張 茜,羅景琳,王浩楠,李迎迎,冷平生,胡增輝

(1.北京林木分子設計育種高精尖創(chuàng)新中心,北京 102206;2.北京農(nóng)學院 園林學院,北京 102206)

釋放花香是開花植物的重要特性?；ㄏ悴粌H在促進植物傳粉和抵御外來侵害[1-2]等方面發(fā)揮著重要作用,而且作為植物重要的觀賞性狀之一,是評價植物觀賞價值和經(jīng)濟價值的重要指標。花香由一系列低分子量次生代謝揮發(fā)物組成,主要包括萜烯類、脂肪族類、苯環(huán)類/苯丙烷類及一些含硫、含氮類等化合物[3-4]。深入了解花香合成調(diào)控機制能為開展植物花香育種及揭示花香生理生態(tài)功能提供理論支撐。

百合是世界著名的五大切花之一,因其氣味芳香濃郁而具有極高的觀賞和經(jīng)濟價值。百合花香的主要成分為萜烯類化合物,包括芳樟醇、羅勒烯和月桂烯等[5-6]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn),不同品系百合的花香也存在明顯差別[7],如濃香型的東方百合香氣過于濃郁,而淡香型的亞洲百合的香味很弱,因此培育芳香適宜的百合新品種成為新的育種趨勢。研究表明,萜烯合成途徑活化水平不同是導致東方百合(濃香型)和亞洲百合(淡香型)香味差異的一個重要原因[8]。但目前對于百合萜烯合成調(diào)控機制尚未清楚解析。

萜類化合物是由異戊二烯(C5)基本單元組成,C5單元的合成前體物質(zhì)為異戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)。IPP的合成主要包括兩條途徑,分別是在細胞質(zhì)中以倍半萜合成為主的甲羥戊酸(MVA)途徑和在質(zhì)體中以單萜合成為主的甲基赤蘚糖醇磷酸(MEP)途徑[9]。由于單萜類化合物是百合花香的主要成分,因此對MEP途徑關鍵酶基因的功能解析成為實現(xiàn)百合花香合成調(diào)控的前提。近年來,對于MEP途徑關鍵酶基因的研究越來越多,在金魚草(Antirrhinum majus)[10]、百合、薰衣草(Lavandula angustifolia)[11]等植物中多個關鍵基因被克隆出來,并且部分基因也已被證明在單萜合成中起關鍵作用。在百合中,Li TPS、Li DXS、Li DXR、Li MCT等MEP途 徑 基 因 已 被 克隆[12-14],表達模式和功能也逐漸被解析,但尚有多個基因未被鑒定。在MEP途徑中,2-C-甲基赤蘚糖醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶(MCS)催化二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸(CDP-MEP)生成2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環(huán)二磷酸(MEPcPP),是合成單萜的關鍵步驟。該基因已在長春花(Catharanthus roseus)[15]、盾葉薯蕷(Dioscoreazingiberensis)[16]、青 蒿(Artemisia annua)[17]等植物中相繼被克隆出來,且在長春花、盾葉薯蕷和青蒿中都已被證明其對萜類物質(zhì)合成具有重要作用。但MCS基因在百合中尚未被克隆,對其表達模式和功能還不清楚。

本研究選用東方百合‘西伯利亞’為材料,克隆Li MCS基因,通過生物信息學、熒光定量PCR(qRT-PCR)及亞細胞定位等,預測其特征及功能,并明確其表達模式,為揭示Li MCS基因在‘西伯利亞’百合單萜類物質(zhì)合成中的作用和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的植物材料為‘西伯利亞’百合(Lilium‘Siberia’)實生苗,種球購自北京荷景良苑貿(mào)易有限公司,種植于北京農(nóng)學院東大地(40°5′24″N,116°17′55″E)單坡面溫室中。試驗選取3株無病蟲害、生長健壯、均高100 cm的植株,在不同的花期及在盛花期的不同器官和組織進行采樣。采樣分為花蕾期、半開期、盛開期和衰敗期4個時期,在盛花期采集根、莖、葉、外花被片、內(nèi)花被片、花藥、子房、花柱、花絲的樣品,每組樣品設置3個重復。置于液氮中速凍,-80℃保存。

1.2 ‘西伯利亞’百合總RNA的提取及第一條鏈的合成

將樣品在滅菌及用液氮遇冷過的研缽中進行研磨,直至樣品研磨成粉末狀。選用TransZol UP Plus RNA Kit試劑盒(TransGen Biotech,中國北京)提取‘西伯利亞’百合的總RNA。

用于基因克隆與q RT-PCR的cDNA第一條鏈合成分別選用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(Trans-Gen Biotech,中國北京)與Evo M-MLV RT Premix for qPCR試劑盒(Accurate Biology,中國湖南),按照說明書進行,反應完成后將其置于-20℃冰箱中保存。

1.3 LiMCS基因的克隆及驗證

基于前期測得‘西伯利亞’百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6],從中調(diào)取MCS基因,通過Snap Gene設計全長擴增引物(表1)。PCR擴增使用制備好的cDNA為模板進行,PCR反應體系為:上下游引物各1μL,cDNA模板1μL,2×A8 Fast HiFi PCR Master Mix 12.5μL,dd H2O 9.5μL,共25 μL的體系。PCR反應條件為:95℃預變性3 min,95℃變 性10 s,55℃退 火15 s,72℃延 伸20 s,進行35個循環(huán),最后72℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳實驗進行驗證。隨后使用50μL體系進行PCR擴增,將產(chǎn)物使用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit(TransGen Biotech,中國北京)進行回收純化,純化后的DNA片段置于-20℃冰箱中保存,備用。

將得到的目的片段連接至Pclone 007載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α(Escherichia coli)菌株,挑取陽性克隆,擴大培養(yǎng)后,用菌液PCR的方式進行初步驗證,選取符合要求的菌液送至華大基因公司進行測序。

1.4 LiMCS生信分析

使用生物信息學技術對‘西伯利亞’百合Li MCS相關生物信息進行分析預測(表2)。

表2 ‘西伯利亞’百合Li MCS基因生物信息預測軟件及網(wǎng)站Table 2 Software and website for predicting the biological information of Li MCS

1.5 Li MCS的亞細胞定位

將LiMCS終止子去除后,使用Nimble Cloning[18]的通用接頭序列設計引物G-Li MCS-F、G-LiMCS-R(表1),以LiMCS質(zhì)粒為模板以50 μL體系進行PCR擴增,同時使用2×Seam Less Mix酶切載體p NC-Green-Sub N,將兩個產(chǎn)物分別回收純化后進行同源克隆,構(gòu)建p NC-Green-Sub N-LiMCS載體,送華大基因測序。測序結(jié)果比對成功后將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中,使用注射法侵染煙草葉片,在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

表1 ‘西伯利亞’百合Li MCS基因克隆、亞細胞定位和表達分析引物序列Table 1 Primers for gene cloning,subcellular localization and expression analysis of Li MCS

1.6 LiMCS的時空表達分析

根據(jù)克隆得到的Li MCS基因,利用Snap-Gene設計該基因的熒光擴增引物(表1)。以90～100 ng用于qRT-PCR的cDNA作為反應模板配制反應溶液,再加入上下游引物各0.4μL,2×SYBR Green ProTaqHS Premix 10μL,最后使用RNase free water定容至至20μL,隨后將配制好并混勻的反應溶液置于熒光PCR儀(Bio-Rad-iQ5)中進行qRT-PCR分析。將得到的數(shù)據(jù)依據(jù) 相 對 表 達 量 公 式2-ΔΔCt并 使 用iQ5、Microsoft Excel和SPSS等軟件對Li MCS基因在‘西伯利亞’百合中時空表達的試驗結(jié)果進行計算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘西伯利亞’百合Li MCS的克隆

從全長Li MCS基因的電泳圖(圖1)可以看出,克隆的片段為500～750 bp,隨后將其產(chǎn)物回收純化,與Pclone007載體鏈接并轉(zhuǎn)化到DH5α上,經(jīng)菌落PCR驗證后送往華大基因公司進行測序,將結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的基因進行序列比對,以此確定Li MCS的最終序列。

圖1 ‘西伯利亞’百合Li MCS基因全長電泳擴增Fig.1 Agarose gel for amplification of full length of LiMCS gene

2.2 Li MCS核苷酸和氨基酸序列分析

2.2.1Li MCS核苷酸序列及其編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)分析 使用NCBI網(wǎng)站中的Open Reading Frame Finder功能,確定Li MCS最大的開放閱讀框為669 bp,利用DNAMAN軟件將其翻譯成氨基酸序列(圖2)。LiMCS蛋白是由222個氨基酸構(gòu)成,屬于2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環(huán)二磷酸 合 酶(2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase(MECDP))超家族(圖3)。

圖2 ‘西伯利亞’百合LiMCS基因核苷酸序列以及其氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequence of Li MCS gene

圖3 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白保守結(jié)構(gòu)Fig.3 The conserved domains of Li MCS

2.2.2 LiMCS氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建分析 使用NCBI中的Blast和DNAMAN軟件將LiMCS與其他植物MCS氨基酸序列的同源性進行比對,發(fā)現(xiàn)其與盾葉薯蕷DiMCS的相似度極高,與芝麻(Sesamum indicum)Se MCS、海棗(Phoenix dactylifera)Ph MCS、毛果楊(Populus trichocarpa)Po MCS、椰子(Cocos nucifera)Co MCS、油 棕(Elaeisguineensis)Ela MCS、香蕉(Musa acuminata)Mu MCS、荸薺(Eleocharis dulcis)Ele MCS等植物MCS蛋白的相似度較高(圖4)。為了進一步研究‘西伯利亞’百合Li MCS與其他植物的MCS同源基因的系統(tǒng)進化關系,使用MEGA7.0軟件構(gòu)建LiMCS與其他植物的MCS氨基酸序列的進化樹(圖5),發(fā)現(xiàn)其與盾葉薯蕷同源性最高并形成一個小亞群,和荸薺、香蕉、海棗、椰子和油棕等植物的親緣性較近。

圖4 LiMCS基因編碼的氨基酸序列與其他植物同源性比對Fig.4 The homology comparison between amino acid sequences encoded by Li MCS gene and MCS in other plants

圖5 ‘西伯利亞’百合Li MCS基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequence encoded by LiMCS gene

2.2.3 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白理化性質(zhì)利用Ex PASy-ProtParam在線工具對Li MCS蛋白的理化性質(zhì)進行預測,該基因共編碼222個氨基酸,其中含量最高的為亮氨酸(Leu),占13.5%;其次是丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)和絲氨酸(Ser),分別為11.3%、11.3%和9.0%,其正電殘基數(shù)(Asp+Glu)與負點殘基數(shù)(Arg+Lys)分別為21和23,為親水性不穩(wěn)定蛋白(表3)。

表3 ‘西伯利亞’百合Li MCS蛋白理化性質(zhì)分析Table 3 Physical and chemical properties of Li MCS protein

2.2.4 LiMCS二級和三級結(jié)構(gòu)分析 利用NPSA-PRABI在線軟件對LiMCS蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測,發(fā)現(xiàn)其由70個α-螺旋(alpha helix,Hh)、28個 延 伸 鏈(extended strand,Ee)、9個β-轉(zhuǎn)角(beta turn,Tt)及115個無規(guī)卷曲(random coil,Cc)組成(圖6)。由二級結(jié)構(gòu)卷曲折疊形成Li MCS的三級結(jié)構(gòu)模型,以2pmp.1.A(擬南芥異戊二烯生物合成途徑中2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶的結(jié)構(gòu))為模板,二者相似度高達89.31%,相似度大于60%被認為非常準確,其中序列覆蓋率為72%,C-β相互作用值為2.54(圖7)。

圖6 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測Fig.6 Prediction of secondary structure of Li MCS

圖7 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預測Fig.7 The prediction of tertiary structure of Li MCS

2.2.5 Li MCS蛋白信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預測分析

利用信號肽預測網(wǎng)站對LiMCS進行蛋白質(zhì)信號肽的預測,發(fā)現(xiàn)該蛋白不含信號肽(圖8)。隨后,又使用跨膜信息預測網(wǎng)站預測該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)(圖9)。由以上結(jié)果推斷,該蛋白不屬于信號蛋白。2.2.6 Li MCS蛋白磷酸化位點預測分析 通過在線軟件Net Phos 3.1 Server對‘西伯利亞’百合Li MCS蛋白磷酸化位點進行預測,發(fā)現(xiàn)該蛋白可能含有20個絲氨酸、4個蘇氨酸和1個酪氨酸(圖10)。

圖8 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白質(zhì)信號肽預測Fig.8 Protein signal peptide prediction of LiMCS

圖9 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白質(zhì)跨膜螺旋預測Fig.9 Transmembrane prediction of LiMCS

圖10 ‘西伯利亞’百合LiMCS蛋白磷酸化位點預測Fig.10 Prediction of protein phosphorylation sites of Li MCS

2.3 Li MCS亞細胞定位分析

圖11顯示LiMCS亞細胞定位的結(jié)果,通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白與葉綠體熒光場重合,說明其蛋白特異性定位于葉綠體中。

圖11 ‘西伯利亞’百合LiMCS亞細胞定位Fig.11 Subcellular localization of Li MCS

2.4 LiMCS時空表達模式分析

Li MCS在百合中的時空表達模式顯示(圖12),Li MCS的表達量隨著百合花的發(fā)育整體呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律。在半開期Li MCS基因的表達量達到頂峰,其次為盛開期與衰敗期,花蕾期表達量最低,僅為半開期的1/3。

圖12 ‘西伯利亞’百合Li MCS在不同花期的表達分析Fig.12 Expression analysis at different flowering stages of Li MCS

‘西伯利亞’百合Li MCS基因在不同器官和組織中的表達量也不相同(圖13)。Li MCS基因在花器官中的表達總和遠遠大于根、莖、葉,占總量的4/5,而花瓣中的表達量占總量的1/2。Li MCS在外瓣中表達量最高,內(nèi)瓣其次,葉中表達量僅次于花瓣。

圖13 ‘西伯利亞’百合盛開期Li MCS在不同器官和組織的表達分析Fig.13 Expression analysis in different plant organs and tissues of LiMCS in the flowering stage

3 討論

單萜類化合物是‘西伯利亞’百合花香的主要組成物質(zhì)。MCS是植物單萜物質(zhì)合成途徑中催化第五步反應所需的酶,該途徑的產(chǎn)物可以催化生成單萜類化合物的合成前體物質(zhì)IPP。因此,MCS基因的克隆及其功能的挖掘,能為‘西伯利亞’百合花香單萜類揮發(fā)物的合成及調(diào)控機制的研究提供依據(jù)。通過對一系列結(jié)構(gòu)基因的克隆,不斷深入花香調(diào)節(jié)機制的研究,從而實現(xiàn)花香的人為調(diào)控及后續(xù)的育種工作。本研究克隆出了‘西伯利亞’百合中的Li MCS基因,并通過生物信息學技術對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能進行了預測和分析,同時明確了其表達位置及表達模式。

通過氨基酸序列比對分析,得知LiMCS與盾葉薯蕷dz MCS具有較高的同源性。在盾葉薯蕷中,通過構(gòu)建dz MCS基因的大腸桿菌表達載體,最終加強了大腸桿菌的MEP途徑,尤其促進了胡蘿卜素的合成與積累[16]。同時,Li MCS具有保守結(jié)構(gòu)域,表明該基因編碼的蛋白是具有生物功能的蛋白,為Li MCS基因的功能研究提供了理論依據(jù)。Li MCS基因編碼的蛋白質(zhì)定位于煙草葉片表皮細胞的葉綠體中,這與單萜在質(zhì)體中經(jīng)MEP途徑合成相一致。‘西伯利亞’百合花香由花蕾期開始積累,在盛開期達到頂峰[19],而Li MCS基因主要在半開期表達量最高,推測該基因作為MEP途徑上游基因,在半開期進行了大量的轉(zhuǎn)錄積累,逐步合成下游單萜產(chǎn)物,最終在盛花期花香得到大量釋放。該基因主要在花瓣中發(fā)揮作用,這與‘西伯利亞’百合MEP途徑中上游Li DXS基因、Li DXR基因和下游單萜合酶Li TPS基因的表達模式基本吻合[12-13]。目前,MCS基因在部分植物中已有研究。長春花MCS基因的過表達,增加了單萜吲哚生物堿的含量,這表明增加MCS基因的表達將有助于代謝向下游流動[15]。將青蒿Aa MCS基因在擬南芥中超表達,類胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b含量顯著增加[17]。這些研究都表明MCS基因在萜烯類物質(zhì)合成中起重要作用。

Li MCS基因的克隆不僅擴充了百合的基因庫,為今后花香調(diào)控相關的基因工程研究提供目的基因,還為萜烯類合成釋放分子機制的深入探究奠定了基礎。但本研究僅闡述了該基因相關的理化性質(zhì)和表達模式,缺乏關于Li MCS基因調(diào)節(jié)‘西伯利亞’百合花香合成機制的研究,后續(xù)將會使用病毒誘導的基因沉默(VIGS)、瞬時過表達、啟動子克隆等分子生物學技術對Li MCS基因的功能展開更深入的探究,最終明確Li MCS基因在‘西伯利亞’百合花香合成中的作用機制。