張雪梅,韓 冰,蔣曉梅,劉明軍

(新疆畜牧科學院 生物技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室,新疆動物生物技術(shù)重點實驗室,烏魯木齊 830026)

在綿羊品種改良和遺傳育種進程中,毛色作為品種的重要特征,在確定雜交組合、品種純度及親緣關(guān)系鑒定等方面發(fā)揮著重要作用。動物毛色遺傳研究是動物表型變化遺傳機理研究的最好模型[1]。哺乳動物毛色由多個基因決定,不僅單個基因在發(fā)生突變后可影響毛色形成;而且多個基因通過相互作用也能控制毛色形成[2],最終由控制毛色的各個候選基因共同作用形成各種單色毛和復色毛。

自第一個毛色基因TYRP1在小鼠中被克隆到現(xiàn)在[3],已被發(fā)現(xiàn)有170多個毛色相關(guān)基因在不同發(fā)育階段調(diào)控毛色的產(chǎn)生。在哺乳動物中,黑色素形成的調(diào)控機制比較復雜,從黑色素細胞的分化、成熟到黑色素合成、轉(zhuǎn)運過程需要多個基因參與調(diào)控[4]。毛發(fā)和皮膚的基本毛色是由真黑色素和褐黑素的比例和分布決定的[5]。Agouti基因作為控制動物毛色的重要基因之一,通過競爭性結(jié)合α-促黑色素細胞激素,抑制酪氨酸酶相關(guān)基因表達,導致真黑色素合成減少,褐黑色素合成增加,抑制或減少ASIP基因表達能夠逆轉(zhuǎn)真黑素和褐黑素比例從而改變動物毛色[6]。綿羊具有白色、紅棕色、灰色、黑色等多種毛色[7]。以往的研究表明,綿羊顯性白色表型與ASIP基因拷貝數(shù)變異和ASIP基因表達下調(diào)相關(guān)。在一些綿羊品種中,白色被毛是由于ASIP基因的190 kb串聯(lián)重復,如澳大利亞美利奴羊。在美利奴羊中,ASIP基因本身存在的自然缺失突變類型很早就有記載。ASIP基因外顯子2上5 bp堿基的缺失導致轉(zhuǎn)錄框移碼隨后在第63位氨基酸翻譯提前終止,這被認為是黑色被毛羊的隱性突變[8]。同樣地,ASIP基因外顯子2上9 bp堿基的缺失導致三肽丟失,可能影響轉(zhuǎn)運前導序列的功能,這被認為是黑色被毛羊的一個因果突變[9]。

隨著近幾年分子遺傳學和生物新技術(shù)的蓬勃發(fā)展,新技術(shù)、新成果在綿羊育種領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用,不僅突破了傳統(tǒng)育種無法解決的遺傳難題,而且實現(xiàn)了對特定性狀的改變,大大提高了綿羊品種遺傳改良的速度[10]。在動物個體上利用新型基因編輯技術(shù)進行分子育種,可在較短時間獲得基因修飾動物個體,再利用純合子動物個體進行人工授精或自然交配實現(xiàn)群體逐步擴繁,通過短短2～3代就可以建立起一定規(guī)模的穩(wěn)定遺傳家系,與雜交育種相比能夠極大地縮短育種時間,降低育種成本[11]。目前報道的關(guān)于哺乳動物毛色遺傳學和生物學方面的研究,主要聚焦于全基因組學或編碼區(qū)上的SNP突變位點遺傳標記方面的研究[12],但對于ASIP基因自然缺失突變和編輯修飾的遺傳學研究尚未見深入報道,因此本研究以F0、F1代ASIP基因編輯細毛羊為研究對象,開展ASIP基因編輯羊自然突變和編輯基因型遺傳特征和規(guī)律的研究,為加速新疆細毛羊毛色性狀的選擇進程、加快細毛羊毛色育種進展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在新疆畜牧科學院中-澳綿羊繁育基地選取具有不同毛色的ASIP基因編輯細毛羊包括F0代(6只)和F1代(23只)個體,用無菌剪刀、鑷子剪取羔羊小塊尾部皮膚組織放入離心管投于液氮罐帶回實驗室,置于-20℃低溫冰箱保存,以備基因組DNA的提取。

1.2 雜交親本與雜交模式

課題組前期利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對中國美利奴細毛羊ASIP基因進行編輯修飾后,獲得了具有不同毛色表型的F0代基因編輯羊,分別將具有深棕色毛色表型的F0代基因編輯公羊與19只白色表型野生型母羊、具有深色斑點表型的2只F0代基因編輯母羊與白色野生型公羊配種,分別獲得具有白色和深棕色毛色表型的后代21只、2只,共計23只F1代個體。

1.3 毛色記錄

記錄親本毛色和各雜交組合的后代毛色,大致分以下幾種毛色類型,分別為周身黑而頭頂白、周身棕腹部淺、黑白花、棕白花、全白,因具有黑/棕白花等毛色個體數(shù)量較少,故文章中將上述毛色分為兩大類:白色(全白)和非白色(全白色以外的其他毛色)。

1.4 主要試劑

組織DNA提取試劑盒、RNase、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司;p MD19-T載 體、T4連 接 酶、150 bp、1 000 bp DNA marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;2×EasyTaqPCR Super Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖購自Life Technologies公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 引物設(shè)計與合成 按照NCBI數(shù)據(jù)庫中

發(fā)布的綿羊ASIP基因序列(登錄號為:NC_019470),采用Oligo 7.0軟件針對綿羊ASIP基因外顯子2序列設(shè)計特異性引物用于擴增ASIP基因426 bp長度的編碼區(qū),引物相關(guān)信息詳見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物名稱、引物序列、擴增片段大小和最佳退火溫度Table 1 Primer,sequence,amplified fragment size and optimum annealing temperature

1.5.2 基因組DNA提取 用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(北京天根)提取綿羊尾組織基因組DNA,實驗操作嚴格按照說明書進行,提取好的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,Nanodrop超微量分光光度計測定DNA濃度,將檢測合格的DNA稀釋至100 ng/μL,存于-20℃低溫冰箱。

1.5.3 PCR擴增與DNA測序 PCR反應(yīng)總體系為50μL,包括2×PCR Master Mix 25μL,模板DNA 100 ng,上、下游引物(濃度10μmol/L)各1μL,滅菌超純水補足至50μL。PCR擴增條件如下:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.4 序列比對和同源性分析 樣品測序結(jié)果用Chromas和Clustalx軟件進行序列比對分析,用Primer Premier 5.0軟件翻譯編碼區(qū)氨基酸。1.5.5 克隆測序 根據(jù)DNA測序比對結(jié)果,將具有重疊峰樣本的PCR擴增產(chǎn)物與p MD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,挑取克隆搖菌進行單克隆測序。每個樣本隨機選取至少50個菌落,用M13引物進行測序,最后將樣品測序結(jié)果與野生型序列進行比對鑒定確定發(fā)生編輯的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 F0、F1代個體編輯位點的檢測和編輯基因型分析

根據(jù)上述設(shè)計的引物分別對6只F0代、23只F1代羔羊基因組進行擴增,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠120 V電泳10 min檢測顯示在約426 bp處出現(xiàn)清晰條帶,電泳示意結(jié)果見圖1-A,B。

將PCR產(chǎn)物純化后送測序,通過Sanger測序法分析F0代個體以及由F0代公羊與野生型母羊配種獲得的F1代不同毛色綿羊個體的基因型,將測序結(jié)果進行比對,結(jié)合Chromas軟件觀察測序的峰圖,確定基因的插入、缺失和刪除情況。結(jié)果顯示5只F0代、17只F1代共計22只個體的測序峰圖在PAM序列附近都出現(xiàn)了雜亂的雙/套峰且序列紊亂無序,其余7只個體的測序峰圖均為單一峰,序列有序且與野生型序列一致。將發(fā)生雙/套峰樣品經(jīng)3%瓊脂糖凝膠90V電泳50 min后顯示在目的條帶附近出現(xiàn)2～3條帶,說明靶點DNA序列存在突變,表明上述22只綿羊發(fā)生了ASIP基因編輯(圖1-C)。

圖1 ASIP基 因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification of ASIP gene

PCR測序結(jié)合T-A克隆測序結(jié)果表明,5只F0代非白色毛色綿羊中共鑒定出11種插入/缺失編輯形式,主要的編輯基因型有5種,其中F0代4只母羊主要有2種基因型:4 bp(～153-156,TATC)堿基缺失和2 bp(～154-155/155-156,AT/TC)堿基缺失,2種基因型在F0代4只母羊中所占比例分別為45%和29.5%;F0代僅有的1只公羊TG110主要有3種基因型:4 bp(～153-156,TATC)堿基缺失、27 bp(～136-160且跨越3個內(nèi)含子ATTTCCCTTCTGTCTCTATCGTGGGTA))堿基缺失和5 bp,12 bp(～153-154,TCCTC;～154-155,TGTTCCCTTCTG)堿基插入,3種基因型在F0代公羊中所占比例分別為29%、29%和24%。而且,每只編輯綿羊至少發(fā)生了2種修飾,即使是具有相似編輯修飾的羔羊,也表現(xiàn)出不同的毛色圖案。

獲得的17只F1代基因編輯羊個體中有5只個體的基因型為4 bp堿基缺失;有5只個體的基因型為27 bp堿基缺失和1 bp堿基插入;有3只個體的基因型為5 bp,12 bp堿基插入;有2只個體的基因型為21 bp(～142-160且跨越3個內(nèi)含子,CTTCTGTCTCTATCGTGGGTA)堿基缺失和+2 bp(～154-155,AA)堿基插入(表2)。由F0代母羊與野生公羊配種獲得的2只F1代不同毛色基因編輯羊個體的基因型均為2 bp(～154-155,AT)堿基缺失。綜上所述,F1代基因編輯羊主要有4種基因型,分別是4 bp堿基缺失、5 bp,12 bp堿基插入、27 bp堿基缺失伴隨1 bp堿基插入及2 bp堿基缺失為主要編輯類型,在F1代個體中所占比例分別為42.80%、36.00%、23.33%和37.00%,上述4種主要基因型測序結(jié)果見圖2?？傮w來說,F0代的幾種主要基因型基本穩(wěn)定遺傳給F1代個體。

圖2 ASIP基因編輯基因型分析Fig.2 ASIP gene editing genotype analysis

表2 F1 代基因編輯羊基因型和毛色表型結(jié)果Table 2 The results of sheep genotypes and coat color phenotypes in F1 gene edited sheep

進一步分析發(fā)現(xiàn),4 bp堿基缺失、2 bp堿基插入、5 bp,12 bp堿基插入、2 bp堿基缺失和1 bp堿基插入導致讀碼框分別在第54位、56位、61位、65位和66位氨基酸處發(fā)生提前終止,導致產(chǎn)生一個個被截短的ASIP蛋白。而27 bp堿基缺失和21 bp堿基缺失發(fā)生在exon2和intron2的外顯子/內(nèi)含子交界處,可能會破壞ASIP轉(zhuǎn)錄的剪接(圖3)。

圖3 F1代基因編輯羊的自然突變和sgRNA/Cas9靶向修飾示意圖Fig.3 Natural mutation and Schematic diagram of targeted modification of sgRNA/Cas9 in F1 gene edited sheep

2.2 F0、F1代個體自然突變(D9和D5)的基因分型及與毛色關(guān)系研究

由圖4可知,PCR產(chǎn)物測序在鑒定編輯基因型的同時也檢測到ASIP基因外顯子2區(qū)域的2個缺失突變,9 bp堿基缺失的2個等位基因分別標記為N9(g.10-18/AGCCGCCTC)和D9(deletion);5 bp堿基缺失的2個等位基因分別命名為N5(g.100-104/AGGAA)和D5(deletion)。由于自然突變造成的D9、D5自然突變在sg RNA靶點之前,以及綿羊ASIP基因組上190 kb的串聯(lián)重復造成的ASIP基因重復,僅對PCR產(chǎn)物進行測序很難確定CRISPR/Cas9編輯的準確基因型,因此需要進一步通過T-A克隆測序驗證。

圖4 ASIP基因第2外顯子自然缺失突變測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of natural deletion mutation in exon 2 of ASIP gene

以往的研究發(fā)現(xiàn),在一些綿羊品種中D9和/或D5的自發(fā)突變頻率較高[5]。因此,通過對基因編輯羊個體進行D9和D5缺失(D為突變,N為野生型)突變的基因型分析,結(jié)果表明F0、F1代基因編輯羊都存在D5和D9缺失突變等位基因。5 bp堿基缺失突變位點內(nèi),5只F0代基因編輯羊個體中3只具有N5D5雜合基因型,2只具有N5N5純合基因型;17只F1代基因編輯羊個體中9只具有N5D5雜合基因型,8只具有N5N5純合基因型。9 bp堿基缺失突變位點內(nèi),5只F0代基因編輯羊個體中1只具有N9D9雜合基因型,4只具有N9N9純合基因型;17只F1代基因編輯羊個體中3只具有N9D9雜合基因型,14只具有N9N9純合基因型(表3)?？傮w來說,F0、F1代基因編輯羊在2個缺失突變位點上僅存在純合基因型(包括N5N5,N9N9)和雜合基因型(包括N5D5,N9D9),未檢測到2個缺失突變位點同時存在的個體。正如張恒等[6]先前報道的結(jié)果,在D9或D5中,白色美利奴羊的這2種缺失都不是純合的。

本試驗同時篩查了基因編輯羊的母本、父本及F1代本身的缺失突變基因型,發(fā)現(xiàn)父母本的缺失突變基因型發(fā)生分離且穩(wěn)定遺傳給了F1代。此外,F0代、F1代基因編輯羊和F1代母本(野生母羊)的ASIP基因第2外顯子9 bp堿基缺失突變位點內(nèi),都以純合基因型N9N9為優(yōu)勢基因型;5 bp堿基缺失突變位點內(nèi),F1代母本(野生母羊)以雜合基因型N5D5為優(yōu)勢基因型,而F0代、F1代基因編輯羊個體的純合基因型N5N5和雜合基因型N5D5數(shù)量相差不大(表3)。

表3 ASIP基因自然缺失突變在F0、F1代 基因編輯細毛羊的基因型和頻率Table 3 Genotypes and frequencies of natural deletion mutations of ASIP gene in F0 and F1 gene edited sheep

2.3 ASIP基因突變與毛色表型的相關(guān)性分析

在6只出生的羔羊中,5只羔羊鑒定出11種插入/缺失編輯形式。每只編輯羔羊至少發(fā)生2種修飾,并且發(fā)生多種修飾的編輯羔羊也呈現(xiàn)不同的毛色圖案,其中主要編輯形式4 bp堿基缺失的3只羔羊中,2只羔羊毛色圖案為周身黑色,頭頂部有白色斑點;另一只羔羊毛色為周身棕色、腹部淺色的圖案。另2只黑白斑點圖案的羔羊其編輯形式主要為2 bp堿基缺失。

由表4可知,將具有毛色表型的F0代公羊與野生型母羊配種,獲得了15只雜交F1代基因編輯羊,10只均為周身白色。其中1只周身白,耳朵處有雜毛,2只后代黑白相間,1只后代周身棕、蹄黑、頭部白,1只個體后代四肢黑色,周身白,眼窩黑色。上述有毛色表型的雜交F1代個體與F0代公羊表型相似度較高,而且F1代同窩個體也并不一定具有相同基因型和毛色。將具有毛色表型的F0代母羊與野生公羊配種,獲得2只雜交F1代基因編輯羊,均為白色(表2,圖1)。總體來看,獲得雜交F1代個體以白色為主(71%,12/17),29%(5/17)個體具有毛色表型。

表4 F1代毛色分離的性別差異Table 4 Gender differences of coat color separation in F1 generation

3 討論與結(jié)論

ASIP基因在控制哺乳動物色素轉(zhuǎn)變過程中起著十分重要的作用[13]。綿羊的ASIP基因位于13號染色體,該基因在綿羊基因組中存在多個拷貝和多個等位基因。研究發(fā)現(xiàn),不同品種綿羊ASIP基因SNP位點具有差異性:藏羊的ASIP基因外顯子2僅存在5 bp堿基缺失,只有D5N5和N5N52種基因型[14];澳大利亞美利奴羊[9]、哈薩克羊[15]外顯子2同時存在5 bp和9 bp堿基缺失。研究表明,美利奴羊的白色是由于ASIP基因的一段190 kb基因組串聯(lián)片段決定,由于拷貝數(shù)變異使有功能的ASIP編碼序列受到多個與之鄰近ITCH位點的起調(diào)控作用啟動區(qū)的作用,引起位于下游的ASIP基因表達,導致顯性白色表型,而黑色綿羊ASIP基因不表達。Gratten等[16]發(fā)現(xiàn)ASIP基因第2外顯子上5 bp堿基缺失和第4外顯子g.5172T＞A非同義突變影響了野生索厄羊的黑色被毛表型。Li等[17]的研究確定了ASIP基因是造成芬蘭羊白色與非白色毛色變異的主要候選基因。孟浩浩等[18]研究發(fā)現(xiàn)阿勒泰羊ASIP基因的5 bp堿基缺失與被毛毛色不相關(guān)(P＞0.05),而新疆細毛羊的ASIP基因的5 bp堿基缺失與被毛毛色極顯著相關(guān)(P＜0.01)。在本試驗中,基因編輯細毛羊ASIP基因外顯子2僅存在純合基因型(包括N5N5,N9N9)和雜合基因型(包括N5D5,N9D9),未檢測到2個缺失突變位點同時存在的個體。

根據(jù)之前的研究[9],所有的白色美利奴羊有多個拷貝ASIP等位基因,而所有的隱性黑色美利奴羊只有一個單拷貝等位基因。對于由CRISPR/Cas9介導的非同源末端連接,在任何靶向等位基因可能隨機發(fā)生修飾,每個等位基因可能有不同的修飾。因此,CRISPR/Cas9在多個拷貝基因中進行的修飾也具有多態(tài)性。在本試驗中,由于ASIP基因的多拷貝性,相同編輯類型的基因編輯羊也呈現(xiàn)不同毛色表型。如編輯基因型均為4 bp堿基缺失,自然突變均為D5N5雜合基因型的個體,其毛色有的呈現(xiàn)白色,有的呈現(xiàn)周身白,四肢和眼窩黑的圖案,很可能是發(fā)生編輯的位置在不同的拷貝上,不同編輯類型在不同拷貝上的位置也可能導致同一編輯類型在不同個體出現(xiàn)多種毛色表型。因此,推測可能是由于ASIP基因的自然突變、不同的編輯修飾和ASIP多拷貝基因的串聯(lián)重復三者共同作用使ASIP基因編輯羊的基因型和表型遺傳呈現(xiàn)多樣性。

隨著新型基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展,有望從細胞或個體水平深入研究毛色候選基因的不同突變類型在細胞或個體水平造成的細胞色素化或毛色差異。而利用遺傳修飾技術(shù)在綿羊中進行分子育種比傳統(tǒng)的育種方式具有更大的優(yōu)勢,可以使用多種策略直接對性狀進行快速改良,加快育種進程,必將會在家畜育種新材料創(chuàng)制和疾病防控等方面發(fā)揮重要作用,同時也為揭示人類某些重大遺傳疾病的致病機理提供理論依據(jù)。