崔麗霞，張志軍,2*，李會(huì)珍,2

(1.中北大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，太原 030051；2.中北大學(xué)晉中產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，山西 晉中 030600)

黑玉米又稱(chēng)紫玉米，是玉米栽培中的一個(gè)變種，具有色澤獨(dú)特、適口性好、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱(chēng)為健康食品、功能食品、益壽食品[1]。因黑玉米籽粒角質(zhì)層中花色苷含量較高，其種皮呈紫色或黑色?；ㄉ帐亲匀唤缰匾乃苄远喾宇?lèi)色素，能夠賦予植物多種多樣的顏色變化。研究表明，花色苷具有很強(qiáng)的抗氧化[2]、抗癌[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抑制炎癥[6]、保護(hù)心血管[7]等多種生理活性，可以作為安全的著色劑應(yīng)用在食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)。

黑玉米產(chǎn)品在加工過(guò)程中，其穩(wěn)定性會(huì)受到加工工藝、產(chǎn)品成分等多種因素的影響?；ㄉ盏暮繒?huì)隨著溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，色澤發(fā)生改變，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前關(guān)于黑玉米花色苷穩(wěn)定性的研究多集中在檢測(cè)不同條件下花色苷含量的變化方面，而關(guān)于黑玉米花色苷的降解動(dòng)力學(xué)報(bào)道較少，且選擇的研究范圍較小[8-9]，如只研究花色苷在pH為4.0時(shí)的降解動(dòng)力學(xué)[10]，得到的降解動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)有限。因此，降解動(dòng)力學(xué)的研究有利于黑玉米花色苷的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

本文深入探討了不同pH、溫度、光照、氧化劑(H2O2)和還原劑(Na2SO3)對(duì)黑玉米籽?；ㄉ辗€(wěn)定性的影響，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算建立了降解動(dòng)力學(xué)模型，為黑玉米花色苷的實(shí)際加工生產(chǎn)和應(yīng)用提供了有意義的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟的黑玉米籽粒：中北大學(xué)生物資源研究所提供；無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、過(guò)氧化氫、亞硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司。上述化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)、SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-95B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TDL-60B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV-8000S掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；TP310酸度計(jì) 北京時(shí)代新維測(cè)控設(shè)備有限公司；AB-8大孔樹(shù)脂 天津歐瑞生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑玉米花色苷的提取與純化

花色苷的提取與純化參考Cui等[11]的方法并略作改動(dòng)。將黑玉米籽粒用粉碎機(jī)粉碎，稱(chēng)取一定量的黑玉米粉末，按照料液比1∶20加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液(含0.1% HCl)，50 ℃超聲輔助提取30 min。提取結(jié)束后，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，50 ℃減壓濃縮，除去乙醇，得到紫紅色液體。用預(yù)處理的AB-8樹(shù)脂繼續(xù)純化此紫紅色液體，用60%的酸化乙醇洗脫，將洗脫液于50 ℃減壓濃縮除去乙醇，采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得到黑玉米籽粒花色苷的固體粉末，呈深黑色，此為下一步的實(shí)驗(yàn)材料。

續(xù) 表

續(xù) 表

1.3.2 花色苷最大吸收波長(zhǎng)掃描

將花色苷粉末用蒸餾水(含0.01% HCl)溶解，用鹽酸或氫氧化鈉溶液分別將其配制成pH為1.0～7.0的花色苷溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，記錄數(shù)據(jù)，繪制曲線(xiàn)，并觀察其顏色隨時(shí)間的變化規(guī)律。

1.3.3 不同pH黑玉米花色苷溶液的熱處理

配制1 mg/mL的花色苷溶液5份，調(diào)節(jié)溶液的pH至1.0，2.0，3.0，4.0，5.0。將上述不同pH的色素溶液分裝，在恒溫水浴鍋中于50，60，70，80，90 ℃避光條件下處理5 h，每隔1 h測(cè)定溶液中花色苷的含量。

1.3.4 光照對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的花色苷溶液2份，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，分裝于透光性良好的試管中，在避光和自然光照條件下于23 ℃處理20 d，每隔2 d取樣，分別測(cè)定溶液中花色苷的含量。

1.3.5 氧化還原劑對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的花色苷溶液，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，室溫避光條件下研究不同體積分?jǐn)?shù)的H2O2(0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)對(duì)溶液中花色苷含量的影響。

配制1 mg/mL的花色苷溶液，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，室溫避光條件下研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO3(0.0%、0.1%、0.2%、0.4%、1.0%)對(duì)溶液中花色苷含量的影響。

1.3.6 花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定溶液中花色苷的含量[12]。用pH為1.0的氯化鉀緩沖液和pH為4.5的醋酸鈉緩沖液將待測(cè)花色苷溶液稀釋至一定倍數(shù)，室溫下放置60 min，分別在510 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，根據(jù)式(1)計(jì)算吸光值A(chǔ)，根據(jù)式(2)計(jì)算花色苷含量C(mg CGE/mL)：

A=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH 4.5。

(1)

式中：A510 nm為510 nm波長(zhǎng)處的吸光值；A700 nm為700 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

(2)

式中：DF為稀釋倍數(shù)；MW為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；ε為摩爾消光系數(shù)，26900 L/(mol·cm)；L為比色皿光程，cm。

1.3.7 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

假定本實(shí)驗(yàn)中黑玉米花色苷的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)式(3)計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)[13]：

ln(C/C0)=-kt。

(3)

式中：C0為溶液的初始花色苷含量，mg/mL；C為溶液加熱t(yī)時(shí)間時(shí)的花色苷含量，mg/mL；k為降解速率，h-1；t為加熱時(shí)間，h。

當(dāng)C/C0=1/2時(shí)，花色苷殘留率為50%，降解半衰期為：

(4)

用Arrhenius方程計(jì)算花色苷降解反應(yīng)的活化能Ea：

(5)

式中：Ea為表觀活化能，kJ/mol；T為絕對(duì)溫度，K；R為氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；k0為頻率常數(shù)，h-1。

用Q10表示溫度系數(shù)：

(6)

式中：k2和k1分別表示溫度為T(mén)2和T1時(shí)的反應(yīng)速率常數(shù)。

Z表示半衰期變化10倍所需的溫度變化，℃；花色苷的遞減時(shí)間D值和Z值分別通過(guò)式(7)和式(8)計(jì)算[14]：

(7)

T=-Zlgt1/2+b。

(8)

式中：b為線(xiàn)性方程的截距。

通過(guò)式(9)、式(10)、式(11)計(jì)算焓變△H、吉布斯自由能△G和熵變△S[15]：

△H=Ea-RT。

(9)

(10)

(11)

式中：h為普朗克常數(shù)，6.6262×10-34J/s；kB為玻爾茲曼常數(shù)，1.3806×10-23J/K。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析及顯著性檢驗(yàn)，使用Origin 8.0繪制圖表并進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH下花色苷最大吸收波長(zhǎng)

對(duì)不同pH的黑玉米花色苷溶液在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。由圖1可知，不同pH的花色苷溶液吸收光譜各異，在pH 1.0～7.0范圍內(nèi)，花色苷最大吸收波長(zhǎng)依次為507，508，510，512，522，531，546 nm，溶液顏色由深紅色變成淺紅色。當(dāng)pH≥6時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)明顯發(fā)生紅移，說(shuō)明溶液中紅色的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)色的半縮醛，導(dǎo)致吸光度降低，穩(wěn)定性變差[16]。花色苷在低pH時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，在高pH時(shí)容易降解[17]，故熱降解實(shí)驗(yàn)在pH 1.0～5.0之間進(jìn)行研究。

圖1 pH為1.0～7.0時(shí)黑玉米花色苷吸收波長(zhǎng)掃描圖譜

2.2 不同pH、溫度對(duì)黑玉米花色苷殘留率的影響

不同pH下黑玉米花色苷的殘留率變化見(jiàn)圖2。

圖2 不同pH下黑玉米花色苷的殘留率

由圖2可知，經(jīng)過(guò)50 ℃熱處理5 h，各處理組的降解程度不同。pH 1.0～3.0的溶液較pH 4.0～5.0的溶液殘留率更高。其中pH 2.0的溶液在50 ℃加熱5 h后花色苷殘留率高達(dá)95.72%，而pH 5.0的溶液在相同處理?xiàng)l件下殘留率僅為77.58%，表明黑玉米花色苷在低pH條件下更穩(wěn)定，故應(yīng)在低pH下處理樣品。

由圖3可知，在相同的pH體系下，黑玉米花色苷經(jīng)過(guò)熱處理后發(fā)生了不同程度的降解，且加熱時(shí)間越長(zhǎng)、加熱溫度越高，降解越嚴(yán)重。50 ℃時(shí)花色苷降解緩慢，90 ℃時(shí)花色苷降解程度明顯高于其他溫度。50 ℃加熱5 h，pH 1.0～5.0的溶液中花色苷的殘留率分別為94.29%、95.72%、91.16%、83.99%、77.58%。90 ℃加熱5 h，pH 1.0～5.0的溶液中花色苷的殘留率僅為49.50%、51.78%、39.80%、32.02%、26.15%，說(shuō)明溫度對(duì)花色苷分子的穩(wěn)定性影響較大，在食品加工時(shí)，黑玉米花色苷的處理應(yīng)盡量在較低溫度下進(jìn)行。

圖3 黑玉米花色苷殘留率在不同pH和溫度下的變化

2.3 不同pH和溫度下黑玉米花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)研究

由式(3)計(jì)算在不同pH和溫度下黑玉米花色苷的降解速率并進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，各溫度下黑玉米花色苷的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型(R2>0.96)，與不同來(lái)源的花色苷例如鐵皮石斛[18]、藍(lán)莓[19]、黑米[20]等結(jié)果相似。

表1 黑玉米花色苷在不同pH和溫度下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由表1可知，不同pH條件下，黑玉米花色苷的熱穩(wěn)定性不同。相同的pH體系下，溫度越高，熱降解速率k越大，半衰期t1/2越小，同時(shí)伴隨著遞減時(shí)間D值也變小。溫度為50 ℃時(shí)，各pH下的半衰期依次為61.33，77.87，37.87，20.15，14.35 h，溫度升高至80 ℃時(shí)各pH下的半衰期依次為9.14，10.31，6.80，5.05，4.00 h，說(shuō)明相同pH下高溫對(duì)花色苷的破壞程度大。在pH 1.0～5.0時(shí)，反應(yīng)活化能區(qū)間為66.25～41.15 kJ/mol，pH為2.0時(shí)Ea最大，pH為5.0時(shí)Ea最小，說(shuō)明pH為2.0時(shí)的熱穩(wěn)定性最好，熱降解所需的能量最高。黑玉米花色苷在較高酸度(pH 1.0)或較低酸度(pH 5.0)下皆會(huì)加速花色苷熱降解，與馬奕瑜等和潘穎等[21]的研究結(jié)果相似。

溫度系數(shù)Q10表示溫度每升高10 ℃反應(yīng)速率增大的比例數(shù)[22]。從溫度系數(shù)Q10可以看出，其隨著溫度的升高而增大，70～80 ℃的Q10值最高，然后Q10值隨溫度升高反而降低，說(shuō)明在70～80 ℃溫度范圍內(nèi)處理黑玉米花色苷會(huì)加快色素的熱降解速率。所以在食品加工時(shí)，黑玉米花色苷應(yīng)盡量避開(kāi)溫度敏感區(qū)。pH為5.0時(shí)，Q10的變化規(guī)律與其他pH下的變化規(guī)律稍有不同，可能是因?yàn)榛ㄉ战Y(jié)構(gòu)受弱酸條件的影響而發(fā)生改變，從而降低了熱穩(wěn)定性。

反應(yīng)物和活化絡(luò)合物之間的能量差用△H表示。由表2可知，在pH相同的情況下，隨著溫度的改變，△H的變化幅度不大，表明在一定溫度范圍內(nèi)降解的能量勢(shì)壘大小與溫度無(wú)關(guān)[23]?！鱄均為正值，說(shuō)明黑玉米花色苷降解反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。降解花色苷的能量由高溫提供，高溫還促進(jìn)了活化絡(luò)合物的形成。

表2 黑玉米花色苷在不同pH和溫度下的熱力學(xué)參數(shù)

反應(yīng)是否能自發(fā)進(jìn)行可以通過(guò)吉布斯自由能△G來(lái)判斷[24]。由表2可知，△G均為正值，變化范圍為87.46～95.65 kJ/mol，說(shuō)明黑玉米花色苷的降解反應(yīng)屬于非自發(fā)反應(yīng)。

△S可以反映體系中分子的無(wú)序變化。相同pH條件下，△S受溫度影響變化范圍較小。pH為2.0時(shí)△S絕對(duì)值變化范圍為88.04～90.45 J/mol，顯著低于pH為5.0時(shí)的變化范圍151.68～152.75 J/mol，說(shuō)明黑玉米花色苷在pH為2.0時(shí)對(duì)熱處理較不敏感。自身熱力學(xué)平衡與初始系統(tǒng)之間的距離越短，則發(fā)生降解的概率越低[25]，因此當(dāng)溶液pH為2.0時(shí)，黑玉米花色苷最不易發(fā)生降解。

2.4 光照對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，pH為2.0的黑玉米花色苷在避光和自然光處理?xiàng)l件下均發(fā)生了不同程度的降解，且自然光下降解更為嚴(yán)重。在避光和自然光條件下分別處理20 d，花色苷殘留率分別為83.31%和61.92%。室溫避光和自然光條件下的降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型(R2>0.98)，降解速率分別為0.0091 d-1和0.0237 d-1，半衰期分別為76.17 d和29.25 d。文獻(xiàn)[26]考察了避光和室內(nèi)自然光條件下0～36 h內(nèi)玉米籽?；ㄉ丈氐姆€(wěn)定性，此條件下花色苷比較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)20 d的觀察測(cè)定，進(jìn)一步反映了黑玉米花色苷的降解規(guī)律。

圖4 光照對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

2.5 氧化還原劑對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，黑玉米花色苷的殘留率受不同體積分?jǐn)?shù)H2O2的影響不同。H2O2體積分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，花色苷的殘留率最小，處理50 min后，溶液的顏色變淺，接近無(wú)色，花色苷的殘留率僅為2.11%。不添加H2O2的對(duì)照在室溫條件下處理0 min與50 min花色苷殘留率沒(méi)有顯著差別(P>0.05)。花色苷的降解符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型(R2>0.98)，0.5%～2.0%體積分?jǐn)?shù)的H2O2處理?xiàng)l件下花色苷的降解速率分別為0.0219，0.0464，0.0601，0.0743 min-1，對(duì)應(yīng)的半衰期分別為31.65，14.94，11.53，9.33 min，說(shuō)明氧化劑H2O2使花色苷迅速氧化，降低了其穩(wěn)定性。

圖5 H2O2對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，隨著處理時(shí)間的增加，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO3對(duì)黑玉米花色苷均有降解作用，處理時(shí)間為1 h時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和1.0%的溶液花色苷殘留率分別為56.35%和31.09%，處理時(shí)間為2 h時(shí)，殘留率分別為48.17%和18.12%，處理時(shí)間為5 h時(shí)，殘留率分別為45.13%和16.84%，說(shuō)明還原劑處理超過(guò)2 h后，色素的殘留率變化不大。文獻(xiàn)[18-19]表明0.2%的Na2SO3可延緩花色苷的降解，本實(shí)驗(yàn)研究濃度范圍內(nèi)Na2SO3的添加均導(dǎo)致了花色苷的降解，可能是由于二者的花色苷來(lái)源不同。

圖6 Na2SO3對(duì)黑玉米花色苷穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

不同pH下黑玉米花色苷熱穩(wěn)定性不同，酸性條件下的熱穩(wěn)定性強(qiáng)于弱酸條件，pH為2.0時(shí)花色苷熱穩(wěn)定性最強(qiáng)，pH為5.0時(shí)花色苷對(duì)熱最敏感。黑玉米花色苷的熱降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，當(dāng)pH相同時(shí)，溫度越高，其降解速率越快，伴隨著半衰期和遞減時(shí)間的減少；在不同pH體系中，活化能和Z值不同，pH為2.0時(shí)活化能最大，Z值最小。通過(guò)熱力學(xué)分析得出，花色苷熱降解為吸熱非自發(fā)反應(yīng)。黑玉米花色苷對(duì)光敏感，避光條件下降解速率較慢，而自然光條件下花色苷降解速率加快。黑玉米花色苷在H2O2處理?xiàng)l件下的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。H2O2的體積分?jǐn)?shù)越大，花色苷的殘留率越小。當(dāng)用體積分?jǐn)?shù)為2.0%的H2O2處理50 min時(shí)，溶液的顏色變淺，接近無(wú)色，花色苷的殘留率僅為2.11%。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO3對(duì)花色苷的降解作用不同，其降解率隨Na2SO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大。本研究可為黑玉米籽?；ㄉ盏膶?shí)際深加工和生產(chǎn)提供指導(dǎo)。