心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C在急性心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷模型豬中的表達(dá)及意義

馬國(guó)鈐，楊茂東，劉演龍，張婭妮，馮亮，張毅恒，戴海龍，尹小龍

有報(bào)告指出，2002—2017年我國(guó)急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）死亡率總體呈上升態(tài)勢(shì)［1］。心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）是診斷AMI的重要指標(biāo)，但其在AMI患者發(fā)病后4～6 h才開始升高，對(duì)癥狀不典型患者可能會(huì)延遲診斷［2］。因此，迫切需要一種能夠在發(fā)病早期就確定心肌梗死及其嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。此外，目前缺乏有力的心肌缺血再灌注損傷早期生物標(biāo)志物。近年來(lái)有學(xué)者開始探尋新的心肌標(biāo)志物，包括心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（hearttype fatty acid-binding protein，H-FABP）、心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C（cardiac myosin binding protein-C，cMyBP-C）等［3-4］。目前大多數(shù)研究集中在心臟亞型的調(diào)控上，且發(fā)現(xiàn)編碼cMyBP-C的MYBPC3基因的兩種突變類型被證明可導(dǎo)致肥厚型心肌病，這表明cMyBP-C可能在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［5-6］。研究指出，cMyBP-C可以維持心臟的正常結(jié)構(gòu)和功能，有望成為早期診斷AMI的新型標(biāo)志物［7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外科開胸結(jié)扎滇南小耳豬左前降支（left anterior descending，LAD）以建立AMI、心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，并定時(shí)采血，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平，分析cMyBP-C在AMI、心肌缺血再灌注損傷模型豬中的表達(dá)及意義，以期為確定AMI及心肌缺血再灌注損傷早期生物標(biāo)志物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年6—12月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 9頭試驗(yàn)用滇南小耳豬由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供〔SYXK（滇）K2020-005〕，雌雄不限，體質(zhì)量30～40 kg。清潔環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，12 h光照/黑暗交替，溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（65±5）%。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 丙泊酚乳狀注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司），4%多聚甲醛固定液及豬cMyBP-C、cTnI酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 將試驗(yàn)用滇南小耳豬隨機(jī)分為假手術(shù)組（開胸后打開心包，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，n=1）、AMI組（開胸后打開心包，結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管，n=4）、心肌缺血再灌注損傷組（開胸后打開心包，結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管3 h后再開放，n=4）。假手術(shù)組通過(guò)穿刺耳緣靜脈注射丙泊酚乳狀注射液10 ml（20 ml∶0.2 g）或使用呼吸麻醉機(jī)連接獸用面罩使滇南小耳豬吸入異氟烷進(jìn)行全身麻醉，監(jiān)測(cè)滇南小耳豬心率及心電圖，開胸后打開心包，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，10 min后逐層縫合胸腔。AMI組術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉方法及開胸操作同假手術(shù)組，開胸后打開心包，明確血管走行后選擇LAD中遠(yuǎn)段（距LAD遠(yuǎn)端1/4～1/3處）為結(jié)扎位點(diǎn)，結(jié)扎血管；觀察30 min后取下?lián)伍_器，逐層縫合胸腔。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎部位心肌蒼白或發(fā)紺，心電圖顯示ST段持續(xù)抬高、T波高尖。心肌缺血再灌注損傷組術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉方法、開胸操作及結(jié)扎方法同AMI組，結(jié)扎血管并觀察30 min后取下?lián)伍_器，閉合胸腔，3 h后再次用撐開器打開胸腔并取下結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管的縫線，結(jié)扎血管迅速充盈，心臟腫脹減輕，顏色迅速由暗紅色恢復(fù)至正常，再次觀察30 min后取下?lián)伍_器，逐層縫合胸腔。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后符合AMI造模成功標(biāo)準(zhǔn)，取下結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管的縫線后，結(jié)扎部位心肌蒼白或發(fā)紺減輕，心電圖顯示ST段回落。

1.4.2 心率及心電圖表現(xiàn) 記錄各組滇南小耳豬手術(shù)前后心率及心電圖表現(xiàn)。

1.4.3 術(shù)后心臟組織病理切片 最后一次成功采血后，處死各組滇南小耳豬，再次開胸取下心臟，放入4%多聚甲醛固定液中固定24 h后進(jìn)行石蠟固定、包埋并切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組滇南小耳豬術(shù)后心臟組織病理切片。

1.4.4 cTnI、cMyBP-C水平檢測(cè) 分別于術(shù)前及術(shù)后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h采集假手術(shù)組、AMI組滇南小耳豬股靜脈血10 ml（假手術(shù)組打開心包10 min后開始計(jì)時(shí)取血，AMI組結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后開始計(jì)時(shí)取血），分別于術(shù)前和術(shù)后0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5、11.5、13.5、15.5、21.5、27.5 h采集心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬股靜脈血10 ml（結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后開始計(jì)時(shí)取血），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)cTnI、cMyBP-C水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 假手術(shù)組無(wú)死亡發(fā)生；AMI組1頭滇南小耳豬于結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后0.5 h死于頑固性室性心律失常；心肌缺血再灌注損傷組1頭滇南小耳豬于結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后0.5 h死于頑固性室性心律失常，1頭滇南小耳豬于開放LAD中遠(yuǎn)段血管后14 h死于緩慢性心律失常。

2.2 心率及心電圖表現(xiàn) 假手術(shù)組滇南小耳豬術(shù)前心率正常，節(jié)律規(guī)整，無(wú)ST段抬高，術(shù)后心率較術(shù)前增快；AMI組、心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后開始出現(xiàn)心率加快，T波高尖、倒置，ST段抬高等ST-T段動(dòng)態(tài)改變；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬開放LAD中遠(yuǎn)段血管后心率仍較快，ST段回落，T波倒置，見圖1。

圖1 各組滇南小耳豬手術(shù)前后心電圖檢查結(jié)果Figure 1 Electrocardiographic examination results of Diannan small ear pigs in each group before and after operation

2.3 術(shù)后心臟組織病理切片 術(shù)后心臟組織病理切片顯示，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)完整、心肌纖維條路清晰，細(xì)胞排列整齊規(guī)則、形態(tài)正常；AMI組及心肌缺血再灌注損傷組部分心肌纖維斷裂及心肌細(xì)胞核溶解消失，細(xì)胞空泡樣改變，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。

圖2 各組滇南小耳豬術(shù)后心臟組織病理切片（HE染色）Figure 2 Cardiac histopathological sections of Diannan small ear pigs in each group after operation

2.4 cTnI、cMyBP-C水平 假手術(shù)組手術(shù)前后cTnI、cMyBP-C水平無(wú)明顯變化，見表1。

表1 假手術(shù)組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平（n=1）Table 1 Levels of cTnI and cMyBP-C at different time points in Diannan small ear pigs in the Sham group

AMI組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AMI組滇南小耳豬術(shù)后6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h cTnI水平高于術(shù)前，術(shù)后1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h cMyBP-C水平高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。AMI組滇南小耳豬cTnI水平術(shù)前到術(shù)后4.0 h基本穩(wěn)定，術(shù)后6.0 h開始逐漸升高，直至術(shù)后24.0 h；AMI組滇南小耳豬cMyBP-C水平術(shù)后1.0 h開始逐漸升高，術(shù)后6.0 h達(dá)高峰，之后逐漸降低。

表2 AMI組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the AMI group

表2 AMI組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the AMI group

注：a表示與術(shù)前比較，P＜0.05

時(shí)間 cTnI（pg/ml） cMyBP-C（ng/ml）術(shù)前 650.98±15.22 13.63±0.31術(shù)后0.5 h 638.42±7.53 14.19±0.15術(shù)后1.0 h 649.97±14.63 16.54±0.28a術(shù)后2.0 h 655.50±25.63 18.99±0.24a術(shù)后3.0 h 700.19±30.58 22.52±0.53a術(shù)后4.0 h 701.20±24.03 25.86±1.10a術(shù)后6.0 h 1 173.27±55.78a 34.19±0.47a術(shù)后8.0 h 1 273.20±41.43a 29.68±0.64a術(shù)后10.0 h 1 356.67±16.80a 23.59±0.39a術(shù)后12.0 h 1 444.45±19.23a 17.07±0.59a術(shù)后18.0 h 1 586.07±35.53a 13.76±0.22術(shù)后24.0 h 1 728.70±17.59a 13.29±0.15 F值 785.185 541.905 P值 ＜0.001 ＜0.001

心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬術(shù)后5.5、6.5、7.5、9.5、11.5、13.5、15.5、21.5、27.5 h cTnI水平高于術(shù)前，術(shù)后1.0、2.0、3.0、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5、11.5 h cMyBP-C水平高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cTnI水平術(shù)前至術(shù)后4.5 h基本穩(wěn)定，術(shù)后5.5 h開始逐漸升高，術(shù)后21.5 h達(dá)高峰，術(shù)后27.5 h略有下降；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cMyBP-C水平術(shù)后1.0 h開始逐漸升高，術(shù)后4.5 h達(dá)高峰，之后逐漸下降，至術(shù)后13.5 h趨于穩(wěn)定。

表3 心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=2）Table 3 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the myocardial ischemia reperfusion injury group

表3 心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬不同時(shí)間點(diǎn)cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=2）Table 3 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the myocardial ischemia reperfusion injury group

注：a表示與術(shù)前比較，P＜0.05

時(shí)間 cTnI（pg/ml） cMyBP-C（ng/ml）術(shù)前 656.00±10.69 13.62±0.15術(shù)后0.5 h 659.52±12.05 13.68±0.37術(shù)后1.0 h 666.55±5.29 17.02±0.38a術(shù)后2.0 h 677.59±21.09 19.12±0.30a術(shù)后3.0 h 659.01±8.57 21.51±0.24a術(shù)后3.5 h 675.08±22.67 23.70±0.22a術(shù)后4.5 h 675.59±9.80 25.89±0.44a術(shù)后5.5 h 785.57±10.03a 23.56±0.29a術(shù)后6.5 h 901.58±9.69a 21.57±0.31a術(shù)后7.5 h 1 025.62±14.37a 18.98±0.28a術(shù)后9.5 h 1 161.72±10.58a 16.37±0.33a術(shù)后11.5 h 1 238.55±18.72a 14.70±0.22a術(shù)后13.5 h 1 341.50±15.97a 13.68±0.10術(shù)后15.5 h 1 402.77±19.08a 13.70±0.15術(shù)后21.5 h 1 436.92±8.53a 13.52±0.23術(shù)后27.5 h 1 406.04±11.72a 13.61±0.05 F值 1 633.985 658.259 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

AMI已成為導(dǎo)致全球人類死亡的主要疾病之一，全世界有80%以上的人死于心血管疾?。?］。AMI是由不穩(wěn)定斑塊形成的血栓突然阻塞冠狀動(dòng)脈管腔，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血壞死。由于心肌細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞，一旦發(fā)生缺血壞死就只能由纖維細(xì)胞及瘢痕組織代替壞死心肌，如果心肌細(xì)胞壞死過(guò)多，可能進(jìn)一步影響心臟收縮、射血功能，造成心功能不全。心肌缺血時(shí)，再灌注可能會(huì)再次導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，增加梗死面積，同時(shí)還會(huì)引起心律失常，因此及早判斷是否發(fā)生了心肌缺血再灌注損傷尤為重要［9-10］。由于豬的心臟在解剖結(jié)構(gòu)、冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)稀疏、缺乏心肌黃嘌呤氧化酶活性等重要方面與人類心臟高度相似［11-14］，因此本研究選擇滇南小耳豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并建立AMI及心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組滇南小耳豬手術(shù)前心率正常，節(jié)律規(guī)整，無(wú)ST段抬高，術(shù)后心率較術(shù)前增快；AMI組、心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)段血管后開始出現(xiàn)心率加快，T波高尖、倒置，ST段抬高等ST-T段動(dòng)態(tài)改變；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬開放LAD中遠(yuǎn)段血管后心率仍較快，ST段回落，T波倒置；術(shù)后心臟組織病理切片顯示，假手術(shù)組可觀察到心肌組織結(jié)構(gòu)完整、心肌纖維條路清晰，細(xì)胞排列整齊規(guī)則、形態(tài)正常；AMI組及心肌缺血再灌注損傷組均可觀察到部分心肌纖維斷裂及心肌細(xì)胞核溶解消失，細(xì)胞空泡樣改變，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；證實(shí)本研究中的AMI模型及心肌缺血再灌注損傷模型建立成功。

cTnI多年來(lái)一直被視為診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其無(wú)法對(duì)患者早期再灌注治療起到很好的指導(dǎo)作用［15］。cMyBP-C主要存在三種亞型，即快骨骼肌型、慢骨骼肌型和心臟型，其中心臟型cMyBP-C是心臟肌節(jié)的基本組成部分，因其僅存在于心肌細(xì)胞而具有心臟特異性。cMyBP-C主要依賴翻譯后修飾和蛋白間的相互作用及通過(guò)磷酸化、谷胱甘肽化和乙酰化等來(lái)調(diào)節(jié)自身的功能，提示cMyBP-C可調(diào)節(jié)心功能，其可能是治療心臟疾病的新靶點(diǎn)［7，16-21］。WATKINS等［5］、BONNE等［6］發(fā)現(xiàn)，編碼cMyBP-C的MYBPC3基因的兩種突變類型可導(dǎo)致肥厚型心肌病，且通過(guò)對(duì)cMyBP-C結(jié)構(gòu)、功能及翻譯修飾等方面研究發(fā)現(xiàn)其在作為早期診斷AMI的新型生物標(biāo)志物方面具有巨大潛力及臨床價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，AMI組滇南小耳豬術(shù)后6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h cTnI水平高于術(shù)前，術(shù)后1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h cMyBP-C水平高于術(shù)前；AMI組滇南小耳豬cTnI水平術(shù)前到術(shù)后4.0 h基本穩(wěn)定，術(shù)后6.0 h開始逐漸升高，直至術(shù)后24.0 h；AMI組滇南小耳豬cMyBP-C水平術(shù)后1.0 h開始逐漸升高，術(shù)后6.0 h達(dá)高峰，之后逐漸降低；提示發(fā)生AMI后，cMyBP-C水平升高早于cTnI，其可能更有利于AMI的早期診斷。GOVINDAN等［22］納入了16例心肌梗死患者和11例健康對(duì)照者，結(jié)果顯示，心肌梗死患者血漿cMyBP-C明顯高于健康對(duì)照者。KAIER等［23］研究顯示，cMyBP-C對(duì)AMI的診斷能力優(yōu)于高敏感性心肌肌鈣蛋白（high-sensitivity cardiac troponin，hs-cTn）（AUC分別為0.839、0.813，P＜0.01）；患者出現(xiàn)AMI癥狀2 h時(shí)的cMyBP-C診斷AMI的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值均為100%，說(shuō)明cMyBP-C對(duì)AMI的診斷價(jià)值較高，可用于AMI患者的早期診斷。KUSTER等［24］為證實(shí)cMyBP-C作為AMI的超早期生物標(biāo)志物的可行性，研究AMI模型豬血液中cMyBP-C水平變化情況，結(jié)果顯示，cMyBP-C在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后3 h開始升高，并在6 h達(dá)到峰值，而cTnI于結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后6 h開始升高，提示cMyBP-C在心臟受損后會(huì)迅速釋放到血液中，可為早期診斷AMI提供幫助。研究顯示，心臟應(yīng)激可引起cMyBP-C降解，并產(chǎn)生40 kDa的氨基末端片段，cMyBP-C不附著在肌絲上，更容易從心肌細(xì)胞釋放到循環(huán)血中，這為cMyBP-C早期診斷AMI提供了理論支持［22］。

目前心肌缺血再灌注損傷的診斷主要依賴溶栓后90 min冠狀動(dòng)脈造影，而缺乏有力的早期生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬術(shù)后5.5、6.5、7.5、9.5、11.5、13.5、15.5、21.5、27.5 h cTnI水平高于術(shù)前，術(shù)后1.0、2.0、3.0、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5、11.5 h cMyBP-C水平高于術(shù)前；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cTnI水平術(shù)前至術(shù)后4.5 h基本穩(wěn)定，術(shù)后5.5 h開始逐漸升高，術(shù)后21.5 h達(dá)高峰，術(shù)后27.5 h略有下降；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cMyBP-C水平術(shù)后1.0 h開始逐漸升高，術(shù)后4.5 h達(dá)高峰，之后逐漸下降，至術(shù)后13.5 h趨于穩(wěn)定；提示發(fā)生心肌缺血再灌注損傷后，cMyBP-C水平升高早于cTnI，其可能更有利于心肌缺血再灌注損傷的早期診斷。DECKER等［25］通過(guò)建立犬的心肌缺血再灌注損傷模型發(fā)現(xiàn)，缺血可導(dǎo)致cMyBP-C的去磷酸化，隨后的再灌注可促進(jìn)肌原纖維釋放去磷酸化的cMyBP-C，并激活細(xì)胞質(zhì)中cMyBP-C的蛋白水解。

目前cMyBP-C在人及其他動(dòng)物體內(nèi)釋放及清除的機(jī)制尚未明確，但其似乎比cTnI釋放更快、清除得也更快。發(fā)生AMI、心肌缺血再灌注損傷后，cMyBP-C水平升高早于cTnI的可能原因?yàn)?，心肌缺血狀態(tài)下導(dǎo)致cMyBP-C去磷酸化，而cMyBP-C去磷酸化后容易水解，且再灌注后會(huì)激活細(xì)胞質(zhì)中cMyBP-C的蛋白水解，從而加快cMyBP-C的釋放速度［25］。但有研究表明，在非缺血性心肌病的末期衰竭心臟中也可發(fā)現(xiàn)cMyBP-C的降解［26-27］，這提示其他形式的心臟應(yīng)激或心肌損傷也可能導(dǎo)致cMyBP-C的降解和釋放。

綜上所述，cMyBP-C水平在AMI及心肌缺血再灌注損傷早期即明顯升高，且其升高早于cTnI，其有巨大潛力成為早期診斷AMI、心肌缺血再灌注損傷的生物標(biāo)志物。但本研究樣本量過(guò)小，需要進(jìn)行更大樣本量的隊(duì)列研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：戴海龍、尹小龍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；尹小龍進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；馮亮、張毅恒進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；馬國(guó)鈐、尹小龍進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；馬國(guó)鈐撰寫論文；馬國(guó)鈐、楊茂東、劉演龍、張婭妮進(jìn)行論文的修訂。

本文無(wú)利益沖突。