MAL 蛋白調(diào)控肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡對肺動脈高壓的作用和機制

劉進軍，李晴晴，曾超超，，王月祥，，胡擎天，，王洪巨，吳士禮

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，安徽 蚌埠 233000；2蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠233030

肺動脈高血壓（PAH）由多種病因所致，表現(xiàn)為肺循環(huán)阻力和肺動脈壓力進行性升高，導(dǎo)致右心衰竭死亡［1,2］。PAH病理改變包括肺血管收縮、血栓形成、肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）異常增殖所致血管重塑及肺內(nèi)皮細胞功能障礙或損傷［3,4］。PAH早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)［5］，早期診斷和干預(yù)是降低患者死亡率及改善預(yù)后的關(guān)鍵。

盡管PAH的機制仍不完全清楚，但缺氧是PAH明確的觸發(fā)因素之一［6,7］。研究表明，缺氧可誘導(dǎo)肺動脈收縮造成通氣不良區(qū)域中的肺血管持續(xù)性收縮從而降低血液供應(yīng)使通氣血流得以匹配，同時缺氧具有抗凋亡效應(yīng)，促進肺血管的重塑［8］。PASMCs作為血管的重要組成部分，其正常的分化和增殖是維持血管正常功能的必須條件［9-11］。PAH早期常出現(xiàn)PASMCs異常增殖和分化異常，導(dǎo)致血管平滑肌細胞肥大、血管壁增厚、血管內(nèi)直徑變窄和血流灌注阻力增加，最終導(dǎo)致肺動脈結(jié)構(gòu)重塑［12］。因此肺動脈平滑肌細胞的增殖和凋亡失衡在肺血管重塑的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用，通過抑制PASMCs增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡可能是逆轉(zhuǎn)肺血管的重塑和治療肺動脈高壓的一個新的治療策略。

髓磷脂和淋巴細胞蛋白（MAL）是脂筏中不可或缺的膜蛋白成分，與極化上皮細胞中蛋白的頂端轉(zhuǎn)運有關(guān)［13,14］。最新研究表明，MAL除參與穩(wěn)定脂筏外，其還參與調(diào)控細胞增殖過程［15,16］。目前，MAL在PAH中的作用尚未見報道。本研究采用PAH患者血液標(biāo)本、缺氧誘導(dǎo)PASMCs增殖模型及饑餓誘導(dǎo)的凋亡模型，并通過體外干預(yù)mal基因表達，探討MAL在PAH中的作用及可能機制。

1 資料和方法

1.1 基本資料

收集2020年1月～2021年1月就診于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科診斷為肺動脈高壓患者50例，其中男性29例，女性21例，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國肺動脈高壓診斷與治療指南（2021版）》；另選本院同期健康體檢者50例，其中男性25例，女性25例。入組時排除肝腎功能不全、感染性疾病和既往冠脈介入治療史等。本實驗征得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意（批準(zhǔn)號：倫科批字[2021]第220號），所有受試者知曉此研究。

PAMSCs（北京協(xié)和細胞資源中心），MAL 蛋白ELISA試劑盒（Abbexa，英國），CCK-8試劑（北京索萊寶公司），mal慢病毒（control siRNA：TTCTCCGAAC GTGTCACGTAA；malsiRNA：GACTTGCTCTTCAT CTTTGAG TTTA，上海吉凱基因），細胞凋亡檢測試劑盒（北京碧云天公司），PCR 檢測試劑盒（TaKaRa），MAL 抗體（santa cruz biotechnology），p65及p-p65抗體（CST）。

1.2 血漿MAL水平ELISA檢測

PAH患者入院后次日清晨，空腹抽取肘靜脈血，采用含肝素鈉抗凝管收集血液并立即離心10min（3000r/min），收集血漿；收集體檢為健康者外周血，血漿收集方法同PAH患者。所有血漿凍存于-80 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。MAL蛋白水平檢測按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3 細胞培養(yǎng)

將PAMSCs接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)中，根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染的步驟將mal-siRNA和mal-LV轉(zhuǎn)染PAMSCs細胞中，將細胞分別置于含有5%CO2的常氧環(huán)境與缺氧環(huán)境（5%CO2、5%O2、90%N2）中分別培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖檢測

將4×103PAMSCs接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑，分別在常氧和缺氧環(huán)境下培養(yǎng)2 h，測定A450nm。

1.5 細胞凋亡模型建立與檢測

饑餓誘導(dǎo)細胞凋亡模型建立，缺氧環(huán)境培養(yǎng)的PAMSCs細胞更換為無血清培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，根據(jù)凋亡檢測試劑盒的操作步驟對凋亡誘導(dǎo)的PAMSCs細胞進行染色，采用流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。

1.6 熒光定量PCR檢測

提取細胞總RNA并根據(jù)反轉(zhuǎn)試劑盒操作說明書合成cDNA，采用熒光定量PCR分析PAMSCs細胞中mal基因的表達水平，以β-actin為內(nèi)參。mal引物序列如下：上游引物：5'-ACCGCTGCCCTCTTTTACC-3'，下游引物：5'-GAAGCCGTCTTGCATCGTGAT-3'；β-actin引物序列如下：上游引物：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG C-3'，下游引物：5'-CTCCTTAATGTCACGCAC GAT-3'。

1.7 免疫印跡檢測

提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，孵育一抗（MAL、p65、p-p65、β-actin抗體，稀釋比例均為1∶1000），TBST洗滌后，孵育二抗，滴加ECL發(fā)光液置于曝光儀（Bio-Rad）中曝光。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS Statistics 26.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗分析；計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗，樣本量小于5采用Fisher精確概率檢驗法，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及實驗室指標(biāo)

PAH組與HC組的一般資料包括年齡、性別、吸煙史及BMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗室檢查指標(biāo)中，PAH組HDL、LDL、SBP及DBP水平顯著高于HC組（P＜0.05），而總膽固醇水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 PAH患者血漿中MAL蛋白表達升高

PAH患者血漿中MAL蛋白的表達水平（60.040±10.445 pg/mL）顯著高于對照組（HC）（20.065±9.203 pg/mL），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 PAH患者血漿中MAL表達升高Fig.1 Plasma MAL level is elevated in PAH patients.**P＜0.01 vs HC.

2.3 PAH患者分級一般資料及實驗室指標(biāo)比較

對50例PAH患者進行超聲心動圖檢測，根據(jù)伯努利方程計算肺動脈壓并根據(jù)肺動脈壓進行分級，其中輕度組（35～45 mmHg），32例；中重度組（＞45 mmHg），18例。兩組PAH患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙史、BMI，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗室檢查指標(biāo)中，中重度組LDL、總膽固醇、SBP及DBP均值均高于輕度組（P＜0.05，表2），而HDL水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 兩組一般資料及實驗室指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of demographic data and laboratory test results between PAH patients and healthy individuals

表2 兩組患者一般資料及實驗室指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of demographic and laboratory test results between moderate to severe PAH and mild PAH groups

2.4 血漿MAL水平與PAH患者分級關(guān)系

50例PAH患者中，輕度組PAH患者（n=32），血漿MAL 水平（55.806±9.778 pg/mL）顯著高于中重度組PAH患者（n=18，67.567±6.812 pg/mL），兩組患者血漿MAL水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.515，P＜0.001）。

2.5 缺氧誘導(dǎo)PASMCs高表達MAL蛋白

體外采用缺氧誘導(dǎo)PASMCs增殖模型，結(jié)果顯示缺氧組PASMCs中MAL的mRNA及蛋白表達水平顯著高于常氧組（P＜0.05，圖2A～C）。

圖2 缺氧環(huán)境誘導(dǎo)PAMSCs高表達MALFig.2 Hypoxia induces increased expression of MAL in PAMSCs.A: Western blotting of MAL expression.B: Quantitative analysis of MAL protein expression.C: Analysis of MAL mRNA expression.*P＜0.05 vs control.

2.6 干擾mal基因的表達改變PAMSCs形態(tài)并抑制細胞增殖

缺氧可促進PAMSCs增殖，細胞狀態(tài)良好；而干擾mal后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為細胞懸浮，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡（圖3A）；CCK-8結(jié)果顯示，干擾mal可顯著抑制PAMSCs增殖（圖3B）。

圖3 干擾mal對PAMSCs形態(tài)及增殖的影響Fig.3 Effects of transfection with siRNA-mal on morphology and proliferation of PAMSCs.A: Observation of PAMSCs growth.B:A450 nm values in CCK-8 assay.*P＜0.05.

2.7 干擾MAL的表達促進缺氧環(huán)境下PASMCs的凋亡

采用無血清處理缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的PASMCs誘導(dǎo)細胞凋亡模型，結(jié)果顯示干擾mal的表達可顯著促進饑餓誘導(dǎo)的PASMCs細胞凋亡（圖4）。

圖4 干擾mal對PAMSCs凋亡的影響Fig.4 Effects of transfection with siRNA-mal on apoptosis of PAMSCs.

2.8 NF-κB/P65信號通路參與MAL蛋白調(diào)控PASMCs增殖

在缺氧環(huán)境培養(yǎng)下，PAMSCs中p-p65表達水平增高，而敲低mal可顯著抑制p-p65表達，與常氧對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5A、B）。另外，我們發(fā)現(xiàn)PAMSCs過表達mal基因同時添加NF-κB特異性抑制劑（SN50）可顯著抑制細胞增殖能力（圖5C）。

圖5 NF-κB信號通路參與MAL調(diào)控PAMSCs細胞的增殖Fig.5 NF-κB pathway is involved in MAL-mediated regulation of PAMSC proliferation.A:Western blotting of NF-κB pathway activation.B:Analysis of relative p-p65 level.C:A450 nm values of CCK-8 assay.*P＜0.05.

3 討論

PAH的關(guān)鍵病理學(xué)特征為遠端肺動脈重構(gòu)，包括肺內(nèi)皮細胞凋亡和平滑肌細胞異常增殖［17］。然而，PAH的發(fā)病機制尚不完全明確，因此目前尚無有效的預(yù)防措施［18,19］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，PAH患者血漿中MAL水平升高與疾病程度有關(guān)。體外干預(yù)MAL的表達可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAMSCs增殖能力并促進饑餓誘導(dǎo)的細胞凋亡。此外，我們證明NF-κB信號通路可能參與了MAL調(diào)控PAMSCs細胞增殖與凋亡的過程。

研究發(fā)現(xiàn)MAL蛋白除具有維持脂筏穩(wěn)定的功能外，其在調(diào)控細胞生物學(xué)功能方面具有重要作用，與極化上皮細胞中蛋白的頂端轉(zhuǎn)運有關(guān)且參與細胞周期及增殖/凋亡相關(guān)性信號通路調(diào)控［15,20］。新近研究發(fā)現(xiàn)，MAL參與調(diào)控淋巴細胞及多種腫瘤細胞的增殖和凋亡，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［21,22］。過表達MAL的轉(zhuǎn)基因小鼠會導(dǎo)致特定組織中相關(guān)細胞異常增殖，進一步會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變。在大鼠脊髓損傷模型中脊髓灰質(zhì)中的MAL表達增高，并參與脊髓損傷后修復(fù)及多種炎性細胞的增殖［23］。因此，調(diào)控機體組織中MAL的表達水平可能對疾病進程具有調(diào)控作用。最近研究表明，MAL在小鼠肺內(nèi)皮細胞（1G11）和小鼠肺血管內(nèi)皮中均有表達［24］。這些研究均提示MAL促進細胞增殖的能力在多種疾病尤其是肺部疾病中可能發(fā)揮重要的作用。但是該蛋白在PAH中的作用尚未見報道，本研究通過分析PAH患者和健康人外周血中MAL的水平，發(fā)現(xiàn)PAH血漿中MAL蛋白表達異常升高，進一步分析發(fā)現(xiàn)，疾病癥狀較重的PAH患者血漿中MAL水平顯著高于輕癥患者，提示MAL可能參與PAH的疾病進程。

鑒于MAL的生物學(xué)功能，我們推測MAL能否參與調(diào)控PAH患者肺動脈平滑肌細胞的異常增殖。研究報道，在常氧環(huán)境培養(yǎng)下，PAMSCs細胞生長緩慢，細胞內(nèi)有空泡，缺氧可顯著提高PAMSCs增殖能力，且細胞體積變小，細胞中VEGF等的表達升高，這些改變均參與了PAH 中血管重塑過程［25］。我們采用缺氧誘導(dǎo)PASMCs體外增殖模型，通過細胞形態(tài)和增殖能力證實該模型可模擬PAH下肺動脈平滑肌細胞的病理改變，與報道一致［26］。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下，PASMCs中MAL的表達顯著升高，進一步證實了，高水平MAL可能與PASMCs異常增殖有關(guān)，并參與PAH血管重塑。為了證實MAL對PASMCs的調(diào)控作用，我們采用小干擾和過表達慢病毒調(diào)控細胞中mal基因的表達，結(jié)果顯示，干擾MAL可顯著抑制細胞的增殖能力，同時可顯著促進饑餓誘導(dǎo)的細胞凋亡比例。

NF-κB是細胞內(nèi)主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號通路，在細胞行為中發(fā)揮重要作用，該通路的激活可導(dǎo)致細胞增殖失控，抑制細胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細胞過度增殖［27］。多項研究證實PAH中存在NF-κB信號通路激活，且與肺動脈平滑肌細胞的病理改變相關(guān)［28］。我們的研究顯示，干擾mal基因的表達會抑制PAMSCs中NF-κB通路的激活，表現(xiàn)為p65磷酸化水平顯著降低，NF-κB的抑制劑（SN50）處理進一步證實了NF-κB的調(diào)控作用。另外，抑制NF-κB可逆轉(zhuǎn)過表達mal對PAMSCs細胞增殖的促進作用。我們的研究結(jié)果表明，缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的MAL上調(diào)可能激活了NF-κB通路，該信號通路在維持PAMSCs過度增殖及抗凋亡中起重要作用。

我們的研究表明，PAH患者外周血中高水平MAL與疾病程度相關(guān)，可能通過促進肺動脈平滑肌細胞增殖，抑制其凋亡參與疾病進程。若干預(yù)MAL表達，有望通過調(diào)控肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡過程緩解疾病癥狀，為PAH的治療提供新的分子靶點。