樸酚能增加帕金森病小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)及腦內(nèi)多巴胺含量,具有神經(jīng)保護(hù)作用。Chen 等[15]發(fā)現(xiàn),和厚樸酚能激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ,緩解偏側(cè)帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。本研究顯示,使用和厚樸酚治療后,帕金森病小鼠的跌落潛伏期顯著延長,爬桿時(shí)間顯著縮短,同時(shí)小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白水平逐漸降低,且和厚樸酚劑量越高,效果越明顯,表明和厚樸酚可抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡,減輕行為學(xué)障礙,但其降低黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
自噬,又稱作Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,在細(xì)胞生長發(fā)育及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定調(diào)節(jié)過程中起重要作用,目前普遍被認(rèn)為是一種防御、應(yīng)激調(diào)控機(jī)制,在細(xì)胞應(yīng)激條件下,可將損傷細(xì)胞器、錯(cuò)誤蛋白再利用,避免更多細(xì)胞損傷、凋亡[16]。大量研究發(fā)現(xiàn),帕金森病等退行性疾病的發(fā)生伴隨自噬缺陷,自噬的減弱很可能是退行性疾病患者神經(jīng)元不斷凋亡的重要因素[17-18]。本研究亦顯示,帕金森病小鼠黑質(zhì)中自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I 和beclin-1 水平顯著降低,黑質(zhì)中beclin-1陽性細(xì)胞數(shù)亦顯著降低,表明帕金森病發(fā)生后,能發(fā)生自噬反應(yīng)的黑質(zhì)神經(jīng)元減少,黑質(zhì)中自噬反應(yīng)減弱。
Figure 4. The protein levels of p-AMPK,AMPK,SIRT1,LC3-I,LC3-II and beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group.Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose honokiol group;▲P<0.05 vs high-dose honokiol group.圖4 各組小鼠黑質(zhì)中p-AMPK、AMPK、SIRT1、LC3-I、LC3-II和beclin-1蛋白水平
Figure 5. Expression of Bax and caspase-3 proteins in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose honokiol group;▲P<0.05 vs high-dose honokiol group.圖5 各組小鼠黑質(zhì)中Bax和caspase-3蛋白表達(dá)情況
AMPK/SIRT1是調(diào)控自噬的上游信號(hào)通路,自噬過程中,AMPK 發(fā)生磷酸化并激活SIRT1,導(dǎo)致下游beclin-1表達(dá)增加,LC3由LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化[19]。本研究顯示,MPTP 誘導(dǎo)建模后,小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平降低,表明帕金森病發(fā)生時(shí),AMPK/SIRT1介導(dǎo)的自噬途徑受到抑制。有研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚能激活SIRT1/FOXO1信號(hào)通路,抑制膿毒癥腦損傷小鼠腦組織細(xì)胞凋亡[20]。陳蘭等[21]研究顯示,和厚樸酚能激活Sirt3/AMPK 途徑,抑制肺微血管內(nèi)皮凋亡。本研究使用和厚樸酚治療后,帕金森病小鼠黑質(zhì)中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達(dá)水平及beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)均顯著升高,表明和厚樸酚可激活A(yù)MPK/SIRT1介導(dǎo)的自噬途徑,恢復(fù)自噬反應(yīng),提高發(fā)生自噬反應(yīng)的黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量。使用和厚樸酚治療的同時(shí)使用氯喹抑制自噬反應(yīng),結(jié)果可見,小鼠的跌落潛伏期顯著縮短,爬桿時(shí)間顯著延長,黑質(zhì)中beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)及 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和 beclin-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低,黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高。這些結(jié)果表明,和厚樸酚抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的機(jī)制與激活A(yù)MPK/SIRT1 通路介導(dǎo)的自噬反應(yīng)有關(guān)。
綜上所述,和厚樸酚能激活自噬反應(yīng),活化AMPK/SIRT1通路,抑制帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡,改善其行為學(xué)功能,可為臨床改善帕金森病癥狀提供參考資料。